KR20170105497A

KR20170105497A - 단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법

Info

Publication number: KR20170105497A
Application number: KR1020177017771A
Authority: KR
Inventors: 사무엘 파티니에
Original assignee: 로께뜨프레르
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2017-09-19
Also published as: FR3031987A1; FR3031987B1; MX2017008936A; CN107208124A; EP3250704A1; US20180007932A1; JP2018502592A; WO2016120548A1; BR112017014583A8; BR112017014583A2

Abstract

본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 속의 단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법에 관한 것이다: 발효에 의해 생산된 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계; 선택적으로, 바이오매스를 세척하여 사이질의 가용성 화합물을 제거하는 단계; 수 초 내지 5분 동안, 바람직하게는 5초 내지 1분 동안, 0 내지 150℃, 바람직하게는 100 내지 150℃의 온도에서 바이오매스를 열적으로 투과화하는 단계; 이렇게 해서 투과화된 바이오매스를 가용성 분획으로부터 원심분리 기법, 특히 다단계 원심분리를 이용하여 분리하는 단계; 선택적으로, 이렇게 하여 수득된 가용성 분획을 미세여과에 의해 회수 및 정화하여 그로부터 잔류 불용성 물질을 제거하는 단계; 펩티드 분리물 및 펩티드 농축물을 수득하기 위해, 침전에 의해 전술한 가용성 분획을 분리하는 단계.

Description

단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법{METHOD FOR FRACTIONATING COMPONENTS OF A BIOMASS OF PROTEIN-RICH MICROALGAE}

본 발명은 단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법에 관한 것이다.

선행기술의 제시

클로렐라는 단백질 및 기타 필수 영양소가 풍부하기 때문에, 그것들은 잠재적인 식품 공급원이라는 점은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

클로렐라는 45%의 단백질, 20%의 지방, 20%의 탄수화물, 5%의 섬유질 및 10%의 미네랄 및 비타민을 함유하고 있다고 기술되어 있다.

따라서, 미세조류 단백질은 그의 풍부함(abundance) 및 아미노산 프로파일을 감안할 때 식품에서 대두 또는 완두 단백질에 대한 대안적인 공급원으로 고려된다.

이러한 단백질 분획은 화장품 산업, 또는 심지어 제약 산업에서 기능성 제제로서도 활용될 수 있다.

그러나, 식품 응용에 있어서 미세조류 단백질 개발은 현저하지 않았는데, 상기 분획에 바람직하지 않은 화합물(예를 들어 클로로필)이 존재하여 이를 함유하는 식품 조성물의 색상, 풍미 및 구조에 바람직하지 않은 변화를 초래하기 때문이다.

따라서, 식품 응용에 있어서 이의 잠재력을 증가시키고 이의 상업적 가치 또한 증가시키기 위해서는 이들 단백질이 이의 분자 구조에 영향을 주지 않으면서 미세조류로부터 추출되어야 한다.

그러므로, "연성" 추출 기법이 높은 용해도 및 양호한 기술적 및 기능적 특성을 갖는 단백질을 단리하는 데 필요할 것이지만, 미세조류, 특히 녹색 미세조류 세포벽의 견고성은 근본적으로 이에 저촉되는데, 이러한 견고함이 추출 및 세포 내 단백질의 온전성을 방해하기 때문이다.

따라서, 이와 반대로, 통상적으로 "경성의" 물리적 또는 화학적 조건이 미세조류 세포벽을 파괴하는데 이용된다.

따라서, 다수의 연구는 알칼리 용해 유형, 유기 용매에 의한 추출 유형 또는 고압 균질화 유형의 기술을 제안한다.

그러나, 이러한 기술적 선택에서, 단백질의 변성은 골칫거리로 여겨지지 않았는데, 이들 방법의 대부분이 분석의 목적으로 개발되었거나 단백질 가수분해물을 생성하는 효소적 분해를 위한 기질을 제공하고자 한 것이기 때문이다.

그러나, 세포 성분의 온전성을 보존하는 효과적인 붕괴 방법은 수율뿐만 아니라 추출된 생성물의 품질도 최대화해야 한다.

다시 말하자면, 세포벽의 최적화된 붕괴 방법은 예를 들어,

- 표적화된 생성물의 화학적 오염,

- 너무 높은 파괴 에너지의 사용

을 피해야 한다. 너무 높은 파괴 에너지를 사용하는 것은 관심 있는 세포 내 분자의 비가역적인 변성 또는 분해를 유발할 수 있다.

더욱이, 대규모 생산을 위해서는 이러한 규모로 수송 가능한 공정을 선택하는 것이 중요하다.

마지막으로, 이러한 세포 붕괴 단계의 도입은 용이해야 하며, 이후의 방법/처리 단계들에 부정적인 영향을 주지 않아야 한다.

이러한 모든 제한들은 붕괴 방법의 효율에 영향을 주며, 마찬가지로 이의 에너지 소모에 영향을 준다.

이 점이 바로 비드 밀(bead mill) 기술이 바람직한 이유인데, 비드 밀 기술은 세포 내 단백질을 그의 고유한 형태로 방출시키는 데 효율적이라고 간주되기 때문이다.

비드 밀에서, 세포는 작은 구형 입자와 함께 현탁액으로 교반된다. 세포의 파괴는 전단력, 비드 간의 밀링 및 비드와의 충돌에 의해 유발된다.

적절한 비드 밀에 대한 기재는, 예를 들면, 특허 US 5 330 913에 제공된다. 이들 비드는 세포를 파괴하여 세포 내용물을 방출시킨다. 그러면 원래의 세포보다 더 작은 크기의 입자로 이루어진 현탁액이 "수중유적형" 에멀젼의 형태로 수득된다.

이 에멀젼은 일반적으로 분무화되고 물은 제거되어, 세포 잔해, 사이질(interstitial) 가용성 화합물 및 오일로 구성된 이질성 혼합물을 함유하는 건조 분말이 남게 된다.

이러한 세포 붕괴 기술의 사용에서 해결되어야 하는 난제는 (막 잔해, 당류, 섬유질 및 지방을 제외하고) 오로지 세포 내 내용물만을 단리하는 것과 특히, 단백질 로드의 품질을 보존하는 것이다.

테트라셀미스 종(Tetraselmis sp) 속의 미세조류의 경우에, Anja Schwenzfeier 등(Bioresource Technology, 2011, 102, 9121 - 9127)은 다음 단계를 포함하는, 오염물질(예를 들어, 착색 물질)이 제거된 채로 단리된 단백질의 아미노그램(aminogram)의 품질 및 가용성을 보증하는 방법을 제안했다:

- 비드 밀에 의한 세포 붕괴 단계,

- 밀링된 미세조류 현탁액의 원심분리 단계,

- 상층액의 투석 단계,

- 이온-교환 수지 통과 단계,

- 용출액의 투석 단계,

- 탈색 단계, 그 다음으로

- 세척 및 재현탁 단계.

그러나, 이러한 (24 g의 바이오매스를 처리하기 위한) 실험실 방법은 산업적 규모까지 확대될 수 없으며, 여기서 비드 밀 방법은 오히려 완전한 바이오매스의 회수를 위해 사용된다.

이러한 기술을 미세조류의 세포 내 내용물을 방출시키기 위해 완전히 바꾸는 대안적인 해결책, 예컨대, 펄스장 전기적 처리가 제안된 바 있다.

생물학적 세포를 고강도의 펄스 전기장에 노출시켜 세포막의 구조를 변경할 수 있기 때문이다.

외부 전기장은 막의 충전을 유발한다. 충분한 막관통 전압(0.5 ~ 1 V)에서, 인지질의 분자 배열은 바뀌며, 이는 막이 그 장벽 역할을 상실하도록 하여 투과성이 되게 한다. 사용된 조건에 따라, 이러한 막 투과화는 가역적이거나 비가역적일 수 있다.

그러나, 세포 내 화합물의 효율적인 추출을 위해, 이러한 기술을 사용하는 당업자는 막에 비가역적인 투과화를 유발하여 그의 붕괴를 가져오는 것에 여전히 신중하다.

이러한 막의 파열은 그 후 세포 내용물의 방출을 촉진하며, 보충적인 용매 추출 기법을 사용하는 경우, 용매가 세포 내로 침투하는 것도 용이하게 한다.

이 기법은 전도유망하긴 하지만, 불행히도 1 내지 200 m³의 반응조에서 생산된 바이오매스를 처리하기 위한 산업적 규모까지는 외삽될 수 없다.

그 결과, 세포를 붕괴시키거나 그의 성분들의 품질을 손상시키지 않고 세포 내 내용물을 방출시킬 수 있는 미세조류 세포를 약화시키는 기법을 제공할 필요가 여전히 미충족된 채로 남아 있다.

본 발명의 대상

출원인 회사는 미세조류 세포의 열 투과화(thermal permeabilization) 방법을 원심분리 단계 및 배지 성질 변경에 의한 침전 단계와 조합하여 이러한 필요가 충족될 수 있음을 발견했다.

따라서, 출원인 회사는 세포 붕괴를 위한 열적 방법이, 기계적 붕괴로 유발된 전단력과 마찬가지로, 미세조류로부터 유래하는 생성물을 분해하거나 변성시키기 위해 대신 사용되는 기술이라고 말하는 기술적 편견(Richmond, 1986, Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, Inc - Molina Grima et al., 2003, Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics, Biotechnol. Adv. 20:491-515)에 반대한다.

또한, 출원인 회사가 개발한 열 처리가 세포벽의 붕괴를 초래하지 않는다는 점을 감안하면, 일단 세포 내 구간으로부터 방출된 경우, 펩티드 분리물의 회수는 용이하게 수행된다.

마지막으로, 본 발명의 방법은 무엇보다도 잔류 바이오매스뿐만 아니라, 펩티드 분리물의 부산물도 회수하고 개량할 수 있게 한다.

본 발명의 상세한 설명

따라서, 본 발명은

- 세포막의 열 투과화 방법을 수행한 다음,

- 이렇게 하여 투과화된 잔류 바이오매스 및 그 부산물의 회수 및 개량에 의해,

단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법에 관한 것이다.

더 정확하게는, 본 발명에 따른 방법은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 속의 단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법이다:

- 발효에 의해 생산된 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계,

- 선택적으로, 바이오매스를 세척하여 사이질의 가용성 화합물을 제거하는 단계,

- 약 10초 내지 약 5분 동안, 바람직하게는 약 5초 내지 약 1분 동안, 50 내지 150℃, 바람직하게는 약 80 내지 150℃의 온도에서의 바이오매스의 열 투과화 단계,

- 이렇게 해서 투과화된 바이오매스와 가용성 분획의 원심분리 기법, 더욱 구체적으로는 다단계 원심분리에 의한 분리 단계,

- 선택적으로, 이런 방식으로 수득된 가용성 분획을 미세여과에 의해 회수 및 정화하여 그로부터 잔류 불용성 물질을 제거하는 단계,

- 침전에 의해 이전의 가용성 분획을 정제하여 펩티드 분리물 및 펩티드 농축물을 수득하는 단계.

용어 "대략"은 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 10%, 바람직하게는 이의 플러스 또는 마이너스 5%를 포함하는 값의 범위를 의미하고자 한 것이다. 예를 들어, "대략 10"은 9 내지 11, 바람직하게는 9.5 내지 10.5를 의미한다.

미세조류의 선택

바람직하게는, 클로렐라 속의 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 더욱 구체적으로는 클로렐라 프로토테코이데스이다.

일 특정 구현예에서, 균주는 클로렐라 프로토테코이데스(균주 UTEX 250 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - 미국)이다. 또 다른 구현예에서, 이러한 균주는 균주 CCAP211/8D(The Culture Collection of Algae and Protozoa, 영국 스코틀랜드)이다.

발효 조건의 선택

종속 영양 조건 하에서 및 빛의 부재 하에서의 배양은 통상적으로 건조 세포의 중량 기준 45% 내지 70%의 (질소 함량 N × 6.25를 측정하여 평가된) 단백질 함량을 가지는 클로렐라 바이오매스의 생산을 가져온다.

예를 들어, 60%를 초과하는, N.6.25로 나타낸, 단백질 함량을 가지는, 단백질이 강화된 미세조류의 바이오매스로 시작하는 것이 바람직하다. 이 경우, 출원인 회사는

- 질소가 제한된 제1의 발효 단계로서, 이때, pH 조절은 NH₃/KOH 혼합물로 수행되고, 그 다음으로

- NH₃ 단독으로 수행된 pH 조절에 의해 이러한 질소 제한을 제거하는 제2 단계

를 포함하는, 개발된 신규한 방법을 이용할 것을 권한다.

따라서, 이러한 작동 조건은 60%를 초과하는 N.6.25, 약 65%의 N.6.25의 단백질 함량 및 낮은 착색도를 나타내는 바이오매스를 신속하게 수득할 수 있게 한다. 수율은 고체 중량 기준 45 내지 50%이고, 바이오매스의 최종 농도는 80 내지 120 g/l이다.

바이오매스의 처리

그런 다음, 바이오매스를 고체-액체 분리에 의해, 전면 또는 접선 여과에 의해, 또는 당업자에게 추가적으로 공지된 임의의 수단에 의해, 수집한다.

선택적으로, 출원인 회사는 따라서 일련의 (원심분리에 의한) 바이오매스의 농축/희석에 의해 사이질의 가용성 화합물을 제거하는 방식으로 바이오매스를 세척할 것을 권한다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "사이질의 가용성 화합물"은 발효 배지의 모든 가용성 유기 오염물질, 예를 들어, 염, 잔류 글루코스, 2 또는 3의 중합도(또는 DP)를 갖는 올리고당, 또는 펩티드와 같은 수용성 화합물을 의미한다.

사이질의 가용성 화합물이 이러한 방식으로 정제된 이러한 바이오매스는 다음으로 중량 기준 15 내지 30%의 고체 함량, 바람직하게는 20 내지 30%의 고체 함량까지 우선적으로 조정된다.

바이오매스의 열 투과화

열 처리는 약 10초 내지 약 5분 동안, 바람직하게는 약 5초 내지 약 5분 동안, 바람직하게는 약 10초 내지 약 1분 동안, 50 내지 150℃, 바람직하게는 약 80 내지 150℃의 온도에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 열 처리는 약 10초 동안 약 140℃의 온도에서 수행된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 열 처리는 약 1분 동안 약 85℃의 온도에서 수행된다.

이러한 처리는 세포 내 성분들이 반응 배지 내로 확산할 수 있게 한다.

마지막으로, 이들 단계를 마칠 때 바이오매스는 바람직하게는 40℃ 미만의 온도까지 냉각되거나, 심지어 대략 4℃의 온도에서 냉장된다.

특정 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 출원인 회사는 이들 작동 조건 하에서 수행된 열 처리가 이와 같이 세포 내 구간의, 또는 심지어 세포 외 기질의 가용성 성분들의 자연 방출을 허용하는 막 약화 공정으로 작용할 수 있다고 생각한다.

이온성 물질 이외에도, 탄수화물(주로 DP1과 DP2), 펩티드 및 폴리펩티드와 같은 유기 물질들이 세포 밖으로 배출된다.

역으로, 지질과 소수성 유기 화합물은 세포 내에 남아 있어, 이러한 세포들이 투과화되며, 용해되거나 파괴되지 않음을 명백히 보여준다.

따라서, 본 발명에 따른 방법은 에멀젼 형성은 유발하지 않고, 오히려 수성 현탁액의 형성을 초래한다.

투과화된 막을 통한 모든 이러한 가용성 물질의 방출은 투석 유형의 자유 확산의 공정과 유사하다.

결과적으로, 막을 투과화하는 열 처리 후 충분한 확산을 가능하게 하기 위해서는 지체 시간이 필수적일 수 있다.

문헌에서, 효모로부터 단백질을 추출하기 위한 효모 막의 펄스장 투과화 공정은 4시간 내지 6시간을 요구한다(Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84).

본 발명에 따르면, 약 5초 내지 약 5분의 훨씬 더 짧은 반응시간이 이용된다.

투과화된 바이오매스와 가용성 분획의 분리

그런 다음, 이렇게 하여 투과화된 바이오매스와 가용성 분획의 분리를 원심분리 기법, 더 구체적으로는 다단계 원심분리에 의해 수행한다.

필요한 경우, 이렇게 하여 수득된 가용성 분획은 잔류 불용성 물질을 제거하기 위한 미세여과에 의해 정화될 수 있고, 그 고체 함량에 따라, 증발 또는 당업자에게 추가적으로 공지된 임의의 기타 수단에 의해, 뒤에 이어지는 정제 전에 농축이 이루어질 수 있다.

그에 따른 가용성 분획은 최종적으로는 필수적으로 단백질(50 내지 80% w/w) 및 탄수화물(5 내지 25% w/w)로 구성된다.

잔류 바이오매스의 개량

가용성 물질을 분리한 잔류 바이오매스는 영양가 프로파일이 재보정되는 하나의 전체의 성분으로서 개량될 수 있다.

특히, 단백질은 가용성 물질 내에 펩티드의 형태로 부분적으로 반출되기 때문에 단백질 함량이 감소되며, 이것은 탄수화물 및 지질 분획에 유리하게 균형을 다시 유지하게 한다.

또한, 원심분리에 의한 분리 후의 잔류 바이오매스는 우선적으로 기계적 밀링에 의해 (원하는 실용적인 성질에 따라) "밀링"될 수 있다.

통상적으로, 바이오매스는 안정화되고(pH가 재조정됨(약 7), 항산화제 첨가 등), 그 후, 분무화에 의한 건조 전에 열 처리된다(세균 방제의 목적을 위한 저온살균). 증발에 의한 농축 단계가 열 처리에 선행할 수 있다(건조와 결합된 최적화).

침전에 의한 단백질 분리물의 정제

본 발명의 방법은 여기에서, 배지의 성질을 변경하여 침전에 의해 관심 있는 펩티드의 분리를 초래한다.

따라서, 출원인 회사는 다음과 같은 공정을 권고한다:

- 배지의 물리화학적 성질을 변경하여 펩티드 분획의 전부 또는 일부의 침전을 촉진하는 것.

이전 단계에서 기술된 바와 같이 수득된 미정제 가용성 물질의 냉각은 가용성 펩티드 일부의 침전 현상을 촉발한다.

침전은 더 높은 분자량에 대해 상당히 선택적임이 관찰된다. 냉각 온도는 10℃ 미만, 바람직하게는 4℃ 미만이다.

일부 작동 조건은 이러한 현상을 촉진할 수 있게 한다: 온도 이외에, pH는 2.5 내지 6.5이어야 하고, 바람직하게는 pHi에 가깝게, 즉, 3 내지 5이어야 한다.

유사하게, 배지의 이온 강도를 침전을 촉진하도록 조정할 수 있다. 따라서, 이온 강도를 상당히 감소시킴으로써, "염용" 현상을 약화시킬 수 있고, 따라서, 단백질의 용해도가 (용매화 층을 감소시킴으로써) 감소할 수 있다.

그러므로, 침전 전에 광물질제거 조작이 추가될 수 있다. 이것은 양이온성 및 음이온성 수지, 투석, 여과, 또는 당업자에게 추가적으로 공지된 임의의 수단에 의해 이루어진다.

역으로, 이온 강도를 상당히 증가시킴으로써, "염석" 현상을 통해 이용 가능한 물은 감소하며, 이렇게 하여 단백질이 침전하는 경향을 나타낸다. 이 방법은 추출된 단백질 분리물에 대해 현저한 광물질제거가 필수적일 것이므로 바람직하지 않다.

용매화 층 조절과 동일한 관점에서, 배지의 극성을 에탄올과 같은 용매를 첨가하여 (배지의 탈수와 함께) 감소시킬 수 있으며, 이는 단백질 분획의 용해도를 상당히 감소시켜 이의 더욱 정량적인 침전을 발생시킬 수 있을 것이다.

- 침전된 분획을 회수하는 것. 이때, 침전된 분획은 그 후 건조 전에 선택적으로 농축된다.

침전된 분획의 분리는 단순한 기울여 따르기 및 무거운 상의 회수에 의해 또는 선택적으로 최적의 온도 조건 하에서의 원심분리에 의해 이루어진다.

pH는 선택적으로 건조 전에 재조정될 수 있다.

건조는 원자화, 동결 건조 또는 당업자에게 추가적으로 공지된 임의의 기타 수단에 의해 이루어진다.

건조 전에, 증발에 의한 농축 단계를 도입하는 것은 에너지 관점에서 조작을 최적화하는 것을 가능하게 할 수 있다. 에탄올과 같은 용매가 재활용에 이용될 경우 이것이 특히 정당화될 수 있다.

이러한 접근법을 활용하면 잔류 염과 당류로부터 높은 함량의 펩티드 및 폴리펩티드가 있는 분획의 정제가 가능하게 된다.

그러면, 가용성 단백질 분리물은 중량 기준 90%를 초과하여 얻어진다.

잔류물의 개량

이렇게 하여 분리물이 추출되었을 때, 가용성 상(분리 후 가벼운 상)은 (그의 잔류 단백질 함량에 따라) 단백질 농축물과 같은 것으로 개량될 수 있거나, 그것으로부터 잔류 펩티드를 추출하기 위한 새로운 정제 절차를 거칠 수 있다.

침전이 부분적(예컨대, 수성 상에서 부분적인 침전)일 때, 실험 조건에 따라 이것은 특히 정당화될 수 있다. 이 경우에, 단백질 분리물에 대하여 기술된 바와 동일한 방식으로 물리화학적 환경을 변경하여, 일반적으로 더 낮은 분자량의 (더욱 가용성인) 잔류 펩티드를 추출할 수 있다.

예를 들어, 에탄올과 같은 용매의 도입이 이 단계에서 수행되어, 그 용해도를 크게 감소시킴으로써 이러한 잔류 단백질 분획의 침전을 발생시킬 수 있다.

잔류물이 사전에 탈수된다면, 용매의 작용은 더욱더 효율적일 것이다. 이것은 증발에 의해 특정 고형 함량까지 또는 (예를 들어, 분무화에 의해) 완전한 건조까지 수행될 수 있다.

침전 후, 이 분획의 pH는 선택적으로 재조정될 수 있고, 그 후 (용매의 재활용을 가능하게 할 수 있는) 증발에 의한 농축이 선택적으로, 분무화, 동결 건조에 의하거나 당업자에게 추가적으로 공지된 임의의 수단에 의한 건조 전에 수행된다.

본 발명은 예시적이고 비 제한적인 것으로 의도된 다음의 실시예로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다.

실시예

실시예 1. : 높은 단백질 함량을 나타내는 클로렐라 프로토테코이데스의 생산

사용된 균주는 클로렐라 프로토테코이데스(균주 CCAP211/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, 영국 스코틀랜드)이다.

전배양:

- 500 mL 삼각 플라스크 내의 배지 150 mL;

- 배지의 조성: 40 g/L의 글루코스 + 10 g/L의 효모 추출물.

배양은 다음 조건 하에서 수행된다:

- 시간: 72시간;

- 온도: 28℃;

- 진탕: 110 rpm(인포스 멀티트론 인큐베이터(Infors Multitron Incubator)).

배치 모드 후 유가 배치 모드로 배양

제조 및 초기 배치 배지

- 400 g/l(41%)의 KOH / 20% v/v(59%)의 NH3의 혼합물을 제조하고 여과한다;

- 121℃/20분에서 20 L 발효조를 멸균한다;

- 500 mL들이 삼각 플라스크 2개의 전배양물(15의 OD_{600 nm})로 접종한다;

- 20% v/v NH₃로 pH 4.5까지 조정한다;

- 300 rpm의 개시 진탕 속도;

- 에어레이션: 20 L/분의 공기;

- 30%로 pO₂ 조절;

공급 재료

- 글루코스: 500 g/L

- 황산암모늄: 5 g/L

- 인산이암모늄: 20 g/L

- 인산: 16 g/L

- 황산마그네슘 7수화물: 12 g/L

- 황산철: 170 mg/L

- 질산칼슘: 610 mg/L

- 미량원소 용액: 45 mL/L

- 비타민 용액: 4.5 mL/L

암모늄 염, 마그네슘 염 및 인산의 공급 원료는 발효 배지의 염 함량을 제한하기 위하여 개발되었으며, 최종 탈색된 바이오매스의 N.6.25 함량을 유지하도록 최적화되었음을 주목하는 것이 중요하다.

발효 절차

- 접종 전에 20 g/L의 당량을 제공한다

- 글루코스 농도가 0 g/L일 때, 지수 프로파일(μ = 0.07 h^-1)로 공급을 개시한다

- 41% KOH / 59% NH₃ 혼합물로 pH를 5.2로 조절한다

- 미세조류가 2 kg의 글루코스를 소비했을 때, 시스템을 NH₃ 단독으로 pH 조절하는 것으로 전환한다

결과:

이러한 발효 절차는 N.6.25로 나타낸, 65%를 초과하는 단백질을 가진 바이오매스를 수득할 수 있게 한다.

실시예 2. 클로렐라 프로토테코이데스 바이오매스의 열 투과화 및 침전에 의한 가용성 분획의 회수

실시예 1에 따라 생산된 바이오매스를 80% 순도(총 고체 함량에 대한 바이오매스의 고체 함량의 비율로 정의된 순도)로, 105 g/L의 세포 고체 함량으로 수확한다.

그런 다음, 그것을

- 세척하고 인라인 희석[1:1](V_waterV_must)으로 농축시키고, 알파 라발(Alfa Laval) FEUX 510 플레이트 원심분리기로 원심분리하고, 220 g/L의 고체 함량 및 93%의 순도(총 고체 함량에 대한 바이오매스의 고체 함량의 비율로 정의된 순도)를 얻은 다음,

- pH를 수산화칼륨으로 7까지 조정하고,

- 간접적인 증기 플레이트 열 교환기 상에서 바이오매스를 85℃까지 가온하고, 1분 동안 85℃를 유지한 다음, 글리콜-물 플레이트 열 교환기 상에서 4℃까지 냉각시키는 HTST로 열 처리.

이러한 열 처리는 바이오매스의 부분 용해를 제한하도록 중간 규모에서 수행되며, 바이오매스의 순도는 68%까지 감소한다.

정의상, 세포 외 배지 내의 가용성 물질의 염석은 총 고체 함량에 대한 세포 고체의 분획의 감소를 초래한다.

이 단계에서, 바이오매스의 조성은 다음과 같다:

- 총 아미노산: 48.73%

- 총 당류: 27.02%

- 총 지방산: 15.10%

- 회분 및 기타: 9.15%

미정제 가용성 물질의 분리

바이오매스의 열 투과화에 의한 염석으로부터 유래된 가용성 물질의 분리를 원심분리에 의해 수행한다.

분리 수율 및 품질을 최적화하기 위해, 제2 단계로부터 제1 단계로의 상층액 재활용과 함께 (두 개의 알파 라발 FEUX 510 원심분리기가 직렬로 연결된 배치의) 제2 단계에서 인라인으로 가벼운 희석[0.5:1](V_waterV_must)을 수행한다. 따라서, 제1 단계로부터의 상층액을 회수하고, 정화된 가용성 물질을 농축한다.

이러한 "미정제" 가용성 물질은 다음의 조성을 갖는다:

- 총 아미노산: 77.3%

- 총 당류: 17.6%

- 회분 및 기타: 5.1%

단백질 분리물의 정제

분리 후 취한 가용성 물질의 샘플을 단백질 분리물 수득을 향한 정제에 이용한다.

펩티드 분획을 선택적으로 침전시키기 위해, 고체 함량이 9.5%인 미정제 가용성 물질 750 g을 재킷 반응기에 교반하면서 넣는다.

미정제 가용성 물질의 pH를 인산으로 4.5까지 조정한다.

교반을 중단한 후, 온도를 4℃까지 낮춘다.

이러한 조건을 8시간 동안 유지한다.

이렇게 하여 고분자량의 펩티드가 강화된 무거운 상을 기울여 따르기가 이루어진다.

그런 다음, 이러한 무거운 상을 분별깔때기에서 단순 상분리로 추출하며, 질량 수율은 28%이고, 37.2%의 고체 함량을 나타낸다.

이러한 추출물을 97%의 고체 함량까지 동결 건조한다.

이러한 분리물의 조성은 다음과 같다:

- 총 아미노산: 95.9%

- 총 당류: 2.44%

- 회분 및 기타: 1.66%

단백질 분리물에서 아미노산 프로파일 분포는 다음과 같다:

- 글루탐산: 49.9%

- 아르기닌: 47.21%

- 기타: 2.89%

따라서 이러한 분리물은 (총 아미노산의 분포 분석을 기초하여) 필수적으로 아르기닌 및 글루탐산에 의해 형성된 대략 95%의 풍부도를 특징으로 한다.

잔류물의 정제

침전 및 분리물의 분리 후, 가벼운 상은 정제를 거쳐 침전하지 않은 (낮은 분자량의) 단백질 분획을 농축시킬 수 있다.

분리 후(질량 수율 72%), 처음에는 8.9%의 고체 함량을 가진 이 상은 증발(부치(Buchi) R-215 실험실 로타베이퍼(rotavapor)에서 15 mbar, -43℃)에 의해 45.4%의 고체 함량까지 농축되어, 나중에 에탄올의 작용을 촉진하기 위하여 배지를 부분적으로 탈수시킨다.

이 단계에서, 농축물은 다음의 조성을 갖는다:

- 총 아미노산: 68.5%

- 총 당류: 23.46%

- 회분 및 기타: 8.04%

단백질 분획을 침전시키기 위해, 에탄올 첨가에 의한 탈수가 수행된다.

(농축물 부피당) 에탄올 부피가 첨가되고, 배지에서의 가용성 상실로부터 기인하는 단백질 응집이 사실상 즉각적으로 일어난다.

4000g에서 10분 동안 원심분리(베크만 쿨터 아반티(Beckman Coulter Avanti) J-20 XP)에 의해 펠릿을 회수한다.

그런 다음, 그것을 24시간 동안 진공 오븐에서 92.3%의 고체 함량까지 건조시킨다.

이렇게 해서 수득된 추출물의 조성은 아래에 자세히 나와 있다:

- 총 아미노산: 73.19%

- 총 당류: 20.45%

- 회분 및 기타: 6.36%

그런 다음, 이 추출물을 단백질 농축물로서 개량할 수 있다.

실시예 3. 용해 후 잔류 바이오매스의 처리

실시예 2에서 얻어진 단백질이 풍부한 미정제 불용성 물질을 잔류 바이오매스로부터 분리하는데, 이러한 잔류 바이오매스는 그것을 개량할 수 있는 공정으로 처리될 수 있다.

22%의 세포 고체 함량으로 추출된 바이오매스를 수평 비드 밀 모듈(네취(Netzsch) LME 500 - 0.6 mm 규산지르코늄 비드)에서 85%의 밀링도까지 밀링한다.

그런 다음, 밀링된 세포 물질을 50% 수산화칼륨으로 pH 7까지 조정한다.

증발이 이루어지는, 온도가 40℃로 유지되는 진공 하에서, 플래셔가 들어오기 전에 온도가 75℃로 조정되는 루프를 연속적으로 공급하여 SPX 강제 순환 증발기에서 농축을 수행한다.

농축된 바이오매스는 SPX UHT 모듈을 향해 플래셔로부터 계속하여 인출되어, 70℃에서의 사전 가열에 이어, 140℃에서 약 10초의 규모로 증기의 직접적인 주입 후, 진공 하에서 40℃까지의 순간 냉각으로 열 처리를 수행한다.

그런 다음, 바이오매스를 GEA 필터매트(Filtermat) FMD 200 분무기로 95%의 고체 함량까지 분무화한다.

이렇게 해서 얻어진 바이오매스는 다음의 조성을 갖는다:

- 총 아미노산: 27.1%

- 총 지방산: 27.1%

- 총 당류: 35.8%

- 회분 및 기타: 10%

이렇게 얻어진 바이오매스는 탄수화물, 단백질 및 지질 분획에서 평형화된 영양 프로파일을 갖는다는 장점이 있다. 아래 제시된 바와 같이, 아미노산 프로파일은 아르기닌과 글루탐산이 풍부한 가용성 분획의 선택적인 상류 제거에 의해 더 재평형화된다.

바이오매스 내의 아미노산의 분포는 다음과 같다:

- 아스파르트산: 6.05

- 트레오닌: 3.91%

- 세린: 3.56%

- 글루탐산: 23.84%

- 글리신: 3.56%

- 알라닌: 5.69%

- 발린: 4.27%

- 이소류신: 2.31%

- 류신: 5.87%

- 티로신: 2.49%

- 페닐알라닌: 3.20%

- 라이신: 3.74%

- 히스티딘: 1.60%

- 아르기닌: 25.98%

- 프롤린: 3.91%

Claims

다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로렐라 속의 단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스의 성분들을 분별하는 방법:
- 발효에 의해 생산된 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계,
- 선택적으로, 바이오매스를 세척하여 사이질의 가용성 화합물을 제거하는 단계,
- 약 10초 내지 약 5분 동안, 바람직하게는 약 5초 내지 약 1분 동안, 50 내지 150℃, 바람직하게는 약 80 내지 150℃의 온도에서의 바이오매스의 열 투과화 단계,
- 이렇게 해서 투과화된 바이오매스와 가용성 분획의 원심분리 기법, 더욱 구체적으로는 다단계 원심분리에 의한 분리 단계,
- 선택적으로, 이런 방식으로 수득된 가용성 분획을 미세여과에 의해 회수 및 정화하여 그로부터 잔류 불용성 물질을 제거하는 단계,
- 침전에 의해 이전의 가용성 분획을 정제하여 펩티드 분리물 및 펩티드 농축물을 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 클로렐라 속의 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 더욱 구체적으로는 클로렐라 프로토테코이데스인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 풍부한 미세조류의 바이오매스는
- 질소가 결핍된 제1의 발효 단계로서, 이때, pH 조절은 NH₃/KOH 혼합물로 수행되고, 그 다음으로
- NH₃ 단독으로 수행된 pH 조절에 의해 이러한 질소 결핍을 제거하는 제2 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5초 내지 약 5분 동안, 바람직하게는 약 10초 내지 약 1분 동안, 약 80 내지 150℃의 온도의 열 처리를 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 열 처리는 약 1분 동안 약 85℃의 온도에서 또는 약 10초 동안 약 140℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 투과화된 바이오매스는 이후
- 밀링, 우선적으로는 기계적 밀링,
- pH 7에서의 안정화,
- 저온살균,
- 분무화
에 의해 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 분획의 정제는
- 선택적으로 2.5 내지 6.5, 바람직하게는 3 내지 5의 값까지의 pH의 조정과 함께, 10℃ 미만, 바람직하게는 4℃ 미만의 냉각 온도에서의 침전,
- 원심분리 또는 기울여 따르기(그 결과 펩티드 분리물에 상응하는 무거운 상 및 가벼운 상을 얻는다),
- 이렇게 하여 얻어진 펩티드 분리물의 농축 및 건조
에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 잔류 펩티드는 에탄올로의 침전에 의해 가벼운 상으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.