CN110055293B

CN110055293B - 一种海藻糖的合成方法

Info

Publication number: CN110055293B
Application number: CN201910352575.2A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Zhengzhou Qianyi Food Co ltd
Current assignee: Zhengzhou Qianyi Food Co.,Ltd.
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN110055293A

Abstract

本发明公开了一种海藻糖的合成方法，属于制糖工业技术领域，本发明以双孢菇子实体、啤酒酵母菌糠等为原料，通过混合气体高压浸渍、超声糊化、冷藏解冻循环处理、培养基培养、高压脉冲破壁、去除蛋白、活性炭脱色、树脂脱盐脱色、结晶等过程完成海藻糖的合成。本发明针对目前合成海藻糖过程中，往往注重高活性酶得提取，而忽略了对产海藻糖原料的合理选择和利用，难以提升转化率，并且所得晶体品质较差的问题。

Description

一种海藻糖的合成方法

【技术领域】

本发明属于制糖工业技术领域，具体涉及一种海藻糖的合成方法。

【背景技术】

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生菌、真菌，以及一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。甚至在可以用于清理核污染的抗辐射型细菌如耐辐射球菌中也发现了海藻糖的存在。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用；增强农作物抗逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业。目前海藻糖广泛应用于食品、农业、医药等领域。

近年来，随着酶法制取海藻糖技术的兴起，寻求低成本、高产率的海藻糖制备工艺已成为国内外的研究热点。但目前海藻糖工业化生产过程中所用的酶多为游离酶，此酶具有不能回收、利用率低、难于分离纯化、使用成本高等缺点。

中国科技文献《海藻糖合成酶活性受固定化处理过程影响的研究》(冯金虎等发表于《微生物学通报》2003年06期)公开了采用多种固定化载体进行酶固定化研究，发现通过经戊二醛与壳聚糖交联后的载体与酶液作用，可吸附与海藻糖合成无关的杂酶和杂质，从而提高海藻糖合成酶的活性。通过比较固定化过程中与反应条件中多个因素的影响，得到了如下最佳作用条件：将酶液与经3％戊二醛交联18h后的滤纸作用18h，再与10％的淀粉溶液反应9h，与未经固定化作用比较，海藻糖的产率提高10倍，达到27.22g/L，转化率从5.33％提升到54.43％。该文献对固化处理工艺进行了深入研究，提出了采用戊二醛与壳聚糖交联后再进行固定化载体进行酶固定化的方法，可以大幅提高海藻糖的产率和转化率，通过以淀粉为底物的转化后，转化率可达到54.43％，但仍然有大量原料未被利用。

中国专利文献(专利号：CN103266152B)公开了“一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法”，该发明涉及一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：(1)将产酶菌株接种于发酵培养基中，培养30h～80h，制得发酵液；(2)将发酵液经菌体分离、菌体破壁、酶纯化，制得的海藻糖合成酶液；(3)进行交联包埋反应，制得固定化海藻糖合成酶；(4)将固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合，经转化、分离，制得海藻糖。该发明反应速度快、作用时间短、酶活稳定性，但对底物的作用效果有限，并不能很大程度上提高所用原料的海藻糖转化效果，其结晶工艺出现了常见的碎晶、伪晶、结块问题。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题：针对目前合成海藻糖过程中，往往注重高活性酶得提取，而忽略了对产海藻糖原料的合理选择和利用，难以提升转化率，并且所得晶体品质较差的问题，提供一种海藻糖的合成方法。

为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种海藻糖的合成方法，该合成方法包括如下步骤：

(1)取双孢菇子实体切块，用乙醇溶液洗涤，于25～32℃光照干燥，得干燥物，取干燥物按质量比5～8：10：1加入啤酒酵母菌糠料、蓖麻油混合搅拌，得搅拌料，取搅拌料按质量比1：12～20加入试剂A混合，于55～70℃，通入混合气体，控制压力达5.8～6.5MPa，保温保压，泄压，出料，得高压处理料；

(2)取高压处理料过滤，收集滤渣冷冻干燥，得冻干物，取冻干物用冻干物质量7～13％的水喷淋，超声糊化，得糊化料，取糊化料冰箱冷藏，微波解冻，并以此为一个冷冻解冻循环，进行该循环2～4次，得循环处理料；

(3)取循环处理料粉碎过筛，按质量比1：35～55接种至固体培养基中，于25～28℃培养4～8天，挑取菌丝按3％的接种量接种至种子培养基，于25～30℃培养5～7天，过滤，收集滤饼，得种子培养料，取种子培养料水洗，干燥，粉碎过筛，收集过筛颗粒按质量比1：0.1～0.3：7～13加入添加剂、乙醇溶液混合，捣碎匀浆，得匀浆料；

(4)取匀浆料按质量比1：30～45加入试剂B混合搅拌，泵送至高压脉冲电场处理室，在电场强度42～50kV/cm、脉冲数6～9个、脉冲宽度为5μs、脉冲频率20～30Hz条件下进行高压脉冲电场处理，得破壁提取液，取破壁提取液调节pH，于40～50℃静置沉降，离心，收集上清液脱色，泵入装有预处理树脂的层析柱进行处理，得纯化提取液；

(5)于50～70℃，取纯化提取液真空蒸发，得浓缩液A，取浓缩液A加入浓缩液A质量2～3倍乙醇溶液，震荡，于45～65℃下真空蒸发，得浓缩液B，取浓缩液B按质量比30～50：1加入晶种混合，降温至室温，得晶体混液，取晶体混液离心，收集离心物干燥，即得海藻糖。

优选地，所述步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料：取啤酒酵母菌糠按质量比5～8：1加入乙醇溶液混合，按球料质量比20～30：1加入氧化锆球磨珠，球磨，即得啤酒酵母菌糠料。

优选地，所述步骤(1)中的试剂A：按重量份数计，取10～15份磷脂、1～3份烟酸硫胺素、6～10份麦芽糖、2～5份肌醇、40～60份碳酸氢钙溶液混合，即得试剂A。

优选地，所述步骤(1)中的混合气体：按体积比4～8：1：25～35由乙烯、氧气、氩气混合，即得混合气体。

优选地，所述步骤(3)中的固体培养基：按质量比2～4：1取去皮马铃薯、水混合，灭菌，过滤，取滤饼按质量比20～40：2～5：3加入葡萄糖、琼脂粉混合均匀，以121℃高温蒸汽灭菌，冷却至40～55℃，调节pH，即得固体培养基。

优选地，所述步骤(3)中的种子培养基：按质量份数计，取100～150份去皮马铃薯、8～12份葡萄糖、2～5份酵母膏、1～3份磷酸氢二钾、6～10份蛋白胨、800～1000份水混合，灭菌，即得种子培养基。

优选地，所述步骤(3)中的添加剂：按质量比3～7：1：1取柠檬酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘油混合，即得添加剂。

优选地，所述步骤(4)中的试剂B：按质量比1：3～7：15～25取氯化钠、三氯乙酸、水混合，即得试剂B。

优选地，所述步骤(4)中的预处理树脂：按质量比3：1：10～15取大孔苯乙烯阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、热水混合，保温浸泡，调节pH，浸泡，过滤，取滤饼水洗至洗液为中性，干燥，即得预处理树脂。

优选地，所述步骤(5)中的晶种：按质量比5～8：3取粒径为180μm的海藻糖、粒径为125μm的海藻糖混合，即得晶种。

本发明与其他方法相比，有益技术效果是：

(1)本发明以富含海藻糖及其相关前体成分的双孢菇子实体、啤酒酵母菌糠等为原料，通过混合气体高压浸渍、超声糊化、冷藏解冻循环处理、培养基培养、高压脉冲破壁、去除蛋白、活性炭脱色、树脂脱盐脱色、结晶等过程完成海藻糖的合成；

(2)本发明采用含有乙烯、氩气、氧气的混合气体进行加压处理，有利于试剂A中的有效成分充分渗透进入搅拌料的组织细胞内部，使得组织细胞的呼吸作用减弱，降低了在处理过程中对自身多糖的消耗，使得糖类物质的浓度得到有效保持，其中，乙烯的加入可改变子实体、酵母菌糠组织细胞的细胞膜通透性，有利于活性成分快速渗透进入细胞内部，且其中较低浓度的氧气可部分满足植物细胞中有氧呼吸的需求，而该反应釜内热作用下也可致使碳酸氢钙分解出CO₂从内部进一步加压，而试剂A中麦芽糖、烟酸、肌醇等的加入可作为外源性营养物质，避免细胞自身大分子糖类的消耗，肌醇也可结合磷脂作为作为细胞的作用因子，改善其通透性，较高浓度的麦芽糖也可对植物细胞产生外源性胁迫，使其组织细胞活性降低，减弱其呼吸作用，很好地保持其内部的糖类；

(3)本发明以超声糊化以其空化效应等作用，软化植物细胞组织，冷藏解冻循环处理，再次起到外源性胁迫的作用，有效地刺激含海藻糖细胞发生非特异性作用，产生及利用海藻糖，对其细胞的保护，便于海藻糖成分的保有，提高本发明合成过程中海藻糖的收率，另外，添加剂中的十二烷基苯磺酸钠降低表面能、柠檬酸钠发挥络合金属离子的作用，也可协同提升破壁的效果，提高海藻糖的溶出，增大提取效果；

(4)本发明采用高压脉冲电场进行作用，植物细胞发生破壁、裂解或穿孔，促进其细胞内挥发性成分的释放，该处理过程在常温下进行的，不需要任何加热设备，处理过程中产生的热量比较少，可以很好地保持蛋白质等其它物质的活性，提高细胞内酶的活性，同时糖酵解通路中相关基因的表达量也得到提高，并且可以连续处理大批量的原料，所需时间短，具有很高的提取效率，另外，高压脉冲在应用于本发明过程中，植物细胞、残留酵母细胞等释放胞内物质的同时不会产生细胞碎片，处理过程无污染，也可减少后续分离纯化的负担，优化对海藻糖的提取；

(5)本发明以不同粒径的海藻糖作为晶种，在真空浓缩、缓慢降温结晶过程中诱发结晶，首先，真空蒸发至原体积的30～50％，提高其中的海藻糖的浓度，加入乙醇溶液稀释，而后降温，再次真空蒸发，加入不同粒径的晶种，并控制温度缓慢降低，能够使得晶体稳定有序生长，不易出现不良晶相，所得海藻糖晶相良好，转化率高，不易发生常见结晶工艺出现的碎晶、伪晶、结块问题；

(6)由表中实施例1～3可知实施例3为最优实施例，所得海藻糖收率最高，并比现有技术公布的对比例7、对比例8的收率高、晶型效果好。

【具体实施方式】

为便于更好地理解本发明，通过以下实例加以说明，这些实例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。

啤酒酵母菌糠料：取啤酒酵母菌糠按质量比5～8：1加入体积分数为70％的乙醇溶液于球磨罐混合，按球料质量比20～30：1加入氧化锆球磨珠，以350～550r/min球磨2～4h，即得啤酒酵母菌糠料。

添加剂：按质量比3～7：1：1取柠檬酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘油混合，即得添加剂。

预处理树脂：按质量比3：1：10～15取大孔苯乙烯阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、22～28℃热水混合，保温浸泡4～8h，用质量分数为20％的NaOH溶液调节pH至7.8～8.2，浸泡4～8h，过滤，取滤饼用水洗至洗液为中性，干燥，即得预处理树脂。

试剂A：按重量份数计，取10～15份磷脂、1～3份烟酸硫胺素、6～10份麦芽糖、2～5份肌醇、40～60份质量分数为8％碳酸氢钙溶液混合，即得试剂A。

试剂B：按质量比1：3～7：15～25取氯化钠、三氯乙酸、水混合，即得试剂B。混合气体：按体积比4～8：1：25～35由乙烯、氧气、氩气混合，即得混合气体。

晶种：按质量比5～8：3取粒径为180μm的海藻糖、粒径为125μm的海藻糖混合，即得晶种。

固体培养基：按质量比2～4：1取去皮马铃薯、水混合，于85～95℃加入30～45min，过滤，取滤饼按质量比20～40：2～5：3加入葡萄糖、琼脂粉混合均匀，以121℃高温蒸汽灭菌15～20min，自然冷却至40～55℃，加入质量分数为10％酒石酸溶液调节pH至3.5～4.2，即得固体培养基。

种子培养基：按质量份数计，取100～150份去皮马铃薯、8～12份葡萄糖、2～5份酵母膏、1～3份磷酸氢二钾、6～10份蛋白胨、800～1000份水混合，于121℃保温灭菌15～20min，即得种子培养基。

一种海藻糖的合成方法，包括如下步骤：

(1)取双孢菇子实体切成3×3×3mm³规格小块，用体积分数为70％的乙醇溶液洗涤2～4次后，于温度为25～32℃，光照强度为200～230Lux条件下的腔体内静置5～7天，得干燥物，取干燥物按质量比5～8：10：1加入啤酒酵母菌糠料、蓖麻油混合搅拌12～20min，得搅拌料，取搅拌料按质量比1：12～20加入试剂A于反应釜混合，于55～70℃，向釜内持续通入混合气体，控制至反应釜内压力达5.8～6.5MPa，保温保压10～15min，控制泄压速率为0.01～0.04MPa/min，待泄压至常压，打开反应釜，出料，得高压处理料；

(2)取高压处理料过滤，收集滤渣于-10℃冷冻干燥机干燥2～5h，得冻干物，取冻干物用冻干物质量7～13％的水进行喷淋后，移至超声处理器，以50～65kHz频率超声糊化7～13min，得糊化料，取糊化料于-5℃冰箱冷藏2～4h后，移至微波炉以400W解冻6～10min，并以此为一个冷冻解冻循环，进行该循环2～4次，得循环处理料；

(3)取循环处理料粉碎过80目筛，按质量比1：35～55接种至固体培养基中，于25～28℃培养4～8天，挑取菌丝按3％的接种量接种至种子培养基，于25～30℃培养5～7天，过滤，收集滤饼，得种子培养料，取种子培养料水洗，干燥，粉碎过80目筛，收集过筛颗粒按质量比1：0.1～0.3：7～13加入添加剂、质量分数为50％的乙醇溶液混合，捣碎匀浆，得匀浆料；

(4)取匀浆料按质量比1：30～45加入试剂B混合搅拌20～45min后，以10～15mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，在电场强度42～50kV/cm、脉冲数6～9个、脉冲宽度为5μs、脉冲频率20～30Hz条件下进行高压脉冲电场处理，得破壁提取液，取破壁提取液用浓度2mol/L的HCl溶液调节pH至4.0～4.5，于40～50℃静置沉降6～9h，移至离心机，以3000～5000r/min离心12～20min，收集上清液以活性炭脱色后，泵入装有预处理树脂的层析柱进行处理，得纯化提取液；

(5)于50～70℃，取纯化提取液真空蒸发至原体积的30～50％，得浓缩液A，取浓缩液A加入浓缩液A质量2～3倍体积分数为70％乙醇溶液，以200～250r/min震荡35～60min，再于45～65℃下真空蒸发至原体积的30～50％，得浓缩液B，取浓缩液B按质量比30～50：1加入晶种混合，以6～9℃/h速率降温至室温，得晶体混液，取晶体混液于离心机，以5000～8000r/min离心6～10min，收集离心物于50～70℃烘箱干燥12～16h，即得海藻糖。

实施例1

啤酒酵母菌糠料：取啤酒酵母菌糠按质量比5：1加入体积分数为70％的乙醇溶液于球磨罐混合，按球料质量比20：1加入氧化锆球磨珠，以350r/min球磨2h，即得啤酒酵母菌糠料。

添加剂：按质量比3：1：1取柠檬酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘油混合，即得添加剂。

预处理树脂：按质量比3：1：10取大孔苯乙烯阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、22℃热水混合，保温浸泡4～8h，用质量分数为20％的NaOH溶液调节pH至7.8，浸泡4h，过滤，取滤饼用水洗至洗液为中性，干燥，即得预处理树脂。

试剂A：按重量份数计，取10份磷脂、1份烟酸硫胺素、6份麦芽糖、2份肌醇、40份质量分数为8％碳酸氢钙溶液混合，即得试剂A。

试剂B：按质量比1：3：15取氯化钠、三氯乙酸、水混合，即得试剂B。混合气体：按体积比4：1：25由乙烯、氧气、氩气混合，即得混合气体。

晶种：按质量比5：3取粒径为180μm的海藻糖、粒径为125μm的海藻糖混合，即得晶种。

固体培养基：按质量比2：1取去皮马铃薯、水混合，于85℃加入30min，过滤，取滤饼按质量比20：2：3加入葡萄糖、琼脂粉混合均匀，以121℃高温蒸汽灭菌15min，自然冷却至40℃，加入质量分数为10％酒石酸溶液调节pH至3.5，即得固体培养基。

种子培养基：按质量份数计，取100份去皮马铃薯、8份葡萄糖、2份酵母膏、1份磷酸氢二钾、6份蛋白胨、800份水混合，于121℃保温灭菌15min，即得种子培养基。

一种海藻糖的合成方法，包括如下步骤：

(1)取双孢菇子实体切成3×3×3mm³规格小块，用体积分数为70％的乙醇溶液洗涤2次后，于温度为25℃，光照强度为200Lux条件下的腔体内静置7天，得干燥物，取干燥物按质量比5：10：1加入啤酒酵母菌糠料、蓖麻油混合搅拌12min，得搅拌料，取搅拌料按质量比1：12加入试剂A于反应釜混合，于55℃，向釜内持续通入混合气体，控制至反应釜内压力达5.8MPa，保温保压10～15min，控制泄压速率为0.01MPa/min，待泄压至常压，打开反应釜，出料，得高压处理料；

(2)取高压处理料过滤，收集滤渣于-10℃冷冻干燥机干燥2h，得冻干物，取冻干物用冻干物质量7％的水进行喷淋后，移至超声处理器，以50kHz频率超声糊化7min，得糊化料，取糊化料于-5℃冰箱冷藏2h后，移至微波炉以400W解冻6min，并以此为一个冷冻解冻循环，进行该循环2次，得循环处理料；

(3)取循环处理料粉碎过80目筛，按质量比1：35接种至固体培养基中，于25℃培养4天，挑取菌丝按3％的接种量接种至种子培养基，于25℃培养5天，过滤，收集滤饼，得种子培养料，取种子培养料水洗，干燥，粉碎过80目筛，收集过筛颗粒按质量比1：0.1～0.3：7加入添加剂、质量分数为50％的乙醇溶液混合，捣碎匀浆，得匀浆料；

(4)取匀浆料按质量比1：30加入试剂B混合搅拌20min后，以10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，在电场强度42kV/cm、脉冲数9个、脉冲宽度为5μs、脉冲频率20Hz条件下进行高压脉冲电场处理，得破壁提取液，取破壁提取液用浓度2mol/L的HCl溶液调节pH至4.0，于40℃静置沉降6h，移至离心机，以3000r/min离心20min，收集上清液以活性炭脱色后，泵入装有预处理树脂的层析柱进行处理，得纯化提取液；

(5)于50℃，取纯化提取液真空蒸发至原体积的50％，得浓缩液A，取浓缩液A加入浓缩液A质量2倍体积分数为70％乙醇溶液，以200r/min震荡35min，再于45～65℃下真空蒸发至原体积的30％，得浓缩液B，取浓缩液B按质量比30：1加入晶种混合，以6℃/h速率降温至室温，得晶体混液，取晶体混液于离心机，以5000r/min离心6～10min，收集离心物于50℃烘箱干燥12h，即得海藻糖。

实施例2

啤酒酵母菌糠料：取啤酒酵母菌糠按质量比8：1加入体积分数为70％的乙醇溶液于球磨罐混合，按球料质量比30：1加入氧化锆球磨珠，以550r/min球磨4h，即得啤酒酵母菌糠料。

添加剂：按质量比7：1：1取柠檬酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘油混合，即得添加剂。

预处理树脂：按质量比3：1：15取大孔苯乙烯阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、28℃热水混合，保温浸泡8h，用质量分数为20％的NaOH溶液调节pH至8.2，浸泡8h，过滤，取滤饼用水洗至洗液为中性，干燥，即得预处理树脂。

试剂A：按重量份数计，取15份磷脂、3份烟酸硫胺素、10份麦芽糖、5份肌醇、60份质量分数为8％碳酸氢钙溶液混合，即得试剂A。

试剂B：按质量比1：7：25取氯化钠、三氯乙酸、水混合，即得试剂B。混合气体：按体积比4～8：1：35由乙烯、氧气、氩气混合，即得混合气体。

固体培养基：按质量比2：1取去皮马铃薯、水混合，于85℃加入30min，过滤，取滤饼按质量比40：5：3加入葡萄糖、琼脂粉混合均匀，以121℃高温蒸汽灭菌20min，自然冷却至55℃，加入质量分数为10％酒石酸溶液调节pH至4.2，即得固体培养基。

种子培养基：按质量份数计，取150份去皮马铃薯、12份葡萄糖、5份酵母膏、3份磷酸氢二钾、10份蛋白胨、1000份水混合，于121℃保温灭菌20min，即得种子培养基。

一种海藻糖的合成方法，包括如下步骤：

(1)取双孢菇子实体切成3×3×3mm³规格小块，用体积分数为70％的乙醇溶液洗涤4次后，于温度为32℃，光照强度为230Lux条件下的腔体内静置7天，得干燥物，取干燥物按质量比8：10：1加入啤酒酵母菌糠料、蓖麻油混合搅拌20min，得搅拌料，取搅拌料按质量比1：20加入试剂A于反应釜混合，于70℃，向釜内持续通入混合气体，控制至反应釜内压力达6.5MPa，保温保压15min，控制泄压速率为0.04MPa/min，待泄压至常压，打开反应釜，出料，得高压处理料；

(2)取高压处理料过滤，收集滤渣于-10℃冷冻干燥机干燥5h，得冻干物，取冻干物用冻干物质量13％的水进行喷淋后，移至超声处理器，以65kHz频率超声糊化13min，得糊化料，取糊化料于-5℃冰箱冷藏4h后，移至微波炉以400W解冻10min，并以此为一个冷冻解冻循环，进行该循环4次，得循环处理料；

(3)取循环处理料粉碎过80目筛，按质量比1：55接种至固体培养基中，于25～28℃培养8天，挑取菌丝按3％的接种量接种至种子培养基，于30℃培养7天，过滤，收集滤饼，得种子培养料，取种子培养料水洗，干燥，粉碎过80目筛，收集过筛颗粒按质量比1：0.1～0.3：13加入添加剂、质量分数为50％的乙醇溶液混合，捣碎匀浆，得匀浆料；

(4)取匀浆料按质量比1：45加入试剂B混合搅拌45min后，以15mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，在电场强度50kV/cm、脉冲数9个、脉冲宽度为5μs、脉冲频率30Hz条件下进行高压脉冲电场处理，得破壁提取液，取破壁提取液用浓度2mol/L的HCl溶液调节pH至4.5，于50℃静置沉降9h，移至离心机，以5000r/min离心20min，收集上清液以活性炭脱色后，泵入装有预处理树脂的层析柱进行处理，得纯化提取液；

(5)于70℃，取纯化提取液真空蒸发至原体积的50％，得浓缩液A，取浓缩液A加入浓缩液A质量3倍体积分数为70％乙醇溶液，以250r/min震荡60min，再于65℃下真空蒸发至原体积的50％，得浓缩液B，取浓缩液B按质量比50：1加入晶种混合，以6～9℃/h速率降温至室温，得晶体混液，取晶体混液于离心机，以8000r/min离心10min，收集离心物于70℃烘箱干燥16h，即得海藻糖。

实施例3

啤酒酵母菌糠料：取啤酒酵母菌糠按质量比6：1加入体积分数为70％的乙醇溶液于球磨罐混合，按球料质量比25：1加入氧化锆球磨珠，以450r/min球磨2～4h，即得啤酒酵母菌糠料。

添加剂：按质量比5：1：1取柠檬酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘油混合，即得添加剂。

预处理树脂：按质量比3：1：12取大孔苯乙烯阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、25℃热水混合，保温浸泡4～8h，用质量分数为20％的NaOH溶液调节pH至7.9，浸泡6h，过滤，取滤饼用水洗至洗液为中性，干燥，即得预处理树脂。

试剂A：按重量份数计，取12份磷脂、2份烟酸硫胺素、8份麦芽糖、3份肌醇、50份质量分数为8％碳酸氢钙溶液混合，即得试剂A。

试剂B：按质量比1：5：20取氯化钠、三氯乙酸、水混合，即得试剂B。混合气体：按体积比4～8：1：30由乙烯、氧气、氩气混合，即得混合气体。

晶种：按质量比6：3取粒径为180μm的海藻糖、粒径为125μm的海藻糖混合，即得晶种。

固体培养基：按质量比3：1取去皮马铃薯、水混合，于90℃加入33min，过滤，取滤饼按质量比30：3：3加入葡萄糖、琼脂粉混合均匀，以121℃高温蒸汽灭菌18min，自然冷却至50℃，加入质量分数为10％酒石酸溶液调节pH至3.8，即得固体培养基。

种子培养基：按质量份数计，取120份去皮马铃薯、10份葡萄糖、3份酵母膏、2份磷酸氢二钾、8份蛋白胨、900份水混合，于121℃保温灭菌18min，即得种子培养基。

一种海藻糖的合成方法，包括如下步骤：

(1)取双孢菇子实体切成3×3×3mm³规格小块，用体积分数为70％的乙醇溶液洗涤3次后，于温度为28℃，光照强度为220Lux条件下的腔体内静置6天，得干燥物，取干燥物按质量比6：10：1加入啤酒酵母菌糠料、蓖麻油混合搅拌17min，得搅拌料，取搅拌料按质量比1：16加入试剂A于反应釜混合，于63℃，向釜内持续通入混合气体，控制至反应釜内压力达6.1MPa，保温保压12min，控制泄压速率为0.03MPa/min，待泄压至常压，打开反应釜，出料，得高压处理料；

(2)取高压处理料过滤，收集滤渣于-10℃冷冻干燥机干燥3h，得冻干物，取冻干物用冻干物质量10％的水进行喷淋后，移至超声处理器，以60kHz频率超声糊化10min，得糊化料，取糊化料于-5℃冰箱冷藏3h后，移至微波炉以400W解冻8min，并以此为一个冷冻解冻循环，进行该循环3次，得循环处理料；

(3)取循环处理料粉碎过80目筛，按质量比1：45接种至固体培养基中，于26℃培养6天，挑取菌丝按3％的接种量接种至种子培养基，于28℃培养6天，过滤，收集滤饼，得种子培养料，取种子培养料水洗，干燥，粉碎过80目筛，收集过筛颗粒按质量比1：0.1～0.3：10加入添加剂、质量分数为50％的乙醇溶液混合，捣碎匀浆，得匀浆料；

(4)取匀浆料按质量比1：38加入试剂B混合搅拌33min后，以12mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，在电场强度46kV/cm、脉冲数8个、脉冲宽度为5μs、脉冲频率25Hz条件下进行高压脉冲电场处理，得破壁提取液，取破壁提取液用浓度2mol/L的HCl溶液调节pH至4.2，于40～50℃静置沉降8h，移至离心机，以4000r/min离心16min，收集上清液以活性炭脱色后，泵入装有预处理树脂的层析柱进行处理，得纯化提取液；

(5)于50～70℃，取纯化提取液真空蒸发至原体积的40％，得浓缩液A，取浓缩液A加入浓缩液A质量2～3倍体积分数为70％乙醇溶液，以220r/min震荡48min，再于65℃下真空蒸发至原体积的40％，得浓缩液B，取浓缩液B按质量比40：1加入晶种混合，以8℃/h速率降温至室温，得晶体混液，取晶体混液于离心机，以7000r/min离心8min，收集离心物于60℃烘箱干燥14h，即得海藻糖。

对比例1

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的缺少步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料、步骤(1)中的试剂A、步骤(3)中的添加剂、步骤(5)中的晶种、步骤(4)中的试剂B替换为等量的水。

对比例2

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是缺少步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料。

对比例3

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是缺少步骤(1)中的试剂A。

对比例4

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是步骤(4)中的试剂B替换为等量的水。

对比例5

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是缺少步骤(3)中的添加剂。

对比例6

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是缺少步骤(5)中的晶种。

对比例7

采用中国专利文献(专利号：CN108130351A)公开了“大颗粒海藻糖制备方法”，实施例1～3的工艺制备海藻糖。

对比例8

采用中国专利文献(专利号：CN103266152B)公开了“一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法”，实施例1～6的工艺制备海藻糖。

对比例9

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料的质量为干燥物的16％、步骤(1)中搅拌料质量12倍的试剂A、步骤(3)中的添加剂为过筛颗粒质量的10％、步骤(5)中的晶种为浓缩液B质量的2％、步骤(4)中的试剂B为匀浆料质量的30倍。

对比例10

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料的质量为干燥物的18％、步骤(1)中搅拌料质量20倍的试剂A、步骤(3)中的添加剂为过筛颗粒质量的30％、步骤(5)中的晶种为浓缩液B质量的3.2％、步骤(4)中的试剂B为匀浆料质量的45倍。

对比例11

与实施例3的制备工艺基本相同，唯有不同的是步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料的质量为干燥物的20％、步骤(1)中的搅拌料质量16倍的试剂A、步骤(3)中的添加剂为过筛颗粒质量的20％、步骤(5)中的晶种为浓缩液B质量的3％、步骤(4)中的试剂B为匀浆料质量的36倍。

对上述实施例和对比例进行性能测试：

对上述实施例和对比例中的所得海藻糖进行实验，海藻糖含量检测方法按GB/T23529-2009，由高效液相色谱法检测。转化率为海藻糖产量(g)与海藻糖供体(g)的比值乘以100％，其中，对比例7的海藻糖供体为淀粉、对比例8的海藻糖供体为麦芽糖底物，实施例1～3、对比例1～6、对比例8～11的海藻糖供体为步骤(3)所制匀浆料。转化率的高低可以直接反应该海藻糖合成应用效果的好坏。对海藻糖转化率的比较、海藻糖性质的测定，检测结果分别如表1、表2所示：

表1、海藻糖转换率比较

表2、海藻糖性质测定

由上表可知：

(1)由表中实施例1～3可知实施例3为最优实施例，所得海藻糖收率最高，并比现有技术公布的对比例7、对比例8的收率高、晶型效果好。

(2)由实施例3和对比例9-11的数据可见步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料、步骤(1)中的试剂A、步骤(3)中的添加剂、步骤(5)中的晶种、步骤(4)中的试剂B在制备海藻糖的过程中起到，显著提高了海藻糖的转化率、改善晶型等效果，如若缺少则海藻糖转化率低、出现碎晶、伪晶的问题。

(3)由对比例6、对比例1～5、对比例9～11可见缺少晶种，所成晶型会出现步骤(5)中的碎晶、伪晶的问题；由对比例2和实施例3相比，可知缺少步骤(1)中的啤酒酵母菌糠料，则海藻糖转化率较明显降低；对比例3和实施例3相比，可知缺少步骤(1)中的试剂A，则海藻糖转化率较显著降低；对比例4和实施例3相比，可知缺少步骤(4)中的试剂B替换为等量的水，则海藻糖转化率较显著降低；对比例5和实施例3相比，可知缺少步骤(3)中的添加剂，则海藻糖转化率较显著降低。

(4)由表2可知实施例3达到海藻糖国标优级标准，实施例1～2、对比例9～11达到国标一级标准，对比例1～8品级较低，其中缺少多个组分的对比例1，尤为明显。

(5)本发明以富含海藻糖及其相关前体成分的双孢菇子实体、啤酒酵母菌糠等为原料，通过混合气体高压浸渍、超声糊化、冷藏解冻循环处理、培养基培养、高压脉冲破壁、去除蛋白、活性炭脱色、树脂脱盐脱色、结晶等过程完成海藻糖的合成；

(6)本发明采用含有乙烯、氩气、氧气的混合气体进行加压处理，有利于试剂A中的有效成分充分渗透进入搅拌料的组织细胞内部，使得组织细胞的呼吸作用减弱，降低了在处理过程中对自身多糖的消耗，使得糖类物质的浓度得到有效保持，其中，乙烯的加入可改变子实体、酵母菌糠组织细胞的细胞膜通透性，有利于活性成分快速渗透进入细胞内部，且其中较低浓度的氧气可部分满足植物细胞中有氧呼吸的需求，而该反应釜内热作用下也可致使碳酸氢钙分解出CO₂从内部进一步加压，而试剂A中麦芽糖、烟酸、肌醇等的加入可作为外源性营养物质，避免细胞自身大分子糖类的消耗，肌醇也可结合磷脂作为作为细胞的作用因子，改善其通透性，较高浓度的麦芽糖也可对植物细胞产生外源性胁迫，使其组织细胞活性降低，减弱其呼吸作用，很好地保持其内部的糖类；

(7)本发明以超声糊化以其空化效应等作用，软化植物细胞组织，冷藏解冻循环处理，再次起到外源性胁迫的作用，有效地刺激含海藻糖细胞发生非特异性作用，产生及利用海藻糖，对其细胞的保护，便于海藻糖成分的保有，提高本发明合成过程中海藻糖的收率，另外，添加剂中的十二烷基苯磺酸钠降低表面能、柠檬酸钠发挥络合金属离子的作用，也可协同提升破壁的效果，提高海藻糖的溶出，增大提取效果；

(8)本发明采用高压脉冲电场进行作用，植物细胞发生破壁、裂解或穿孔，促进其细胞内挥发性成分的释放，该处理过程在常温下进行的，不需要任何加热设备，处理过程中产生的热量比较少，可以很好地保持蛋白质等其它物质的活性，提高细胞内酶的活性，同时糖酵解通路中相关基因的表达量也得到提高，并且可以连续处理大批量的原料，所需时间短，具有很高的提取效率，另外，高压脉冲在应用于本发明过程中，植物细胞、残留酵母细胞等释放胞内物质的同时不会产生细胞碎片，处理过程无污染，也可减少后续分离纯化的负担，优化对海藻糖的提取；

(9)本发明以不同粒径的海藻糖作为晶种，在真空浓缩、缓慢降温结晶过程中诱发结晶，首先，真空蒸发至原体积的30～50％，提高其中的海藻糖的浓度，加入乙醇溶液稀释，而后降温，再次真空蒸发，加入不同粒径的晶种，并控制温度缓慢降低，能够使得晶体稳定有序生长，不易出现不良晶相，所得海藻糖晶相良好，转化率高，不易发生常见结晶工艺出现的碎晶、伪晶、结块问题；

综上所述，本发明所制海藻糖，转化率高，成晶效果好，品级高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种海藻糖的合成方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

（1）取双孢菇子实体切块，用乙醇溶液洗涤，于25~32℃光照干燥，得干燥物，取干燥物按质量比5~8：10：1加入啤酒酵母菌糠料、蓖麻油混合搅拌，得搅拌料，取搅拌料按质量比1：12~20加入试剂A混合，于55~70℃，通入混合气体，控制压力达5.8~6.5MPa，保温保压，泄压，出料，得高压处理料；按重量份数计，取10~15份磷脂、1~3份烟酸硫胺素、6~10份麦芽糖、2~5份肌醇、40~60份碳酸氢钙溶液混合，即得试剂A；按体积比4~8：1：25~35由乙烯、氧气、氩气混合即得混合气体；

取啤酒酵母菌糠按质量比5~8：1加入乙醇溶液混合，按球料质量比20~30：1加入氧化锆球磨珠，球磨，即得啤酒酵母菌糠料；

（2）取高压处理料过滤，收集滤渣冷冻干燥，得冻干物，取冻干物用冻干物质量7~13%的水喷淋，超声糊化，得糊化料，取糊化料冰箱冷藏，微波解冻，并以此为一个冷冻解冻循环，进行该循环2~4次，得循环处理料；

（3）取循环处理料粉碎过筛，按质量比1：35~55接种至固体培养基中，于25~28℃培养4~8天，挑取菌丝按3%的接种量接种至种子培养基，于25~30℃培养5~7天，过滤，收集滤饼，得种子培养料，取种子培养料水洗，干燥，粉碎过筛，收集过筛颗粒按质量比1：0.1~0.3：7~13加入添加剂、乙醇溶液混合，捣碎匀浆，得匀浆料；按质量比3~7：1：1取柠檬酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘油混合，即得添加剂；

（4）取匀浆料按质量比1：30~45加入试剂B混合搅拌，泵送至高压脉冲电场处理室，在电场强度42~50kV/cm、脉冲数6~9个、脉冲宽度为5μs、脉冲频率20~30Hz条件下进行高压脉冲电场处理，得破壁提取液，取破壁提取液调节pH，于40~50℃静置沉降，离心，收集上清液脱色，泵入装有预处理树脂的层析柱进行处理，得纯化提取液；按质量比1：3~7：15~25取氯化钠、三氯乙酸、水混合，即得试剂B；

（5）于50~70℃，取纯化提取液真空蒸发，得浓缩液A，取浓缩液A加入浓缩液A质量2~3倍乙醇溶液，震荡，于45~65℃下真空蒸发，得浓缩液B，取浓缩液B按质量比30~50：1加入晶种混合，降温至室温，得晶体混液，取晶体混液离心，收集离心物干燥，即得海藻糖。

2.根据权利要求1所述一种海藻糖的合成方法，其特征在于，所述步骤（3）中的固体培养基：按质量比2~4：1取去皮马铃薯、水混合，灭菌，过滤，取滤饼按质量比20~40：2~5：3加入葡萄糖、琼脂粉混合均匀，以121℃高温蒸汽灭菌，冷却至40~55℃，调节pH，即得固体培养基。

3.根据权利要求1所述一种海藻糖的合成方法，其特征在于，所述步骤（3）中的种子培养基：按质量份数计，取100~150份去皮马铃薯、8~12份葡萄糖、2~5份酵母膏、1~3份磷酸氢二钾、6~10份蛋白胨、800~1000份水混合，灭菌，即得种子培养基。

4.根据权利要求1所述一种海藻糖的合成方法，其特征在于，所述步骤（4）中的预处理树脂：按质量比3：1：10~15取大孔苯乙烯阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、热水混合，保温浸泡，调节pH，浸泡，过滤，取滤饼水洗至洗液为中性，干燥，即得预处理树脂。

5.根据权利要求1所述一种海藻糖的合成方法，其特征在于，所述步骤（5）中的晶种：按质量比5~8：3取粒径为180μm的海藻糖、粒径为125μm的海藻糖混合，即得晶种。