CN110938138B - 一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物提取技术领域，特别涉及一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法，首先取微藻藻泥用CaCl₂溶液进行溶胀破壁同时溶出藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷，再经过固液分离和多次膜过滤纯化、分离藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷，得到高纯度的藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷。本发明可在盐胁迫的微藻细胞中，既提取出食品级藻蓝蛋白，又同时获得甘油葡萄糖苷，并且提取工艺简单，既能降低企业生产成本，又能提高经济效益，应用范围更广。

Description

一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明属于生物提取技术领域，具体地说涉及一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法。

背景技术

微藻是自然界中广泛分布的原核生物，具有减轻癌症放疗、化疗的毒副反应，提高免疫功能，降低血脂等功效。由于其生长过程中可以同时合成油脂、糖类和藻蓝蛋白、甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol，简称GG)等高附加值的化合物，因此被广泛应用在食品及医药等行业方面。目前都只能对单一藻蓝蛋白或甘油葡萄糖苷进行提取，而无法实现同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷，因此不能充分利用微藻原料的营养价值，经济效益不高。

发明内容

针对现有技术的不足，发明人在长期实践中研究设计出一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法，该法可以同时提取藻蓝蛋白及甘油葡萄糖苷，达到简化提取工艺目的，同时提高经济效益为生产微藻高附加产品提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法，包括以下步骤：

获得盐胁迫的藻泥；以及包括：

工序一溶胀破壁：将获得的盐胁迫藻泥与浓度为1g/l～10g/lCaCl₂溶液在4℃～40℃环境下混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:10～100的比例混合，并遮光处理，溶胀时间为6～72小时，藻蓝蛋白与甘油葡萄糖苷同时破壁溶出，得到藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的混合液；

工序二固液分离：将工序一所得藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的混合液在4℃～40℃环境下，通过离心机或过滤装置进行固液分离，得到含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的粗提液；

工序三精细过滤：将工序二所得含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的粗提液采用膜过滤方法处理，所用过滤装置包括至少两级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，首级滤膜孔径为0.1μm～5μm，末级的滤膜孔径为1500D～0.1μm，去除杂质，得到含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的透过液；

工序四超滤：将工序三所得含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的透过液采用膜过滤方法分离藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷，选用的膜孔径为1500D～0.1μm，在温度4℃～40℃、压力为50Kpa～2Mpa环境下进行超滤，藻蓝蛋白与甘油葡萄糖苷分离，得到藻蓝蛋白浓缩液和含有甘油葡萄糖苷的透过液。

进一步地，所述方法还包括工序五，将工序四所得含有GG的透过液采用膜过滤方法进行纳滤浓缩，选用的膜孔径不大于300D，料液桶内为GG浓缩液。

进一步地，所述方法还包括工序六，在工序四所得藻蓝蛋白浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和工序五所得GG浓缩液经过干燥处理，得到高纯度的藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

进一步地，工序二中，工序二中，所述离心机为管式离心机、碟片离心机或三足离心机；所述过滤装置为板框过滤机，板框过滤机的滤布大小为600～2000目。

进一步地，工序六中，所述海藻糖和柠檬酸钠在藻蓝蛋白浓缩液里的添加量按照体积比藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％～90％：10％～40％：10％～40％的比例添加，且三者比例总和为1。

进一步地，工序六中，通过真空冷冻干燥、喷雾干燥或烘干干燥进行干燥处理。

进一步地，所述真空冷冻干燥分为预冷冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液经过三个阶段后得到藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

进一步地，所述喷雾干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液，以进风温度110℃～130℃、出风温度70℃～90℃的条件下进行喷雾干燥，获取藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

进一步地，所述烘干干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液放入烘干干燥机中，在温度50℃的条件进行干燥，得到藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

本发明的有益效果是：

(1)选用藻泥为原料，节约了藻泥变成藻粉的时间，同时避免了在烘干过程中藻蓝蛋白的流失，将藻蓝蛋白的提取效率最大化。

(2)利用膜分离技术来提取藻蓝蛋白和GG，与传统藻蓝蛋白提取方法相比获得的藻蓝蛋白稳定、产率高、低成本，并且提取时间短，既降低了能耗，又利于工业化快速连续生产。

(3)不仅提取出了藻蓝蛋白，同时可获得GG，与传统单一提取藻蓝蛋白或者GG相比，达到简化提取工艺目的，同时提高经济效益。

(4)能够严格控制每一个处理过程中藻蓝蛋白与GG的损失率，最终藻蓝蛋白的回收率可以达到85％，纯度达到食品级藻蓝蛋白标准，而GG回收率也可达到60％，很好地满足了工业生产中，食品添加剂对藻蓝蛋白与GG的要求。

具体实施方式

为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合较佳的实施例对本发明作进一步说明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

术语解释：

微藻：一般是指那些在显微镜下才能辨别形态微小的藻类。

正如背景技术所介绍的，现有技术中只能对单独藻蓝蛋白或甘油葡萄糖苷进行提取，而无法实现同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷，不能充分利用微藻原料的营养价值，经济效益不高。本发明提供一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法，仅提取出了藻蓝蛋白，同时可获得GG，藻蓝蛋白的回收率可以达到85％，GG回收率也可达到60％。

该方法包括以下步骤：

获得盐胁迫藻泥；以及包括

工序一溶胀破壁：将获得的盐胁迫藻泥与浓度为1g/l～10g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:10～100的比例混合，置于4℃～40℃环境下，溶胀时间为6～72小时，藻蓝蛋白与GG同时破壁溶出，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

工序二固液分离：将工序一所得藻蓝蛋白和GG的混合液在4℃～40℃环境下，通过离心机或过滤装置进行固液分离，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

工序三精细过滤：将工序二所得含有藻蓝蛋白和GG的粗提液采用膜过滤方法进行脱除杂质处理，选用的膜孔径为0.1μm～5μm，去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过，得到含有藻蓝蛋白和GG的透过液。

工序四超滤：将工序三所得含有藻蓝蛋白和GG的透过液采用膜过滤方法分离藻蓝蛋白和GG，选用的膜孔径为1500D～0.1μm，得到藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

工序五纳滤：将工序四所得含有GG的透过液采用膜过滤方法进行浓缩，选用的膜孔径不大于300D，小分子物质随透过液流出，料液桶内为GG的浓缩液。

工序六干燥：在工序四所得藻蓝蛋白浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，将添加海藻糖和柠檬酸钠的藻蓝蛋白浓缩液和工序五所得GG浓缩液经过干燥处理，得到高纯度的藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

进一步的，工序一中，将盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液的混合液在遮光环境下进行溶胀破壁。

常温下藻蓝蛋白纯度随时间逐渐下降，且处于光照环境下的藻蓝蛋白溶液纯度下降较快。表明光照对藻蓝蛋白的稳定性有影响，因此需要避光保存。

进一步的，工序一利用藻细胞处在低盐溶液的环境中，使细胞内外产生盐浓度落差值，利用这种落差值，使细胞充分吸水，撑破细胞壁，进而使藻蛋白和GG溶出，可以极大提高破壁率。藻蓝蛋白提取率能够达到95％以上，不低于玻璃珠震荡法，同时还有部分GG溶出，从而使CaCl₂提取法可以应用于提取藻蓝蛋白与GG。

进一步的，工序二中，采用管式离心机、碟片离心机或三足离心机进行高速离心使固液分离，或者采用板框过滤机进行膜过滤使固液分离。其中板框过滤机的滤布大小为600～2000目。

本发明经过固液分离，藻蓝蛋白的回收率为45％～95％。GG的回收率不小于60％。

进一步的，工序三中，采用过滤装置进行精细过滤，所述过滤装置包括至少两级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，首级滤膜孔径为0.1μm～5μm，末级的滤膜孔径为1500D～0.1μm。

膜元件为该套系统的关键组件，该设备通过膜元件上分布有一定孔径的滤膜来截留相应分子量的物质，起到分离纯化目标物质的作用，该步骤的目的是去除料液之中的胶体等物质，以防止影响后续实验的过滤效率。

本发明经过精细过滤，藻蓝蛋白回收率为20％～90％，GG的回收率大于45％。

进一步的，所述工序四超滤过程中，料液桶内过高的温度和压力会影响藻蓝蛋白变性，纯度下降。为保证藻蓝蛋白不变性，需将料液桶内保持低温低压状态。

本发明的一个实施方式中，在料液桶夹套中持续注入冷凝水，利用冷暖水机使桶内温度保持低温恒定状态(即4℃～40℃)。另外，将压力设定为50Kpa～2Mpa，来充分保证藻蓝蛋白活性。

进一步的，工序四中，在1500D～0.1μm范围的孔径下，可以使萃取液中的GG通过，但藻蓝蛋白无法通过，该步骤目的是将藻蓝蛋白与GG分离，同时，在分离藻蓝蛋白和GG时对含有藻蓝蛋白的萃取液进行浓缩，最终得到含有藻蓝蛋白的浓缩液与含有GG透过液。

本发明经过超滤后，藻蓝蛋白的损失率为10％～85％，GG的回收率大于40％。

进一步的，工序五中，在不大于300D范围的孔径下，可去除小分子物质，同时将含有GG的溶液进行浓缩。该过程中，GG的回收率大于30％。

进一步的，工序六中，需要向藻蓝蛋白的浓缩液中添加海藻糖和柠檬酸钠来保证藻蓝蛋白不被氧化，添加比例按照质量比藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％～80％：10％～40％：10％～40％，并保证三者比例总和为1，再经过干燥处理，最终藻蓝蛋白的回收率可达到5％～85％，纯度大于1。GG浓缩液经过干燥处理后，回收率大于25％。

进一步的，工序六中，通过真空冷冻干燥、喷雾干燥或烘干干燥进行干燥处理。干燥方式不受限制，进一步优选的为真空干燥。

真空冷冻干燥简称冻干，是将含水物质先冻结成固态，然后再使其中的水从固态升华成气态，从而达到物质干燥的方法。

冻干与烘干、喷雾干燥及真空干燥相比，由于冻干是在低温下进行干燥，所以藻蓝蛋白和GG不会发生变性，同时还可以使微生物失去活力，尤其适合一些热稳定性差的生物活性制品、生物化学制品等的保存。干燥后的藻蓝蛋白和GG的体积、形状都得到很好的保存，无干缩且复水速度快，很快就恢复到物质原有的形状。

低温环境下干燥，极大的抑制了微生物的生长和酶的作用，延长了产品的货架期；同时减小物质中含有的挥发性成分、芳香成分和热敏性营养成分等的损失，因此是一些化学制品、药品和食品的最佳干燥方式。

冻干能使干燥物质的水分控制在0.5％～5％之间，极大的控制了成品的水分含量，冻干是在真空条件下进行的，由于氧气极少，所以在一定程度上很好的保护了一些容易被氧化的物质。

所述真空冷冻干燥分为3个阶段，为预冷冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段。具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液放入真空泵预冷冻5～6小时达到-50℃后，打开真空泵进入升华干燥阶段，此阶段耗时较长，当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下直至干燥完成。

所述喷雾干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液，以进风温度110℃～130℃、出风温度70℃～90℃的条件进行喷雾干燥，最终在主收料中获取藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

所述烘干干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液放入烘干干燥机中，在温度50℃的条件下进行干燥，得到藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

经过该步骤，最终藻蓝蛋白的回收率可以达到5％～85％，纯度大于1，达到食品级藻蓝蛋白标准，而GG回收率也可大于25％，很好地满足了工业生产中，食品添加剂对藻蓝蛋白与GG的要求。

目前，关于微藻中GG的提取和纯化方法，专利CN108864218A即为本专利申请人申请的GG提取的另一种方法，通过上述专利方法提取出的GG产品纯度高达90％以上，回收率大于90％，满足了工业生产中，对食品添加剂对GG的纯度要求。本发明提供的方法，最终GG的回收率和纯度虽然小于上述专利，但由于市场对GG纯度的需求本身也有不同的需求，本专利提取出的GG可应用于不同的市场需求，可极大的扩大GG产品的纯度种类和供应量，并且本专利提取GG方法简便，提取GG同时可提取藻蓝蛋白，充分利用了微藻原料的营养价值，避免了资源浪费。

在本发明一个具体实施方式中，所述盐胁迫藻泥的藻泥种类为多管藻、念珠藻、聚球藻、隐藻或螺旋藻等，种类不受限制，进一步优选的为螺旋藻。

目前，盐胁迫藻泥可通过多种培养方法获得，并不需要特别的限定。但为了能够快速有效的制造大量的藻细胞，本发明提出一种优选的藻种养殖方法，本专利申请人已经作为其他专利申请进行保护，该方法包括：将藻细胞接种于低盐的淡水培养基中进行培养，其中盐浓度小于100mmol/L。

优选的，该阶段的培养时间为3-20天。

优选的，该阶段的培养温度为：15-40℃，进一步优选的，该阶段的培养温度为20-40℃。

优选的，所述低盐的淡水培养基中含有氮、磷、铁、镁、钠、钾以及微藻成长所需要的微量元素。

优选的，所述低盐的淡水培养基的配方为Zarrouk培养基，详细成分见表1和表2。该低盐的淡水培养基能够使得藻细胞大量的繁殖，为大量合成和积累GG作基础。

表1 Z氏培养基配方

表2母液配方

该阶段中选取了适宜波长的光照和碳源，以供光合作用。

对于碳源，在自养条件下选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐；在异养条件下，在低盐的淡水培养基中额外加入葡萄糖、麦芽糖、甘油、醋酸等。

在GG生成阶段中：

藻细胞选用上述获得培养后的藻细胞阶段培养后成长起来的细胞，在正常的情况下，在接入GG生成阶段的培养基之前细胞内部是不含有GG组分，或者即使含有也是很少的。

作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG，除了获得培养后的藻细胞阶段中所述微藻成长所需的营养元素以外，还需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，通常是选用能够改变细胞渗透压的物质，比如加入100～300mmol/L浓度的能够改变细胞渗透压的物质，该物质可以是氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。

光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。

基于此，对该阶段的培养条件进行优化，以期获得含有GG的藻细胞，为拔高阶段提供良好基础。

优选的，该阶段的培养时间为3-20天，进一步优选的，该阶段的培养时间为5-10天。

优选的，培养温度为：15-40℃，进一步优选的，培养温度为20-40℃。

优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m^-2·s^-2。

进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。

在GG拔高阶段一中：

在最优选的实施方式中，藻细胞特征是经过GG生成阶段培养后已经含有一定量的GG。在GG生成阶段中长时间持续培养，细胞会分泌一些对细胞成长起到阻碍作用的物质，从而导致细胞代谢活性降低，细胞内的GG合成能力下降。而将经过培养后含有一定量GG的细胞接入GG拔高阶段一的培养基后，细胞能够恢复活性继续成长，为GG合成反应提供驱动力，提高了GG累积的效率。

GG拔高阶段一的培养基条件，基本上与GG生成阶段相同，作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG。除了微藻成长所需的营养元素以外，需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，这种GG诱导物质的添加量至少要维持与GG生成阶段相同，增大GG诱导物质添加量更有效的促进GG的合成反应，比如加入300＜C₁≤800mmol/L浓度的氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。

光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。

基于此，对GG拔高阶段一的培养条件进行优化，以期获得较高含量GG的藻细胞。

优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。

优选的，培养温度为：15-40℃；进一步优选的，黑暗期间温度设置15-25℃，光照期间温度设置25-40℃。

优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m^-2·s^-2。

进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的混合气既能降低氧气浓度又能促进GG的积累。

在最优选的实施方式中，通过GG拔高阶段一培养后，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。

在GG拔高阶段二中：

对于自养型微藻，选用与GG拔高阶段一相同培养条件，区别是能够改变细胞渗透压的物质在培养基中的浓度为800＜C₂≤1500mmol/L。

对于异养型微藻或者经过基因工程技术改造后提高细胞壁的小分子透过性的微藻细胞，在本培养基内除了使能够改变细胞渗透压的物质浓度为800＜C₂≤1500mmol/L以外，还需添加合成GG的反应底物，比如甘油或者可以利用的糖，比如葡萄糖、麦芽糖，但不限于上述两种糖，可以进一步提高微藻细胞的GG含量。优选的，所述甘油或者葡萄糖，通过流加等方式维持甘油的浓度0.5-2g/L，葡萄糖的浓度为0.5-5g/L。

优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。

本发明人发现，不同的培养方法和培养条件对藻细胞内GG的含量影响较大，本发明通过特定的培养方法(包括昼夜组合方式、高盐培养藻种后再高盐度养殖，高光条件等)和逐级调控的模式，能够获得高含量GG的藻细胞。

在本发明一个优选的实施方式中，上述GG拔高阶段一或GG拔高阶段二步骤后还包括采收步骤，该步骤包括：从GG拔高阶段一或GG拔高阶段二中的培养基中采收富集GG的藻细胞，获得微藻藻泥。

在本发明一个优选的实施方式中，在采收的步骤后还包括清洗步骤，该步骤包括：清洗微藻藻泥表面，去除表面附着物，获得洁净藻泥。

本发明中的各个步骤所使用的反应器不限，可以是密闭式反应器，也可以是开放式跑道池。对于异养型微藻细胞，用封闭式反应器更有效的防止杂菌污染。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序四处理，分离藻蓝蛋白和GG。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为1g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:10的比例混合，置于4℃环境下，遮光处理，溶胀时间为6小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在4℃环境下采用管式离心机进行高速离心，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法去除杂质，选用的膜孔径为0.1μm，粗提液中大分子物质及胶体等杂质留在料液桶内，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过滤膜，得到含有藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法分离藻蓝蛋白和GG，选用的膜孔径为2000D，置于4℃环境下，压力设定为2Mpa，藻蓝蛋白留在料液桶内，GG随透过液流出，得到藻蓝蛋白浓缩液和含有GG的透过液。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率为55.7％，纯度为1.07；GG的回收率为52.6％

实施例2

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序五处理，获得藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为10g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:100的比例混合，置于40℃环境下，溶胀时间为72小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在40℃环境下采用板框过滤机过滤，滤布大小为600目，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法，选用膜孔径为5μm，去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过，得到藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得藻蓝蛋白和GG的透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，膜孔径为0.1μm，置于40℃环境下，压力设定为50Kpa，得到含有藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

5)将4)所得含有GG的透过液经过工序五进行纳滤，采用膜过滤方法进行浓缩，膜孔径为300D，使透过液中的小分子通过，得到含有GG的浓缩液。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率为44.1％，纯度为1.19。GG的回收率为38.6％。

实施例3

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序五处理，获得藻蓝蛋白浓缩液和GG浓缩液。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为5g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:50的比例混合，置于15℃环境下，遮光处理，溶胀时间为45小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在15℃环境下采用板框过滤机过滤，滤布大小为2000目，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法，选用膜孔径为3μm，去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过，得到藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得藻蓝蛋白和GG的透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，膜孔径为2500D，置于15℃环境下，压力设定为200Kpa，得到含有藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

5)将4)所得含有GG的透过液经过工序五进行纳滤，采用膜过滤方法进行浓缩，膜孔径为150D，使透过液中的小分子通过，得到含有GG的浓缩液。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率为64.4％，纯度为1.17；GG的回收率为31.4％。

实施例4

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序六处理，获得高纯度藻蓝蛋白和GG。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为8g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:40的比例混合，置于4℃环境下，遮光处理，溶胀时间为72小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在4℃环境下采用板框过滤机过滤，滤布大小为1200目，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法，选用膜孔径为0.2μm，目的是去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过，得到藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得藻蓝蛋白和GG透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，膜孔径为2000D，置于15℃环境下，压力设定为200Kpa，得到含有藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

5)将4)所得含有GG的透过液经过工序五进行纳滤，采用膜过滤方法进行浓缩，膜孔径为100D，使透过液中的小分子通过，得到含有GG的浓缩液。

6)在4)所得含有藻蓝蛋白的浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，海藻糖和柠檬酸钠在藻蓝蛋白里的添加量按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％：40％：20％的比例添加；然后，将添加海藻糖和柠檬酸后的藻蓝蛋白浓缩液和5)所得GG浓缩液分别放入真空泵预冷冻5小时达到-50℃后，打开真空泵进入升华干燥阶段，当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下直至干燥完成。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率为77.8％，纯度1.53；GG的回收率为28.9％。

实施例5

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序六处理，获得食品级藻蓝蛋白和GG。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为8g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:40的比例混合，置于4℃环境下，遮光处理，溶胀时间为72小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在4℃环境下采用碟片离心机进行高速离心，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法，选用膜孔径为0.2μm，去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过，得到藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得藻蓝蛋白和GG的透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，膜孔径为2500D，置于4℃环境下，压力设定为200Kpa，藻蓝蛋白与GG分离，得到含有藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

5)将4)所得含有GG的透过液经过工序五进行纳滤，采用膜过滤方法进行浓缩，膜孔径为150D，使透过液中的小分子通过，得到含有GG的浓缩液。

6)在4)所得含有藻蓝蛋白的浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，海藻糖和柠檬酸钠在藻蓝蛋白里的添加量按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为80％：10％：10％的比例添加；然后，将添加海藻糖和柠檬酸后的藻蓝蛋白浓缩液和5)所得GG浓缩液分别、放入真空泵预冷冻6小时达到-50℃后，打开真空泵进入升华干燥阶段，当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下直至干燥完成。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率63.4％，纯度为1.33；GG的回收率为36.7％。

实施例6

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序六处理，获得藻蓝蛋白和GG。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为8g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:40的比例混合，置于4℃环境下，遮光处理，溶胀时间为72小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在4℃环境下采用三足离心机进行高速离心，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法，选用膜孔径为2μm，去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过，得到藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得藻蓝蛋白和GG透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，膜孔径为2000D，置于4℃环境下，压力设定为200Kpa，藻蓝蛋白与GG分离，得到含有藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

5)将4)所得含有GG的透过液经过工序五进行纳滤，采用膜过滤方法进行浓缩，膜孔径为100D，使透过液中的小分子通过，得到含有GG的浓缩液。

6)在4)所得含有藻蓝蛋白的浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，海藻糖和柠檬酸钠在藻蓝蛋白里的添加量按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％：20％：40％的比例添加；然后，将添加海藻糖和柠檬酸后的藻蓝蛋白浓缩液和5)所得GG浓缩液，均以进风温度110℃、出风温度70℃进行喷雾干燥，最终在主收料中获取藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率为65.2％，纯度1.27；GG的回收率为26.7％。

实施例7

用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一至工序六处理，获得食品级藻蓝蛋白和GG。方法示例如下：

1)使用工序一进行溶胀破壁，将获得的盐胁迫藻泥与浓度为8g/lCaCl₂溶液混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:40的比例混合，置于4℃环境下，遮光处理，溶胀时间为72小时，得到藻蓝蛋白和GG的混合液。

2)将1)所得混合液经过工序二进行固液分离，在4℃环境下采用管式离心机进行高速离心，得到含有藻蓝蛋白和GG的粗提液。

3)将2)所得粗提液经过工序三进行精细过滤，采用膜过滤方法去除杂质，选用的膜孔径为0.2μm，粗提液中大分子物质及胶体等杂质留在料液桶内，并且保证藻蓝蛋白与GG顺利通过滤膜，得到含有藻蓝蛋白和GG的透过液。

4)将3)所得透过液经过工序四进行超滤，采用膜过滤方法分离藻蓝蛋白和GG，选用的膜孔径为2500D，置于4℃环境下，压力设定为200Kpa，藻蓝蛋白与GG分离，得到含有藻蓝蛋白的浓缩液和含有GG的透过液。

5)将4)所得含有GG的透过液经过工序五进行纳滤，采用膜过滤方法进行浓缩，选用的膜孔径为150D，使透过液中的小分子通过，得到GG浓缩液。

6)在4)所得含有藻蓝蛋白浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，海藻糖和柠檬酸钠在藻蓝蛋白里的添加量按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为60％:20％：20％的质量比添加；然后，将添加海藻糖和柠檬酸后的藻蓝蛋白浓缩液和5)所得GG浓缩液，放入烘干干燥机中，在温度50℃的条件下进行干燥，得到藻蓝蛋白干粉和GG干粉。

经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率为76.3％，纯度为1.37；GG的回收率为34.6％。

对比实验1

同时提取藻蓝蛋白与GG的实验背景。

实验目的：比较GG和藻蓝蛋白的同时提取藻蓝蛋白回收率和先提取GG再提藻蓝蛋白的回收率

实验方法：取盐胁迫藻泥利用CaCl₂使细胞胀破，藻蓝蛋白与与GG同时出来。测定回收率。然后再取同一批藻泥先提取GG再提取藻蓝蛋白，测定回收率。

实验结果：

表3盐胁迫藻泥经同时提藻蓝蛋白与GG与先提GG再提藻蓝蛋白的回收率

小结：同时提取藻蓝蛋白与GG与先提取GG再提取藻蓝蛋白方法相比，虽然GG的回收率和纯度降低，但可以通过一步法直接将二者进行提出，减少了工艺的繁琐性，节约时间以及成本。

对比实验2

CaCl₂溶胀法的实验背景。

实验目的：对比CaCl₂溶胀法与其他方法的藻蓝蛋白回收率。

实验方法：选用盐胁迫后藻泥，依次经过反复冻融法，玻璃珠震荡法，超声波破碎法，CaCl₂溶胀法。比较其回收率及纯度。

实验结果：

表4 CaCl₂溶胀法与其他方法藻蓝蛋白回收率结果

小结：假设以玻璃珠震荡法能够提取出全部的藻蓝蛋白为1，CaCl₂溶胀法相比其他方法更能提取出高纯度高含量的藻蓝蛋白，因此选用CaCl₂溶胀法用于提取藻蓝蛋白的方法。

以上已将发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims (5)

1.一种同时提取藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得盐胁迫的藻泥；以及包括：

工序一溶胀破壁：将获得的盐胁迫藻泥与浓度为1g/l～10g/l CaCl₂溶液在4℃～40℃环境下混合，盐胁迫藻泥与CaCl₂溶液按体积比1:10～100的比例混合，并遮光处理，溶胀时间为6～72小时，藻蓝蛋白与甘油葡萄糖苷同时破壁溶出，得到藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的混合液；

工序二固液分离：将工序一所得藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的混合液在4℃～40℃环境下，通过离心机或过滤装置进行固液分离，得到含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的粗提液；

工序三精细过滤：将工序二所得含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的粗提液采用膜过滤方法处理，所用过滤装置包括至少两级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，首级滤膜孔径为0.1μm～5μm，末级的滤膜孔径为1500D～0.1μm，去除杂质，得到含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的透过液；

工序四超滤：将工序三所得含有藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷的透过液采用膜过滤方法分离藻蓝蛋白和甘油葡萄糖苷，选用的膜孔径为1500D～0.1μm，在温度4℃～40℃、压力为50Kpa～2Mpa环境下进行超滤，藻蓝蛋白与甘油葡萄糖苷分离，得到藻蓝蛋白浓缩液和含有甘油葡萄糖苷的透过液；

工序五浓缩：将工序四所得含有甘油葡萄糖苷的透过液采用膜过滤方法进行浓缩，选用的膜孔径不大于300D，得到甘油葡萄糖苷浓缩液；

工序六干燥：在工序四所得藻蓝蛋白浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和工序五所得甘油葡萄糖苷浓缩液经过干燥处理，得到藻蓝蛋白干粉和甘油葡萄糖苷干粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工序二中，所述离心机为管式离心机、碟片离心机或三足离心机；所述过滤装置为板框过滤机，板框过滤滤布大小为600～2000目。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工序六中，所述海藻糖和柠檬酸钠在藻蓝蛋白浓缩液里的添加量按照质量比藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％～90％：10％～40％：10％～40％的比例添加，且三者比例总和为1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工序六中，通过真空冷冻干燥、喷雾干燥或烘干干燥进行干燥处理。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥分为预冷冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和甘油葡萄糖苷浓缩液经过三个阶段后得到藻蓝蛋白干粉和甘油葡萄糖苷干粉；

所述喷雾干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和甘油葡萄糖苷浓缩液，以进风温度110℃～130℃、出风温度70℃～90℃的条件进行喷雾干燥，获取藻蓝蛋白干粉和甘油葡萄糖苷干粉；

所述烘干干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液和甘油葡萄糖苷浓缩液放入烘干干燥机中，在温度50℃的条件下进行干燥，得到藻蓝蛋白干粉和甘油葡萄糖苷干粉。