CN108864218B

CN108864218B - 一种甘油葡萄糖苷产品及甘油葡萄糖苷的纯化方法与应用

Info

Publication number: CN108864218B
Application number: CN201810907595.7A
Authority: CN
Inventors: 刘祥; 段仰凯; 吕雪峰; 吴怀之; 张凯
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Zhongke Lanzhi Biotechnology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2038-08-10
Also published as: CN108864218A

Abstract

本发明公开了一种甘油葡萄糖苷产品及甘油葡萄糖苷的纯化方法与应用，该方法包括以下工序：工序一获取富含GG的低渗萃取液；工序二膜过滤脱色素；工序三树脂吸附脱色素；工序四膜过滤脱盐；工序五脱水浓缩：将得到的浓缩液进行脱水得到纯化后的甘油葡萄糖苷产品。本发明的纯化方法简单、安全、易于操作和控制，是一种高效的纯化方法，非常适合工业化大规模生产，提高其经济效益。

Description

一种甘油葡萄糖苷产品及甘油葡萄糖苷的纯化方法与应用

技术领域

本发明属于化合物纯化技术领域，涉及一种甘油葡萄糖苷产品及甘油葡萄糖苷的纯化方法与应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol,GG)是一类由甘油分子和葡萄糖分子通过糖苷键连接而形成的糖苷类化合物，在自然界中，根据立体构型(α和β)和糖苷键连接位置的不同存在6种不同的立体结构。其中具有重要生理功能的结构为2-α构型，研究证明其主要有皮肤保湿、预防龋齿、α-葡萄糖苷酶抑制剂及有助于大分子稳定、抑制脂肪细胞内中性脂的累积、抗过敏及抗癌等重要生理功能，在相关领域的应用潜力巨大。

利用微藻生产甘油葡萄糖苷，能够实现从二氧化碳到甘油葡萄糖苷产品在同一细胞内的直接转化，具有高转化效率和低碳排放的特点，从而被认为是一种有前景的甘油葡萄糖苷生产方式。该方法有望实现GG的大规模生产，为GG的应用扫除了产能障碍。

而GG的规模化应用，尤其用于食品添加，需要较高纯度的GG作为原材料。虽然目前已有多种GG合成方式，但是报道的GG产物分离纯化的方法较少。早前本发明人吕雪峰等研究了一种吸附分离GG的方法，实现了蓝藻合成GG产物的初步分离纯化。但是该方法针对的是蓝藻培养液，且通过该吸附分离方法得到的GG的纯度和产率较低，无法真正实现产业化应用。

因此，目前有必要提供一种甘油葡萄糖苷产品以及GG的高效纯化方法，使得GG的纯度和产率得到进一步的提升，实现GG的规模化生产。

发明内容

本发明针对的是GG低渗萃取液，目前萃取液中GG的分离与纯化工艺还未得到开发，因此本发明的目的是提供一种甘油葡萄糖苷产品及其产品和应用。

在本发明的第一个方面，提供一种甘油葡萄糖苷的产品，所述产品是为富含GG的低渗萃取液或是所述富含GG的低渗萃取液进行纯化而得，产品成分包括GG、无机盐、色素和/或水，其中，GG含量至少为0.5g/L，无机盐含量低于4000ppm。

在本发明的第二个方面，提供一种纯化甘油葡萄糖苷的方法，该方法包括以下工序：

工序一获取富含GG的低渗萃取液：将采收的富含GG的微藻，与低渗溶液混合萃取，萃取次数1～7次，滤出微藻获得富含GG、色素和盐分的低渗萃取液混合物；

工序二膜过滤脱色素：将得到的萃取液采用膜浓缩方法进行脱色素处理，膜孔径为400～800(道尔顿)Da；

工序三树脂吸附脱色素：将得到的萃取液采用大孔吸附树脂柱进行脱色素处理；

工序四膜过滤脱盐：将得到的萃取液采用膜浓缩方法进行浓缩和脱盐，膜孔径为100～250Da；

工序五脱水浓缩：将得到的浓缩液进行脱水得到纯化后的甘油葡萄糖苷产品。

其中，根据获得产物的不同，所述方法包括工序一或者工序一与其他后续工序的任意组合，具体的依次按照工序一、工序二，或者，依次按照工序一、工序三；或者，依次按照工序一、工序四；或者，依次按照工序一、工序五；或者，依次按照工序一、工序二、工序三；或者，依次按照工序一、工序二、工序四；或者，依次按照工序一、工序二、工序五；或者，依次按照工序一、工序三、工序二；或者，依次按照工序一、工序三、工序四；依次按照工序一、工序三、工序五；或者，依次按照工序一、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序三、工序二、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序四、工序二、工序三、工序五；或者，依次按照工序一、工序四、工序三、工序二、工序五等进行操作。

作为一种可选择的实施方式，所述工序二、工序三和工序四或工序四采用以下方法进行替换：将得到的萃取液采用GG吸附树脂柱对GG进行吸附，然后洗脱GG。

作为一种可选择的实施方式，所述的工序二和工序四采用双膜过滤组合工序，直接获得一定浓度的GG产品。

本发明还保护采用上述方法制备得到的甘油葡萄糖苷的产品。

在本发明的第三个方面，提供所述甘油葡萄糖苷的产品在食品、化妆品、医药品中的应用。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明中提供的产品是为富含GG的低渗萃取液或是所述富含GG的低渗萃取液进行纯化而得，产品成分包括GG、无机盐、色素和/或水，其中，GG含量至少为0.5g/L，无机盐含量低于4000ppm。

在本发明优选的实施方式中，提供了一种高GG含量、低盐和低色素含量的甘油葡萄糖苷产品。

本发明提供的甘油葡萄糖苷产品可广泛应用在食品、化妆品、医药品中。

(2)本发明根据GG低渗萃取液的特点，提供了一套适合该萃取液的纯化甘油葡萄糖苷的方法。针对特定的GG低渗萃取液，通过一系列的物理方法进行处理，建立了一条稳定高效的GG纯化技术，不需要进行化学反应减少了成品中的杂质组分，最大限度地保留了GG的活性成分，纯度高达90％以上，回收率大于90％，能够实现大规模的工业生产。

(3)脱色素过程中，大孔吸附树脂柱脱色虽可达到去除色素的目的，但无膜浓缩脱色的处理，色素去除率不到95％，会大幅影响GG的纯度。

(4)本发明的纯化方法简单、安全、易于操作和控制、生产成本低，是一种高效的纯化方法，非常适合工业化大规模生产，提高其经济效益。

(5)本发明设计的纯化方法中，设计了能够严格控制每一个处理过程中GG的损失率的方法，最终获得了纯度90％以上的高纯度GG产品，很好地满足了工业生产中，对食品添加GG的纯度要求。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中甘油葡萄糖苷产品及其纯化/制备方法存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种甘油葡萄糖苷的产品，所述产品是为富含GG的低渗萃取液或是所述富含GG的低渗萃取液进行纯化而得，产品成分包括GG、无机盐、色素和/或水，其中，GG含量至少为0.5g/L，无机盐含量低于4000ppm。

在本发明一个具体实施方式中，所述甘油葡萄糖苷的产品为GG低渗萃取原液产品，其中，所述GG含量至少为28g/L或者18g/L或者10g/L或者3g/L。

进一步的，所述GG低渗萃取原液产品是通过以下方法制备得到：将采收的富含GG的微藻，与低渗溶液混合萃取，萃取次数1～7次，滤出微藻即可获得GG低渗萃取原液产品，且获取的低渗萃取液中GG浓度随着萃取次数的减少而降低。

更进一步的，滤出微藻获得GG低渗萃取原液产品进行精密过滤预处理除杂，所述精密过滤预处理除杂采用过滤装置进行过滤，所述过滤装置包括至少十级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，第一级滤膜孔径不小于500μm，最后一级的滤膜孔径不大于2.0μm。

该步骤为物理方法将GG低渗萃取原液产品中杂质进行过滤，过程中GG不会损失。

更进一步的，所述GG低渗萃取原液产品是通过以下方法制备得到：将采收的富含GG的微藻，进行脱水，然后加入低渗溶液进行萃取，经过藻水分离获得藻泥和GG水溶液，如此萃取1～7次，收集每次萃取后的萃取液或合并多次萃取后的萃取液即为GG低渗萃取原液产品。

在本发明一个具体实施方式中，萃取次数为4次。

在本发明一个具体实施方式中，所述甘油葡萄糖苷的产品为高GG含量产品，所述GG含量至少为300g/L或者28g/L或者18g/L。

在本发明一个具体实施方式中，所述甘油葡萄糖苷的产品为低盐含量产品，所述无机盐含量小于等于212ppm或者183ppm或者100ppm。

在本发明一个具体实施方式中，所述甘油葡萄糖苷的产品为低色素含量产品，所述甘油葡萄糖苷的产品为至少去除所述富含GG的低渗萃取液中90％或者90.2％或者91.3％以上的色素的产品。

在本发明一个典型实施方式中，提供一种纯化甘油葡萄糖苷的方法，该方法包括以下工序：

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法包括工序一。

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法依次按照工序一、工序二进行操作。

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法依次按照工序一、工序二、工序三进行操作。

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法依次按照工序一、工序四进行操作。

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法依次按照工序一、工序二、工序三、工序四进行操作。

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法依次按照工序一、工序三、工序四进行操作。

在本发明一个具体的实施方式中，所述方法依次按照工序一、工序五进行操作。

进一步的，所述工序一之后还包括精密过滤预处理除杂，所述精密过滤预处理除杂采用过滤装置进行过滤，所述过滤装置包括至少十级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，第一级滤膜孔径不小于500μm，最后一级的滤膜孔径不大于2.0μm。

作为一种可选择的实施方式，所述工序二、工序三和工序四或工序四可采用以下方法进行替换：将得到的萃取液采用GG吸附树脂柱对GG进行吸附，然后洗脱GG。所述GG吸附树脂柱具有专一性吸附，不吸附盐、甘油等物质，包括但不限于苯乙烯型大孔吸附树脂等，如D101树脂、XAD-1树脂等。

GG吸附饱和后先使用数倍柱体积的纯水将柱子中参与的杂质洗脱，再用数倍10～60(v/v)％的乙醇溶液将GG洗脱。

优选的，在进行该操作时，必须将萃取液中色素去除干净。色素不仅影响GG吸附树脂柱的吸附效率而且还会降低GG吸附树脂的寿命。

在本发明一个具体实施方式中，工序一中，富含GG的低渗萃取液为富集GG的微藻通过低渗溶液萃取得到的萃取液，该萃取液包含色素、盐类物质、(少量的)糖类物质和GG。

在本发明一个具体实施方式中，工序一中，所述低渗溶液为比微藻细胞内渗透压低的溶液，包括洁净无盐水溶液、低盐水溶液、降低细胞渗透压的钾盐或镁盐水溶液。上述盐水溶液的浓度可根据需要进行配制，本发明不做限定。

优选的，低渗溶液为洁净的无盐水溶液；进一步优选为无菌去离子水。

如果采用高渗透压的盐溶液、高浓度乙醇溶液作为萃取液，由于这些萃取液具有很好的穿过细胞壁或溶解细胞膜的能力，萃取时将会破坏微藻细胞内部组织结构，导致微藻细胞死亡。

在本发明一个具体实施方式中，工序一中，所述富集GG的微藻的种类为绿藻、硅藻、红球藻、杜氏藻、小球藻或螺旋藻等，种类不受限制，进一步优选的为螺旋藻。

目前，富集GG的微藻可通过多种培养方法获得，并不需要特别的限定。但是为了获得更好的纯化效果，本发明优先提供一种高含量GG微藻细胞的获得方法，本专利申请人已经作为其他专利申请进行保护，该方法具体包括：

获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：

GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C₁≤800mmol/L；和/或者，

GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C₂≤1500mmol/L。

作为一种可选的实施方式，在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L。

在本发明较优选的实施方式中，提供了一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：

获得培养后的藻细胞阶段；

GG拔高阶段一：将上述阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为300＜C₁≤800mmol/L；

GG拔高阶段二：将GG拔高阶段一中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为800＜C₂≤1500mmol/L。

在本发明最优选的实施方式中，提供了一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：

获得培养后的藻细胞阶段；

GG生成阶段：将上述阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L；

GG拔高阶段一：将GG生成阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为300＜C₁≤800mmol/L；

在本发明中，所述能够改变细胞渗透压的物质为无机盐和/或有机盐的一种或多种组合。

优选的，所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、氯化钾或其他无机盐类中的一种或多种；所述有机盐为甲酸钠、乙酸铵或其他有机盐类中的一种或多种。

在本发明中，各培养阶段的光照采用自然光或变光均可，为使培养效果最优，在本发明优选的实施方式中，各培养阶段的光照光波长范围均为400～700nm。

在最优选的实施方式中，GG生成阶段、GG拔高阶段一和GG拔高阶段二是诱导GG、积累GG以及不让已经合成的GG受其他环境条件影响被消费掉的过程，是分三步逐级提高GG含量的过程。

在获得培养后的藻细胞阶段中：

获得培养后的藻细胞有多种途径或方法，在此并没有特别的限定，但为了能够快速有效的制造大量的藻细胞，本发明提出一种优选的藻种养殖方法，该方法包括：将藻细胞接种于低盐的淡水培养基中进行培养，其中盐浓度小于100mmol/L。

优选的，该阶段的培养时间为3-20天。

优选的，该阶段的培养温度为：15-40℃，进一步优选的，该阶段的培养温度为20-40℃。

优选的，所述低盐的淡水培养基中含有氮、磷、铁、镁、钠、钾以及微藻成长所需要的微量元素。

优选的，所述低盐的淡水培养基的配方为Zarrouk培养基，详细成分见表1和表2。该低盐的淡水培养基能够使得藻细胞大量的繁殖，为大量合成和积累GG作基础。

表1Z氏培养基配方

表2母液配方

该阶段中选取了适宜波长的光照和碳源，以供光合作用。

对于碳源，在自养条件下选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐；在异养条件下，在低盐的淡水培养基中额外加入葡萄糖、麦芽糖、甘油、醋酸等。

在GG生成阶段中：

藻细胞选用上述获得培养后的藻细胞阶段培养后成长起来的细胞，在正常的情况下，在接入GG生成阶段的培养基之前细胞内部是不含有GG组分，或者即使含有也是很少的。

作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG，除了获得培养后的藻细胞阶段中所述微藻成长所需的营养元素以外，还需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，通常是选用能够改变细胞渗透压的物质，比如加入100～300mmol/L浓度的能够改变细胞渗透压的物质，该物质可以是氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。

光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。

基于此，对该阶段的培养条件进行优化，以期获得含有GG的藻细胞，为拔高阶段提供良好基础。

优选的，该阶段的培养时间为3-20天，进一步优选的，该阶段的培养时间为5-10天。

优选的，培养温度为：15-40℃，进一步优选的，培养温度为20-40℃。

优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m^-2·s^-2。

进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。

在GG拔高阶段一中：

在最优选的实施方式中，藻细胞特征是经过GG生成阶段培养后已经含有一定量的GG。在GG生成阶段中长时间持续培养，细胞会分泌一些对细胞成长起到阻碍作用的物质，从而导致细胞代谢活性降低，细胞内的GG合成能力下降。而将经过培养后含有一定量GG的细胞接入GG拔高阶段一的培养基后，细胞能够恢复活性继续成长，为GG合成反应提供驱动力，提高了GG累积的效率。

GG拔高阶段一的培养基条件，基本上与GG生成阶段相同，作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG。除了微藻成长所需的营养元素以外，需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，这种GG诱导物质的添加量至少要维持与GG生成阶段相同，增大GG诱导物质添加量更有效的促进GG的合成反应，比如加入300＜C₁≤800mmol/L浓度的氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。

基于此，对GG拔高阶段一的培养条件进行优化，以期获得较高含量GG的藻细胞。

优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。

优选的，培养温度为：15-40℃；进一步优选的，黑暗期间温度设置15-25℃，光照期间温度设置25-40℃。

进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的混合气既能降低氧气浓度又能促进GG的积累。

在最优选的实施方式中，通过GG拔高阶段一培养后，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。

在GG拔高阶段二中：

对于自养型微藻，选用与GG拔高阶段一相同培养条件，区别是能够改变细胞渗透压的物质在培养基中的浓度为800＜C₂≤1500mmol/L。

对于异养型微藻或者经过基因工程技术改造后提高细胞壁的小分子透过性的微藻细胞，在本培养基内除了使能够改变细胞渗透压的物质浓度为800＜C₂≤1500以外，还需添加合成GG的反应底物，比如甘油或者可以利用的糖，比如葡萄糖、麦芽糖，但不限于上述两种糖，可以进一步提高微藻细胞的GG含量。优选的，所述甘油或者葡萄糖，通过流加等方式维持甘油的浓度0.5-2g/L，葡萄糖的浓度为0.5-5g/L。

优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。

本发明人发现，不同的培养方法和培养条件对藻细胞内GG的含量影响较大，本发明通过特定的培养方法(包括昼夜组合方式、高盐培养藻种后再高盐度养殖，高光条件等)和逐级调控的模式，能够获得高含量GG的藻细胞。

在本发明一个优选的实施方式中，上述GG拔高阶段一或GG拔高阶段二步骤后还包括采收步骤，该步骤包括：从GG拔高阶段一或GG拔高阶段二中的培养基中采收富集GG的微藻细胞，获得微藻藻泥。

在本发明一个优选的实施方式中，在采收的步骤后还包括清洗步骤，该步骤包括：清洗微藻藻泥表面，去除表面附着物，获得洁净微藻藻泥。

在本发明一个优选的实施方式中，工序二中，所述膜浓缩方法采用膜浓缩设备，膜孔径为400～800Da。

该过程可去除50％的色素且萃取液中GG不会损失，该步骤去除的色素为分子量大于500Da的色素，所述色素包括但不限于叶绿素和类胡萝卜素等。

在本发明优选的一个具体实施方式中，工序三中，所述大孔吸附树脂是包括但不限于，如NM200树脂、D3520树脂、NKA-9树脂、HZ-802树脂、D208树脂等，把剩余色素去除即可。

该树脂针对的是萃取液中分子量较小的色素物质，该过程中GG的损失率小于5％，色素的去除率大于99％。

在本发明一个具体的实施方式中，脱色素过程中，工序三虽可达到去除色素的目的，但无工序二步骤的处理，色素去除率不到95％，会大幅影响GG的纯度。

在本发明一个优选的实施方式中，工序四中，所述膜浓缩方法采用膜浓缩设备，膜孔径为100～250Da。

在浓缩过程中，GG浓度可由2-5g/L提升至浓度大于100g/L。在浓缩的过程中，萃取液中的盐离子浓度可降低至300ppm以下。

虽可用离子交换树脂进行脱盐处理，但该过程会损失掉大于5％的GG，较工序四的GG损失率高。同时工序四在脱盐同时可以达到GG浓缩的目的。

在本发明一个优选的实施方式中，工序五中，所述脱水是通过包括但不限于蒸发装置如真空反应釜和旋转蒸发器等脱水装置，去除多余水分最终得到大于90％的GG纯品。

在本发明一个典型的优选实施方式中，提供上述方法所采用的纯化系统，该系统包括：过滤装置、第一色素脱除装置、第二色素脱除装置、脱盐装置和脱水装置；连接关系包括：

依次连接的过滤装置、第一色素脱除装置、第二色素脱除装置、脱盐装置和脱水装置；或者，

依次连接的过滤装置、第二色素脱除装置、第一色素脱除装置、脱盐装置和脱水装置；或者，

依次连接的过滤装置、脱盐装置、第一色素脱除装置、第二色素脱除装置和脱水装置；或者，

依次连接的过滤装置、脱盐装置、第二色素脱除装置、第一色素脱除装置和脱水装置；或者，

依次连接的过滤装置与其他后续装置的一种或多种任意组合。

所述过滤装置用于滤除萃取液中的杂质，所述过滤装置中设置有十级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，第一级滤膜孔径不小于500μm，优选第一级滤膜孔径500～1000μm，最后一级的滤膜孔径不大于2.0μm，优选最后一级的滤膜孔径为0.05-1.0μm，这种设计方式可以充分地、彻底地达到去除萃取液中杂质的目的，否则，会严重影响后续过程中GG的纯纯度，无法得到高纯度(纯度大于90％)的GG产品。过滤后，萃取液进入色素脱除装置。需要说明的是，这种过滤方式不会导致GG的损失。

所述第一色素脱除装置为膜浓缩设备，其中设置有色素脱除膜，色素脱除膜主要用于脱除萃取液中分子量大于500Da的色素(如叶绿素和类胡萝卜素等)，使GG以及分子量500Da以下的带有色素的物质和盐通过，但此步骤中，色素脱除膜只能脱除50％的色素，色素去除率不到95％，会严重影响最终得到的GG的纯度，因此，萃取液经过色素脱除膜后，还需要进一步脱除色素；需要说明的是，采用膜浓缩设备进行色素的脱除，不会导致GG的损失。

所述第二色素脱除装置为NM200型号的吸附树脂柱或D3520吸附树脂柱、NKA-9吸附树脂柱、HZ-802吸附树脂柱、D208吸附树脂柱等，该色素脱除过程针对的是萃取液中分子量500Da以下的带有色素的物质，通过吸附树脂柱的脱除，可使色素的去除率大于99％，此时，萃取液的主要成分为GG、盐分以及水，因此，还需要进行盐分的脱除。需要说明的是，采用吸附树脂柱进行色素的脱除，会导致GG的损失，但损失率小于5％。

所述脱盐装置为膜浓缩设备，膜的孔径为100-250Da，在该范围的孔径下，可以使萃取液中的盐分通过，但GG无法通过，同时，在脱盐时对萃取液进行浓缩，可同时实现GG的脱盐和浓缩，该过程中，GG的损失率小于3％。

需要说明的是，本发明中不能采用离子交换树脂进行脱盐处理，因为这种脱盐方式会损失掉大于5％的GG，这样会使最终得到的GG的纯度小于90％，无法得到高纯度的GG产品。

作为一种可选的实施方式，所述脱盐装置为GG吸附树脂柱，包括但不限于苯乙烯型大孔吸附树脂等，如D101树脂、XAD-1树脂等。该树脂对GG具有专一性吸附，不吸附盐、甘油等物质。GG吸附饱和后先使用数倍柱体积的纯水将柱子中参与的杂质洗脱，再用数倍10～60(v/v)％的乙醇将GG洗脱。

所述脱水装置对脱盐后和浓缩的萃取液进一步去除多余水分，最终得到纯度大于90％的GG纯品。

优选的，所述脱水装置包括真空反应釜和旋转蒸发器等。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

一种获得高含量GG藻细胞的养殖方法，包括以下步骤：

(1)获得培养后的藻细胞阶段：

将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m^-2·s^-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。

此阶段的培养时间为5-7天。

其中，所述淡水培养基的具体配方为Zarrouk培养基(详见表1和表2)。(2)GG生成阶段：

藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m^-2·s^-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。

其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为200mmol/L。

此阶段的培养时间为5-7天。

(3)GG拔高阶段一：

该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。

此阶段的培养时间为3-5天。

通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量11％(w/w)以上的藻细胞。

(4)GG拔高阶段二：

对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含900mmol/L氯化钠的Zarrouk培养基。

此阶段的培养时间为5天。

通过步骤(4)培养后，经检测，可以获得GG含量32％(w/w)以上的藻细胞。

实施例2

工序一，利用养殖所得的富含GG的螺旋藻，获得的含有不同浓度的GG低渗萃取原液产品。方法示例如下：

1)取100L经过获得高含量GG藻细胞的养殖方法(实施例1中)获得的藻泥，进行脱水。

2)加入100L无盐纯净水(低渗溶液)进行第一次萃取，经过藻水分离获得藻泥和100L的GG水溶液，GG浓度为28g/L。

3)对2)所得藻泥加入100L无盐纯净水进行第二次萃取，经过藻水分离获得藻泥和100L的GG水溶液，GG浓度为18g/L。

4)对3)所得藻泥加入100L无盐纯净水进行第三次萃取，经过藻水分离获得藻泥和100L的GG水溶液，GG浓度为10g/L。

5)对4)所得藻泥加入100L无盐纯净水进行第四次萃取，经过藻水分离获得藻泥和100L的GG水溶液，GG浓度为3g/L。

由于养殖过程中使用了高盐培养基以及萃取过程对藻细胞中色素的溶出，所获得的GG低渗萃取原液产品的主要成分为GG、无机盐、色素和水。

实施例3

利用工序一所得的GG低渗萃取原液产品通过工序二和/或工序三进行脱色素处理而获得的含有低色素浓度的GG产品。方法示例如下：

1)使用工序一进行低渗萃取，取实施例2中第一次萃取获得的含有28g/L GG的低渗萃取液10L用于后续处理。

2)将1)所得萃取液经过工序二的膜孔径为450Da脱色装置进行脱色，色素去除率达到了35.3％。

3)将2)中的溶液经过工序三的NM100树脂进行进一步脱色，色素总去除率达到90.2％。

经过以上两步工序获得了色素去除率达到90.2％的GG产品。

实施例4

利用工序一所得的GG低渗萃取原液产品通过工序四进行脱盐处理而获得的含有低盐浓度的GG产品。方法示例如下：

1)使用工序一进行低渗萃取，取实施例2中第二次萃取获得的含有18g/L GG的低渗萃取液25L用于后续处理，该萃取液的无机盐含量为2068ppm(电导率仪测定)。

2)将1)获得的萃取液经过工序四膜孔径为150Da的膜浓缩装置进行脱盐，脱盐后的萃取液的无机盐含量为212ppm。

经过以上两步工序获得了含有212ppm无机盐的GG产品。

实施例5

利用工序一所得的GG低渗萃取原液产品通过工序二和/或工序三、工序四进行脱色素和脱盐处理而获得的含有低色素、低盐浓度的GG产品。方法示例如下：

1)使用工序一进行低渗萃取，取实施例2中第一次萃取获得的含有28g/L GG的低渗萃取液15L用于后续处理，该萃取液的无机盐含量为3218ppm。

2)将1)获得的萃取液经过工序二的膜孔径为450Da脱色装置进行脱色，色素去除率达到了36.2％。

3)将2)获得的溶液经过工序三的NM100树脂进行进一步脱色，色素总去除率达到91.3％。

4)将3)获得的溶液经过工序四的膜孔径为150Da的膜浓缩装置进行脱盐，脱盐后的萃取液的无机盐含量为183ppm。

经过以上步骤获得了色素去除率91.3％和无机盐含量为183ppm的GG产品。

实施例6

利用工序一所得的GG低渗萃取原液产品或脱色所得的含有低色素浓度的GG产品或脱盐所得的含有低盐浓度的GG产品或脱色和脱盐后所得的含有低盐、低色素的GG产品均可通过工序五进行脱水获得不同GG浓度的GG产品。方法示例如下：

1)使用工序一进行低渗萃取，取实施例2中第四次萃取获得的含有3g/L GG的低渗萃取液20L用于脱水。

2)将1)所得萃取液放入50L的旋转蒸发仪中进行脱水，水浴温度为40℃。旋转蒸发3h后获得约500mlGG浓度为318g/L的GG产品。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种纯化甘油葡萄糖苷的方法，其特征是，该方法包括以下工序：

1)获取富含GG的低渗萃取液：取富含GG的微藻的藻泥进行脱水，然后加入低渗溶液进行萃取，经过藻水分离获得藻泥和GG水溶液，即萃取液；

2)将1)获得的萃取液采用膜浓缩方法进行脱色素处理，膜孔径为450Da；

3)将2)获得的溶液经过NM100树脂进行进一步脱色；

4)将3)获得的溶液经过膜孔径为150Da的膜浓缩装置进行脱盐，即得纯化后的甘油葡萄糖苷产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述低渗溶液为比微藻细胞内渗透压低的溶液；

所述富含GG的微藻是通过以下方法制备得到的：

获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：

GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，

GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；

在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L；

所述方法还包括采收步骤，该步骤包括：从GG拔高阶段一或GG拔高阶段二中的培养基中采收富集GG的微藻细胞，获得微藻藻泥；

在采收的步骤后还包括清洗步骤，该步骤包括：清洗微藻藻泥表面，去除表面附着物，获得洁净微藻藻泥。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是：所述低渗溶液包括洁净无盐水溶液、低盐水溶液、降低细胞渗透压的钾盐或镁盐水溶液。