CN113480638B

CN113480638B - 一种藻蓝蛋白快速提取方法

Info

Publication number: CN113480638B
Application number: CN202110925095.8A
Authority: CN
Inventors: 黄成潭; 潘军; 叶蕾; 黄敏
Original assignee: Hainan Green Algae World Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hainan Green Algae World Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: WO2023015792A1; CN113480638A

Abstract

本发明涉及蛋白提取技术领域，特别涉及一种藻蓝蛋白快速提取方法。该方法包括如下步骤：将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合，经第一离心，得到浓缩藻液；将浓缩藻液与细胞冷冻保护剂混合，经反复冻融，得到解冻后的浓缩藻液；将解冻后的浓缩藻液与蛋白保护剂、表面活化剂混合，进行细胞破碎，得到破碎后的藻液；将破碎后的藻液进行第二离心，得到上清液；将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合，搅拌；将搅拌好的料液进行第三离心，得到沉淀；将所得沉淀用乙醇水溶液清洗，经第四离心，将沉淀物进行冷冻干燥。本发明提取方法操作简便快速，成本低廉，获得的藻蓝蛋白纯度高。

Description

一种藻蓝蛋白快速提取方法

技术领域

本发明涉及蛋白提取技术领域，特别涉及一种藻蓝蛋白快速提取方法。

背景技术

微藻是地球上最古老的物种之一，具有丰富的营养成分，在畜牧、环境保护、医药、化妆品、食品等领域都有着广泛的应用，也被世界粮农组织誉为21世纪人类最理想，最完美的食品。同时，微藻是水产养殖动物终生或特定发育阶段的饵料(或饵料的饵料)，作为重要基础之一，很大程度上支撑着水产养殖产业。微拟球藻生长迅速、细胞颗粒小、富含EPA等不饱和脂肪酸、营养比较全面，同时具有较厚细胞壁的特点。微藻是水体生态系统的初级生产力，含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、维生素等营养物质；微藻在给水生动物提供食物的同时，还能够通过光合作用，吸收水体中多余的氨氮、磷等物质，起到稳定和改善水质的作用，因此在水产养殖业中有着广泛的应用。

藻蓝蛋白是微藻中重要的营养成分，是一类普遍存在于微藻细胞中的光合辅助色素，是一种由开链四啦各化合物和脱辅蛋白。它是微藻细胞中重要的光合作用天然色素，在光合作用中能以近乎的高效率把光能优先地传递给光系统。许多研究表明，藻蓝蛋白具有提高机体抗辐射、抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老、抑菌、保护神经组织免受损伤、增强机体免疫力、保肝护肝、免疫荧光性等生物活性，已广泛应用于食品、化妆品、医药、分子探针等领域。藻蓝蛋白普遍存在于微藻中，在钝项微藻藻粉中含量高达20％。它富含人体八种必需氨基酸，在自然界中具有重大开发价值，是一种食用和饵料蛋白资源。藻蓝蛋白有两个重要用途：①粗品可作天然食用色素(天蓝色)；②纯品可作荧光分子探针，主要用于癌症早期检测、常规检测或制备成快速检测试剂盒，我国全部依赖进口。

藻蓝蛋白加工过程仍不同程度地存在着几大技术难题：如提取率低，成本高，性质不稳定等问题。这些问题常常影响藻蓝蛋白的色泽、功效，影响产品的商品价值。目前，藻细胞破壁研究多采用两种以上的破碎手段，如：反复冻融联合超声波处理，虽然可以较大程度地将藻蓝蛋白从微藻中释放出来，但该方法操作繁琐，耗时长，能耗高，设备成本高且超声波处理蛋白易变性。藻蓝蛋白的规模化纯化技术还不成熟，有盐析法、色谱法、双水相萃取等。盐析法温和，易浓缩，然而该方法获得藻蓝蛋白的纯度不高。藻蓝蛋白的规模化纯化技术中大多采用色谱纯化技术，易于放大和规模化生产，然而该技术面临色谱柱填料昂贵，纯化条件苛刻，产品较难回收和制备等问题。现阶段绝大多数的藻蓝蛋白提取研究还处于实验室阶段，方法较为繁琐复杂、产率低、纯度低、成本高，难以实现产业化。藻蓝蛋白提取纯化主要采用凝胶吸附和离子色谱法，但其操作复杂且需互相结合应用，不利于藻蓝蛋白的提纯。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种藻蓝蛋白快速提取方法。该提取方法操作简便快速，成本低廉，获得的藻蓝蛋白纯度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种藻蓝蛋白快速提取方法，包括如下步骤：

步骤(1)将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合，经第一离心，得到浓缩藻液；

步骤(2)将浓缩藻液与细胞冷冻保护剂混合，经反复冻融，得到解冻后的浓缩藻液；

步骤(3)将解冻后的浓缩藻液与蛋白保护剂、表面活化剂混合，进行细胞破碎，得到破碎后的藻液；

步骤(4)将破碎后的藻液进行第二离心，得到上清液；

步骤(5)将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合，搅拌；

步骤(6)将搅拌好的料液进行第三离心，得到沉淀；

步骤(7)将所得沉淀用乙醇水溶液清洗，经第四离心，将沉淀物进行冷冻干燥。

作为优选，蛋白保护剂为叠氮钠。

作为优选，步骤(1)，在含有微藻的养殖水中，蛋白保护剂的加入量为0.1～0.5mg/L。

在本发明提供的具体实施例中，在含有微藻的养殖水中，蛋白保护剂的加入量为0.2mg/L。

作为优选，第一离心的转速5000～10000rpm，浓缩藻液的含水量为50％～70％。

在本发明提供的具体实施例中，第一离心的转速8000rpm，浓缩藻液的含水量为58％。

作为优选，细胞冷冻保护剂为丙三醇；

作为优选，步骤(2)，在浓缩藻液中，细胞冷冻保护剂的加入量为5～10g/kg。

在本发明提供的具体实施例中，在浓缩藻液中，细胞冷冻保护剂的加入量为10g/kg。

作为优选，反复冻融的程序为：-20～-10℃冷冻12～24h，10～30℃解冻6～12h，重复2～3次。

优选地，反复冻融的程序为：-18℃冷冻12～24h，常温解冻6～12h，重复2～3次。

在本发明提供的具体实施例中，反复冻融的程序为：-18℃冷冻12h，常温解冻6h，重复2次。

作为优选，表面活化剂为吐温80和陶氏DF104聚醚消泡剂；

作为优选，步骤(3)，在解冻后的浓缩藻液中，蛋白保护剂的加入量为1～2mg/L，吐温80的加入量为1～5mL/L，陶氏DF104聚醚消泡剂的加入量为1～2mL/L。

在本发明提供的具体实施例中，在解冻后的浓缩藻液中，蛋白保护剂的加入量为2mg/L，吐温80的加入量为5mL/L，陶氏DF104聚醚消泡剂的加入量为1mL/L。

作为优选，第二离心的转速为2000～3000rpm，时间为40～60min。

在本发明提供的具体实施例中，第二离心的转速为2000rpm，时间为40min。

作为优选，步骤(5)，在上清液中，硫酸铵的加入量为10～15g/L，聚丙二醇的加入量为5～30mL/L；

在本发明提供的具体实施例中，在上清液中，硫酸铵的加入量为10g/L，聚丙二醇的加入量为20mL/L

作为优选，步骤(5)，搅拌的转速为500～1000rpm，时间为1～2h。

在本发明提供的具体实施例中，搅拌的转速为1000rpm，时间为1h。

作为优选，聚丙二醇的分子量为1500-2000。

在本发明提供的具体实施例中，聚丙二醇的分子量为1500。

作为优选，第三离心的转速为5000～10000rpm，时间为20～40min。

在本发明提供的具体实施例中，第三离心的转速为5000rpm，时间为30min。

作为优选，乙醇水溶液的浓度为20％～50％；

优选地，乙醇水溶液的浓度为30％。

作为优选，第四离心的转速为5000～10000rpm，时间为20～40min。

在本发明提供的具体实施例中，第四离心的转速为5000rpm，时间为30min。

在本发明中，微藻选自蓝藻门、绿藻门、金藻门或红藻门藻类。如小球藻、微拟球藻等。

本发明提供了一种藻蓝蛋白快速提取方法。该方法包括如下步骤：将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合，经第一离心，得到浓缩藻液；将浓缩藻液与细胞冷冻保护剂混合，经反复冻融，得到解冻后的浓缩藻液；将解冻后的浓缩藻液与蛋白保护剂、表面活化剂混合，进行细胞破碎，得到破碎后的藻液；将破碎后的藻液进行第二离心，得到上清液；将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合，搅拌；将搅拌好的料液进行第三离心，得到沉淀；将所得沉淀用乙醇水溶液清洗，经第四离心，将沉淀物进行冷冻干燥。本发明具有的技术效果为：

在本发明中，叠氮钠为蛋白保护剂，避免蛋白在离心过程变性、分解，形成杂质。丙三醇具有细胞保护作用，避免冷冻过程中的大颗粒冰晶形成，破坏蛋白结构。

步骤(2)中微藻经过反复冷冻及溶解，可将微藻坚硬的细胞壁破坏，更利于匀浆破碎效率。

步骤(3)中吐温80与陶氏DF104聚醚消泡剂组成混合表面活化剂，联合使用可将藻蓝蛋白析出在上清液中。

步骤(5)中硫酸铵和聚丙二醇的联合使用可将溶解于上清液中的藻蓝蛋白进行析出，形成颗粒沉淀。

步骤(7)中采用乙醇水溶液可洗去残留的硫酸铵和聚丙二醇以及其他杂质，使藻蓝蛋白的纯度提高。

经本发明多步简便快速的提取纯化操作，冻干后的藻蓝蛋白干粉纯度可达99％，蛋白捕获率87％，蛋白活性98％。

具体实施方式

本发明公开了一种藻蓝蛋白快速提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种微藻藻蓝蛋白快速提取方法具体包括：

1、将养殖好的微藻(微藻、小球藻、微拟球藻等)，先加入叠氮钠，加入量为0.1-0.5mg/L。然后通过碟片式离心机将微藻藻液进行离心分离，提取藻体细胞，形成浓缩藻液。离心机转速5000-10000rpm，分离出来的藻液含水量50％-70％。

2、将分离好的浓缩藻液加入丙三醇(100％纯度，加入量5-10g/kg浓缩藻)，搅拌均匀，放置在-18℃冰箱中进行冷冻，冷冻时间12-24h。

3、将冷冻好的浓缩藻液进行常温解冻，解冻时间6-12h。

4、重复第二步第三步2-3次。

5、将解冻后的浓缩藻液加入叠氮钠(加入量为1-2mg/L)、吐温80(加入量为1-5毫升/L)、陶氏DF104聚醚消泡剂(1-2mL/L)，混合均匀，置入匀浆破碎仪中进行细胞破碎。

6、将破碎后的藻液，经过碟片式离心机进行低转速离心，转速2000-3000rpm，离心40～60min，收取上清液，去除沉淀。

7、在收取的上清液中，加入硫酸铵固体(加入量10-15g/L)，聚丙二醇(加入量5-30mL/L)，搅拌1-2h。

8、将搅拌好的料液经过碟片式离心机进行高转速离心，转速5000-10000rpm，离心20～40min，收取沉淀。

9、将沉淀物用30％浓度乙醇溶液进行清洗，并再次离心，转速5000-10000rpm，离心20～40min，收取沉淀。

10、将沉淀物进行冷冻干燥，即得藻蓝蛋白冻干粉。

本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、将养殖好的海水小球藻(藻密度:800万cells/mL)，先加入叠氮钠，加入量为0.2mg/L。然后通过碟片式离心机将微藻藻液进行离心分离，提取藻体细胞，形成浓缩藻液。离心机转速8000rpm，分离出来的藻液含水量58％。

2、将分离好的浓缩藻液加入丙三醇(100％纯度，加入量10g/kg浓缩藻)，搅拌均匀，放置在-18℃冰箱中进行冷冻，冷冻时间12h。

3、将冷冻好的浓缩藻液进行常温解冻，解冻时间6h。

4、重复第二步第三步2次。

5、将解冻后的浓缩藻液加入叠氮钠(加入量为2mg/L)、吐温80(加入量为5毫升/L)、陶氏DF104聚醚消泡剂(1mL/L)，混合均匀，置入匀浆破碎仪中进行细胞破碎。

6、将破碎后的藻液，经过碟片式离心机进行低转速离心，转速2000rpm，离心40min，收取上清液，去除沉淀。

7、在收取的上清液中，加入硫酸铵固体(加入量10g/L)，聚丙二醇(加入量20mL/L)，搅拌1h。

8、将搅拌好的料液经过碟片式离心机进行高转速离心，转速5000rpm，离心30min，收取沉淀。

9、将沉淀物用30％浓度乙醇溶液进行清洗，并再次离心，转速5000rpm，离心30min，收取沉淀。

10、将沉淀物进行冷冻干燥，即得藻蓝蛋白冻干粉。

11、经检测，藻蓝蛋白纯度99.2％，蛋白捕获率87％，蛋白活性98％。

对比例1

参照公开号为CN109160947A专利(一种螺旋藻藻蓝蛋白的制备方法及其应用)中实施例四的提取方法，提取海水小球藻中的藻蓝蛋白。具体如下：

将养殖好的海水小球藻(藻密度:800万cells/mL)，先加入叠氮钠，加入量为0.2mg/L。然后通过碟片式离心机将微藻藻液进行离心分离，提取藻体细胞，形成浓缩藻液。离心机转速8000rpm，分离出来的藻液含水量55％。

将分离好的浓缩藻液加入按照料液体积比1:20g/ml加入磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/L，含有0.004mol/L的叠氮钠)，混匀；将其置于4℃环境中溶胀6小时，采用超细剪切机剪切15min，将剪切后的料液离心，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵至其饱和度为30％，除去其他蛋白杂质，离心，取上清液；继续向上清液中缓慢加入硫酸铵溶液至其饱和度为70％，离心，得蓝色沉淀物；将析出的沉淀物冷冻干燥18小时，得到藻蓝蛋白，藻蓝蛋白捕获率65％，纯度73％。

对比例2

本对比例参考实施例1，但全程不添加叠氮钠进行保护。

1、将养殖好的海水小球藻(藻密度:800万cells/mL)，通过碟片式离心机将微藻藻液进行离心分离，提取藻体细胞，形成浓缩藻液。离心机转速8000rpm，分离出来的藻液含水量58％。

3、将冷冻好的浓缩藻液进行常温解冻，解冻时间6h。

4、重复第二步第三步2次。

5、将解冻后的浓缩藻液加入吐温80(加入量为5毫升/L)、陶氏DF104聚醚消泡剂(1mL/L)，混合均匀，置入匀浆破碎仪中进行细胞破碎。

10、将沉淀物进行冷冻干燥，得藻蓝蛋白冻干粉。

11、经检测，藻蓝蛋白纯度65％，蛋白捕获率80％，蛋白活性40％。

对比例3

本对比例参考实施例1，但不进行反复冻融，只进行一步冻融。

3、将冷冻好的浓缩藻液进行常温解冻，解冻时间6h。

4、将解冻后的浓缩藻液加入叠氮钠(加入量为2mg/L)、吐温80(加入量为5毫升/L)、陶氏DF104聚醚消泡剂(1mL/L)，混合均匀，置入匀浆破碎仪中进行细胞破碎。

5、将破碎后的藻液，经过碟片式离心机进行低转速离心，转速2000rpm，离心40min，收取上清液，去除沉淀。

6、在收取的上清液中，加入硫酸铵固体(加入量10g/L)，聚丙二醇(加入量20mL/L)，搅拌1h。

7、将搅拌好的料液经过碟片式离心机进行高转速离心，转速5000rpm，离心30min，收取沉淀。

8、将沉淀物用30％浓度乙醇溶液进行清洗，并再次离心，转速5000rpm，离心30min，收取沉淀。

9、将沉淀物进行冷冻干燥，得藻蓝蛋白冻干粉。

10、经检测，藻蓝蛋白纯度85％，蛋白捕获率35％，蛋白活性89％。

对比例4

本对比例参考实施例1，将步骤7中的硫酸铵和聚丙二醇替换成聚合氯化铝絮凝剂(PAC)

3、将冷冻好的浓缩藻液进行常温解冻，解冻时间6h。

4、重复第二步第三步2次。

7、在收取的上清液中，加入聚合氯化铝絮凝剂(PAC)(加入量2g/L)，搅拌1h。

10、将沉淀物进行冷冻干燥，得藻蓝蛋白冻干粉。

11、经检测，藻蓝蛋白纯度25％，蛋白捕获率35％，蛋白活性40％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种藻蓝蛋白快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合，经第一离心，得到浓缩藻液；所述蛋白保护剂为叠氮钠；

步骤(2)将浓缩藻液与细胞冷冻保护剂混合，经反复冻融，得到解冻后的浓缩藻液；所述细胞冷冻保护剂为丙三醇；

步骤(3)将解冻后的浓缩藻液与蛋白保护剂、表面活化剂混合，进行细胞破碎，得到破碎后的藻液；所述表面活化剂为吐温80和陶氏DF104聚醚消泡剂；

步骤(4)将破碎后的藻液进行第二离心，得到上清液；

步骤(5)将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合，搅拌；

步骤(6)将搅拌好的料液进行第三离心，得到沉淀；

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)，在含有微藻的养殖水中，所述蛋白保护剂的加入量为0.1～0.5mg/L。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一离心的转速5000～10000rpm，所述浓缩藻液的含水量为50％～70％。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)，在浓缩藻液中，所述细胞冷冻保护剂的加入量为5～10g/kg。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述反复冻融的程序为：-20～-10℃冷冻12～24h，10～30℃解冻6～12h，重复2～3次。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)，在解冻后的浓缩藻液中，所述蛋白保护剂的加入量为1～2mg/L，所述吐温80的加入量为1～5mL/L，所述陶氏DF104聚醚消泡剂的加入量为1～2mL/L。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第二离心的转速为2000～3000rpm，时间为40～60min。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)，在上清液中，硫酸铵的加入量为10～15g/L，聚丙二醇的加入量为5～30mL/L；

所述搅拌的转速为500～1000rpm，时间为1～2h。

9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第三离心的转速为5000～10000rpm，时间为20～40min。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的浓度为20％～50％；

所述第四离心的转速为5000～10000rpm，时间为20～40min。