ES2625483T3 - Extracto de microalgas que contiene ácidos grasos omega 3-poliinsaturados y método para extraer aceite de microorganismos - Google Patents

Extracto de microalgas que contiene ácidos grasos omega 3-poliinsaturados y método para extraer aceite de microorganismos Download PDF

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Abstract

Extracto de microalgas bifasico que comprende 15-95 % en peso de una fase acuosa y 5-85 % en peso de una fase oleosa, dicho extracto que contiene al menos 1% en peso de acidos grasos de acidos grasos w3 totales seleccionados del grupo consistente en acido eicosapentanoico (EPA), acido docosahexaenoico (DHA) y combinaciones de los mismos, dicho extracto ademas estando caracterizado por el hecho de que contiene: * 40-100% en peso de la fase oleosa de lipidos seleccionados de trigliceridos, digliceridos, monogliceridos, fosfatidos, acidos grasos libres y combinaciones de los mismos; * 0,01-10% de carotenoides en peso de la fase oleosa; * 0,5-10% de cloruro sodico en peso de la fase acuosa; * 0-3 % en peso de material no disuelto aparte de las gotitas dispersas de fase acuosa o fase oleosa; y * 0-10% de monoalcohol C1-5 en peso de la fase acuosa.

Description

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DESCRIPCION
Extracto de microalgas que contiene acidos grasos ro3-poliinsaturados y metodo para extraer aceite de microorganismos
CAMPO TECNICO DE LA INVENCION
[0001] La presente invencion se refiere a un extracto de microalgas que contiene acidos grasos <b3- poliinsaturados seleccionados del grupo consistente en acido eicosapentanoico (EPA), acido docosahexaenoico (DHA) y combinaciones de los mismos.
[0002] La invencion tambien proporciona procesos para la extraccion de una fase oleosa de biomasa humeda de microorganismos, por ejemplo, de biomasa humeda de microalgas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0003] Acido eicosapentanoico (EPA; 20:5n-3) y acido docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3) son acidos grasos w3-poliinsaturados que son activos metabolicamente.
Un gran numero de estudios cientfficos han producido datos que sugieren que EPA y/o DHA son beneficiosos en la prevencion y tratamiento de una variedad de condiciones medicas, incluyendo cardiopatfa coronaria, agregacion de plaquetas en sangre, niveles de colesterol anormales etc.
[0004] EPA y/o DHA pueden provenir de aceite de pescado, por ejemplo, aceite de pescado de hfgado de bacalao, sardina arenque, arenque americano, atun, pez saurio y mojol.
Sin embargo, el aceite de pescado fluctua en cuanto a precio y calidad.
Ademas, hay intereses con relacion a la contaminacion del aceite de pescado con pesticidas y metales pesados.
Asf, hay un creciente interes en otra fuente natural de los anteriormente mencionados acidos grasos <b3, es decir microalgas.
[0005] La extraccion de <b3-PUFA de microalgas plantea un gran desaffo.
Tfpicamente, bioseparacion de <b3-PUFA de microalgas implica eliminacion de insolubles, aislamiento de productos, purificacion y pulido.
La primera fase en la recuperacion posterior de acidos grasos poliinsaturados (PUFA) de microalgas es la extraccion.
La extraccion deberia ser rapida, eficaz y suave para reducir la degradacion de los lfpidos o acidos grasos. Como se explica por Robles Medina et al. (Biotechnology Advances, Vol. 16, No. 3, (1998), 517-580)): "Los solventes de extraccion deberian ser economicos, volatiles (para eliminacion mas tarde), libre de impurezas toxicas o reactivas (para evitar reaccion con los lfpidos), capaz de formar un sistema bifasico con agua (para eliminar no lfpidos), y ser extractores pobres de componentes no deseados (por ejemplo, proteolfpidos, moleculas pequenas).
[0006] Diferentes tecnicas de extraccion de solvente para el aislamiento de <b3-PUFA de microalgas se han descrito en la tecnica anterior. Frecuentemente, la biomasa de microalgas esta sujeta a rotura celular antes de ser contactada con el solvente de extraccion para maximizar la recuperacion de productos intracelulares. La rotura celular se puede conseguir por homogeneizacion de alta presion, agitacion en presencia de vidrio y perlas ceramicas en molinos de esferas, ultrasonidos, lisis qufmica o por trituracion de la biomasa seca.
En procesos comerciales la biomasa de microalgas liofilizada seca se usa normalmente como una materia prima para el proceso de extraccion de solvente ya que produce altos rendimientos de extraccion.
[0007] Se conoce en la tecnica que hexano, cloroformo, eter dietNico y etanol pueden extraer <b3-PUFA tal como EPA y DHA.
Solventes apolares tales como cloroformo, hexano o eter dietflico ofrecen la ventaja de que contaminantes no lipfdicos diffcilmente se disuelven en estos solventes.
Sin embargo, estos solventes apolares no extraen completamente lfpidos polares (por ejemplo, fosfatidos y glicolfpidos) debido a su solubilidad limitada en estos solventes.
Para optimizar rendimientos de extraccion, experimentos han sido conducidos con una variedad de mezclas de solvente, por ejemplo, hexano/etanol, hexano-isopropanol y cloroformo/metanol/agua.
El etanol es capaz de extraer <b3-PUFA de microalgas en rendimientos relativamente altos.
Sin embargo, etanol tambien extraera agua y una gama amplia de componentes polares.
Esta es la razon por la que se ha defendido someter los extractos de etanol a otra extraccion de solvente con un solvente apolar o una fase de aislamiento (por ejemplo, cromatograffa) para separar una fraccion enriquecida con lfpidos.
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[0008] A.R. Fajardo et al. (Eur. J. Lipid Sci. Tehcnol. 109 (2007) 120-126) describe un metodo para la extraccion de Kpidos de microalgas (Phyaeodactylym tricomutum) comprendiendo las etapas siguientes:
• combinar biomasa liofilizada con etanol y agitar durante 24 horas a temperatura ambiente;
• filtracion para producir un extracto crudo;
• adicion de agua y hexano al extracto crudo para producir un sistema bifasico; y
• separation del sistema bifasico en una fase hexanica y una fase hidroalcoholica.
[0009] Metodos existentes para el aislamiento de <b3-PUFA de microalgas sufren un numero de inconvenientes.
Ante todo, muchos si no todos estos metodos emplean solventes apolares tales como hexano, cloroformo o eter dietflico.
La manipulation de estos solventes plantea un riesgo para la seguridad ya que estos son altamente explosivos y/o toxicos.
Ademas, estos solventes apolares deben ser esencialmente completamente quitados del producto final (<b3- PUFA que contienen aceite), ya que solo niveles bajos de estos solventes se permiten en ingredientes alimenticios.
[0010] Otro inconveniente de metodos de aislamiento existentes reside en su complejidad, sobre todo el numero de etapas de aislamiento empleadas y/o la necesidad para derivation de <b3-PUFA que contienen Kpidos.
[0011] EP-A 1 178 118 describe un proceso para obtener un aceite de celulas microbianas, el proceso comprende:
a) interrumpir las paredes celulares de las celulas microbianas para liberar el aceite; y
b) separar el aceite de al menos parte del detrito de pared celular formado en (a).
[0012] Los ejemplos de esta solicitud de patente europea describen procesos donde un hongo (Mortierella alpina) y un alga (Crypthecodinium cohnii) se interrumpen por homogeneizacion de alta presion, seguido de centrifugacion que produce una capa superior oleosa y una capa acuosa inferior con el detrito celular.
RESUMEN DE LA INVENCION
[0013] Los presentes inventores han disenado procesos alternativos para el aislamiento de <b3-PUFA de microalgas que evitan al menos algunos de los inconvenientes anteriormente mencionados.
Los procesos segun la presente invention comienzan a partir de biomasa de microalgas humeda, no requiere el uso de solventes organicos apolares y produce un extracto bifasico que puede facilmente ser procesado posteriormente para producir aceite que contiene <b3-PUFA con un rendimiento elevado o que se puede utilizar como tal, por ejemplo, en la produccion de pienso para animales.
El extracto bifasico obtenido por los presentes procesos comprende una fase oleosa y una fase acuosa que juntas contienen esencialmente todo el material lipfdico que fue originalmente contenido en la biomasa humeda, es decir lfpidos apolares (por ejemplo, trigliceridos, acidos grasos libres) y lfpidos polares (por ejemplo, glicolfpidos, fosfolfpidos).
[0014] Asf, un aspecto de la presente invencion se refiere a un extracto de microalgas bifasicas que incluye una fase acuosa y una fase oleosa, dicho extracto siendo caracterizado por el hecho de que contiene:
• 40-100% en peso de la fase oleosa de lfpidos seleccionados de trigliceridos, digliceridos, monogliceridos, fosfatidos, acidos grasos libres y combinaciones de los mismos;
• 0,01-10% en peso de carotenoides de la fase oleosa;
• 0,5-10% en peso de cloruro sodico de la fase acuosa;
• 0-3 % en peso de material no disuelto diferente de las gotitas dispersas de fase acuosa o fase oleosa; y
• 0-10% en peso de monoalcohol C1-5 de la fase acuosa.
[0015] Otro aspecto de la invencion se refiere a un proceso de extraccion de una fase oleosa a partir de un extracto bifasico como se ha descrito anteriormente, dicho proceso que comprende:
- combinar biomasa de microalgas humeda con una preparation enzimatica teniendo actividad celulasa, P- glucanasa o P-glucosidasa;
- permitir a la preparacion enzimatica degradar las paredes celulares de las microalgas;
- aislar desde la biomasa tratada con enzimas al menos 20% en peso de un lfquido de la biomasa de microalgas humeda, dicho lfquido siendo un extracto bifasico comprendiendo 50-90 % en peso de una fase acuosa y 5-50 % en peso de una fase oleosa; y
- separar la fase oleosa desde la fase acuosa.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
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[0016] Por consiguiente, un primer aspecto de la invencion se refiere a un extracto de microalgas bifasicas que comprende 15-95 % en peso de una fase acuosa y 5-85 % en peso de una fase oleosa, dicho extracto que contiene al menos 1% en peso de acidos grasos totales de acidos grasos w3 seleccionados del grupo que consiste en acido eicosapentanoico (EPA), acido docosahexaenoico (DHA) y combinaciones de los mismos, dicho extracto ademas estando caracterizado por el hecho de que contiene:
• 40-100% en peso de la fase oleosa de Kpidos seleccionados de trigliceridos, digliceridos, monogliceridos, fosfatidos, acidos grasos libres y combinaciones de los mismos;
• 0,01-10% de carotenoides en peso de la fase oleosa;
• 0,5-10% de cloruro sodico en peso de la fase acuosa;
• 0-3 % en peso de material no disuelto diferente de las gotitas dispersas de fase acuosa o fase oleosa; y
• 0-10% en peso de monoalcohol C1-5 de la fase acuosa.
[0017] El termino "extracto bifasico" como se utiliza en este caso se refiere a un extracto que comprende al menos una fase acuosa y una fase oleosa.
Asf, el termino "extracto bifasico" tambien abarca emulsiones que comprenden tres o mas fases, por ejemplo, una emulsion de agua-en-aceite-en-agua o una emulsion que contiene otra fase que es inmiscible con la fase acuosa o la fase oleosa.
Preferiblemente, el extracto bifasico esencialmente consiste en dos fases separadas, es decir la fase acuosa y la fase oleosa.
[0018] Siempre que se hace referencia aqu a una concentracion de acido graso, a menos que se indique lo contrario, dicha concentracion se calcula en peso de la cantidad total de acidos grasos, incluyendo acidos grasos libres y acidos grasos contenidos en los esteres de acido graso tal como glicerido y esteres de fosfato.
[0019] Segun una forma de realization particularmente preferida, el extracto de microalgas bifasicas comprende 20-90 % en peso de una fase acuosa y 10-80 % en peso de una fase oleosa.
De la forma mas preferible, el extracto de microalgas bifasicas comprende 30-85 % en peso de una fase acuosa y 15-70 % en peso de una fase oleosa.
[0020] La fase oleosa del presente extracto bifasico contiene preferiblemente 50-100%, mas preferiblemente 70-100%, y de la forma mas preferible 85-100% en peso de la fase oleosa de lfpidos seleccionados de trigliceridos, digliceridos, monogliceridos, fosfatidos, acidos grasos libres y combinaciones de los mismos.
[0021] El extracto bifasico de la presente invencion contiene tfpicamente una cantidad considerable de carotenoides, por ejemplo, al menos 0,03-5%, mas preferiblemente al menos 0,1% y de la forma mas preferible al menos 0,3% de carotenoides en peso de la fase oleosa.
Tfpicamente, la cantidad de carotenoides contenida en el extracto no excedera 5 % en peso.
Preferiblemente, el contenido de carotenoide no excede 3 % en peso.
Asimismo, el extracto contiene normalmente una cantidad considerable de cloruro sodico.
Tfpicamente, el extracto bifasico contiene 0,7-6%, mas preferiblemente 0.8-4% en peso de cloruro sodico de la fase acuosa;
[0022] Los beneficios de la presente invencion son particularmente pronunciados en el caso de que una fraction significativa de los acidos grasos <b3 sea contenida en la fraction lipfdica polar, en particular si una fraction significativa es contenida en fosfatidos (por ejemplo, fosfatidilcolina y/o fosfatidiletanolamina) y/o glicolfpidos.
Segun una forma de realizacion preferida al menos 10 % en peso, mas preferiblemente al menos 20 % en peso y de la forma mas preferible al menos 25 % en peso de los acidos grasos <b3 es contenido en lfpidos polares seleccionados de fosfatidos, glicolfpidos y combinaciones de los mismos.
[0023] Ventajosamente, el presente extracto contiene 3-50%, mas preferiblemente 5-40% en peso de los anteriormente mencionados lfpidos polares de la fase oleosa.
Aun mas preferiblemente, el presente extracto contiene 3-50%, de la forma mas preferible 5-40% en peso de fosfatidos de la fase oleosa.
[0024] En una forma de realizacion preferida de la presente invencion el extracto bifasico se produce mediante extraction con un solvente con un alto contenido de monoalcohol C1-5, seguido de elimination del volumen de dicho alcohol mediante evaporacion.
Normalmente, una pequena cantidad del monoalcohol C1-5 sera retenida en el extracto bifasico.
Tfpicamente, el extracto contiene 0,01-10%, mas preferiblemente 0,03-10%, aun mas preferiblemente 0,110%, y de la forma mas preferible 0,1-5% de monoalcohol C1-5 en peso de la fase acuosa.
Preferiblemente, el monoalcohol C1-5 es seleccionado del grupo seleccionado de metanol, etanol, isopropanol y combinaciones de los mismos.
De la forma mas preferible, el monoalcohol C1-5 es etanol.
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[0025] Como se ha explicado aqu anteriormente, la presente invention proporciona la ventaja importante de que esta no depende del uso de solventes organicos apolares.
Por lo tanto, segun una forma de realization particularmente preferida, el extracto contiene menos del 0,1 % en peso, aun mas preferiblemente menos del 0,03 % en peso de solventes organicos diferentes del monoalcohol C1-5.
[0026] Los beneficios de la presente invencion se pueden realizar utilizando todos los tipos de microalgas, siempre que contengan cantidades significativas de EPA y/o DHA.
Segun una forma de realizacion preferida, las microalgas empleadas conforme a la presente invencion no son especies de secretion de silicato o de calcio que pertenecen a los diatomos o al genero cocolitoforos. Ejemplos de genero/clases de microalgas que pueden idoneamente ser empleados incluyen Chysophyceae, Xantophyceae, Eustigmatophyceae, Baccilariophyceae, Dinophyceae, Rodophyceae, Phaeophyceae, Chlorophyceae, Prasinophyceae, Cryptophyceae, Botrycoccus, Isochrysis, Tetraselmis, Neochloris, Scenedesmus, Chlorobotrys, Eustigmatos, Pseudostaurastrum, Vischeria, Monodopsis, Ellipsoidion, Pseudocharaciopsis y combinaciones de los mismos.
Aun mas preferiblemente, las microalgas empleadas, pertenecen a un genero o clase seleccionado de Eustigmatophyceae, Chlorophyceae y combinaciones de los mismos.
De la forma mas preferible, las microalgas empleadas conforme a la presente invencion son seleccionadas de Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Chlorella fusca, Haematococcus pluvialis y combinaciones de los mismos.
[0027] Las microalgas empleadas conforme a la presente invencion preferiblemente son microalgas verdes. Por consiguiente, en una forma de realizacion preferida, el extracto contiene al menos 0,02%, mas preferiblemente 0,05% en peso de clorofila de la fase oleosa.
Normalmente, la concentration de clorofila del extracto no excede 1% en peso de la fase oleosa.
[0028] El extracto bifasico de la presente invencion puede adecuadamente ser producido por extraction de la biomasa humeda con un monoalcohol C1-5, seguido de evaporation del volumen de dicho monoalcohol.
Tal extracto bifasico se caracteriza porque puede ser disuelto completamente nuevamente en el monoalcohol C1-5 que fue usado el solvente de extraccion.
Asf, conforme a esta forma de realizacion de la invencion, ventajosamente 200 gramos del extracto pueden ser completamente disueltos en 1 litro de monoalcohol C1-5.
[0029] Alternativamente, el extracto bifasico de la invencion se puede producir hidrolizando enzimaticamente los componentes de pared celular humeda de biomasa de microalgas, seguido de eliminacion de material no soluble.
Tal extracto bifasico contiene tfpicamente al menos 1%, preferiblemente al menos 3% en peso de material de pared celular de algas celulosicas hidrolizadas de sustancia seca.
Mejores resultados se obtienen segun esta forma de realizacion si una fraction grande de la celulosa contenida en la biomasa de microalgas originales es hidrolizada.
Ventajosamente, al menos 50%, mas preferiblemente al menos 80% de la celulosa contenida en el extracto es celulosa hidrolizada.
[0030] Preferiblemente, la fase acuosa y la fase oleosa del presente extracto bifasico contienen menos del 1 % en peso de material no disuelto ademas de las gotitas dispersas de la otra fase.
Niveles bajos de material no disuelto son deseables ya que facilitan la recuperation posterior de los <b3- PUFA, EPA y DHA.
[0031] Tfpicamente, la fase acuosa y la fase oleosa del presente extracto bifasico juntas representan al menos 80 % en peso, preferiblemente al menos 90 % en peso y de la forma mas preferible al menos 98 % en peso del extracto.
[0032] Otro aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento de extraccion de una fase oleosa de microalgas que contienen paredes celulares, dicha fase oleosa que contiene al menos 1% en peso de acidos grasos totales de acidos grasos <b3 seleccionados de EPA, DHA y combinaciones de los mismos, el proceso que comprende:
• combinar la biomasa de microalgas humeda con los acidos grasos w3 con una preparation enzimatica teniendo actividad celulasa, P-glucanasa o P-glucosidasa;
• permitir a la preparacion enzimatica degradar las paredes celulares de las microalgas;
• aislar de la biomasa tratada con enzimas al menos 20% en peso de un lfquido de la biomasa de microalgas humeda, dicho lfquido siendo un extracto bifasico comprendiendo 50-95 % en peso de una fase acuosa y 5-50 % en peso de una fase oleosa; y
• separar la fase oleosa de la fase acuosa.
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[0033] El termino "biomasa humeda" como se utiliza en este caso se refiere a biomasa que contiene al menos 10 % en peso de agua.
Preferiblemente, la biomasa humeda contiene al menos 30 % en peso de agua y de la forma mas preferible mas del 50 % en peso de agua.
Los presentes procesos ofrecen la ventaja importante de que usan biomasa humeda como una materia prima lo que significa que etapas de secado pueden ser evitadas.
El secado de la biomasa no solo tiene la desventaja de que consume grandes cantidades de energfa, pero tambien tiene el inconveniente importante de que promueve la oxidacion de los ro-3 PUFAs contenidos en la biomasa.
[0034] Segun una forma de realizacion particularmente preferida del proceso definido anterior, la preparacion enzimatica se combina con la biomasa en una cantidad suficiente para proporcionar al menos 1 UI por gramo de sustancia seca de biomasa de actividad de endoglucanasa y/o al menos 0,2 UI por gramo de sustancia seca de biomasa de unidades de P-glucanasa y/o al menos 0,8 UI por gramo de sustancia seca de biomasa de actividad P-glucosidasa.
La actividad de endoglucanasa es determinada usando un ensayo de carboximetilcelulosa (CMC) basado en microplaca como se describe por Xiao et al (Analytical Biochemistry, 342 (2005), 176-178).
Una UI de actividad de endoglucanasa es definida como la cantidad de enzima que libera un micromol de azucares reductores (expresada como equivalente de glucosa) en 1 minuto a 50 °C y pH 4.8.
Una UI de actividad p-glucanasa es definida como la cantidad de enzima que libera 1 |jmol de equivalentes de azucar reductor (expresado como glucosa) por minuto a 55 °C y pH 5.0, usando P-D-glucano como sustrato.
De forma similar, una UI de actividad P-glucosidasa es definida como la cantidad de enzima que libera 1 jmol de nitrofenol para-nitrofenil-P-D-glucopiranosa en 10 minutos a condiciones de ensayo especficas a 50 °C y pH 4.8.
[0035] La degradacion enzimatica de las paredes celulares de las microalgas conforme al procedimiento anteriormente descrito ofrece la ventaja de que resulta innecesario aplicar rotura mecanica, sobre todo condiciones de alta cizalladura, para lisar las celulas.
Asf, en una forma de realizacion particularmente preferida de este proceso la biomasa de microalgas humeda no se somete a rotura mecanica antes del aislamiento del lfquido bifasico.
Aun mas preferiblemente, la biomasa de microalgas humeda no se somete a homogeneizacion de alta cizalla, aun incluso no se somete a homogeneizacion de alta cizalla a presiones de 100 bar o mas.
De la forma mas preferible, la biomasa de microalgas humeda no se somete a homogeneizacion de alta cizalla a presiones de 80 bar o mas.
[0036] La biomasa humeda empleada en este proceso tfpicamente tiene un contenido de agua de 10-95 % en peso.
Mas preferiblemente, la biomasa humeda empleada en los procesos segun la presente invention tiene un contenido de agua de 15-80 % en peso.
[0037] En el proceso definido anterior un extracto bifasico se produce desde el cual una fase oleosa se afsla por su separation de una fase acuosa.
La separacion de la fase oleosa se puede conseguir en formas diferentes.
Segun una forma de realizacion particularmente preferida, la fase oleosa es separada de la fase acuosa por centrifugacion y/o decantacion.
De la forma mas preferible, la fase oleosa se separa por decantation.
La fase oleosa aislada obtenida por el presente proceso se puede someter a etapas de procesamiento adicionales para eliminar impurezas y para mejorar la concentration de EPA y/o DHA.
Tecnicas de procesamiento adecuadas para eliminar impurezas y/o concentrar EPA y/o DHA se conocen en la tecnica.
[0038] Conforme a otra forma de realizacion preferida, la biomasa de algas contiene al menos 75 % en peso de biomasa de microalgas verdes, preferiblemente al menos 75 % en peso de biomasa de microalgas de un genero de microalgas o clase de microalgas seleccionada de Chysophyceae, Xantophyceae, Baccilariophyceae, Dinophyceae, Rodophyceae, Phaeophyceae, Chlorophyceae, Prasinophyceae, Cryptophyceae, Botrycoccus, Isochrysis, Tetraselmis, Neochloris, Scenedesmus, Chlorobotrys, Eustigmatos, Pseudostaurastrum, Vischeria, Monodopsis, Ellipsoidion, Pseudocharaciopsis y combinaciones de los mismos.
[0039] Ventajosamente, los presentes procesos no emplean ningun solvente organico diferente del monoalcohol C1-5.
De la forma mas preferible dichos procesos no emplean ningun solvente organico diferente del etanol.
[0040] El extracto bifasico producido en los procesos anteriormente mencionados es ventajosamente un extracto bifasico tal y como se define aqu antes.
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[0041] Otro aspecto de la invencion concierne el uso del extracto bifasico de la presente invencion en la production de productos alimenticios, bebidas, preparaciones nutricionales, productos farmaceuticos, pienso para animales o productos cosmeticos.
Los extractos bifasicos y la fase oleosa aislada son particularmente adecuados para usar en pienso para animales ya que el extracto o fase oleosa aislada se pueden incorporar en el pienso para animales sin necesidad de ningun pretratamiento.
Consecuentemente, en una forma de realization particularmente preferida, el extracto bifasico o la fase oleosa extrafda del mismo se usa en la produccion de pienso para animales.
[0042] Tfpicamente, el presente uso comprende incorporar el extracto bifasico o la fase oleosa en una cantidad que es equivalente a al menos 0,1% en peso del producto final.
[0043] La invencion es posteriormente ilustrada mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
[0044] Biomasa de microalgas humeda (Nannochloropsis) fue extrafda con etanol.
La cepa nannochloropsis usada fue:
• Nannochloropsis gaditana Lubian (1982); Division: Heterokontophyta, Clase: Eustigmatophyceae. CCAP 849/5 de la coleccion de cultivos de algas y protozoos (CCAP)
Aislador: Lubian (pre 1977); origen: Marino; Bahfa de Cadiz, Cadiz, Espana Cultivo: Medium SNA; A; sub
[0045] Microalgas de Nannochloropsis fueron cosechadas en su fase de crecimiento exponencial y la suspension de celulas fue centrifugada para la elimination de agua en exceso y sales con una centrifuga del tipo alfa Laval CLARA 80.
Cien gramos de la biomasa humeda asf obtenida fueron extrafdos con 200 g de etanol puro (99,9%) por la agitation de la mezcla de biomasa y etanol durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando un matraz de Erlenmeyer con un agitador magnetico y tapon de vidrio.
El extracto fue filtrado por suction con la ayuda de un embudo de Buchner y el retenido fue lavado dos veces con 50 g de etanol en total.
Despues, mas del 99 % en peso del etanol fue quitado del filtrado utilizando un evaporador rotatorio (65 °C, 200 mbar).
Despues de la evaporation, el extracto se dejo enfriar hasta la temperatura ambiente.
En esta fase, la separation de fase ocurrio, produciendo un extracto bifasico que comprende:
i. 73 % en peso de una fase inferior acuosa que contiene principalmente sales y componentes glutidicos; y
ii. 27 % en peso de una fase superior oleosa con un punto de fusion de aproximadamente 30 °C.
[0046] La fase oleosa fue separada desde la fase acuosa mediante decantation.
La cantidad total de material extrafdo resulto en 32 % en peso de la biomasa original (material seco).
El analisis mostro que la fase superior de lfpido contenfa 5.5 % en peso de acido eicosapentanoico (EPA).
[0047] El analisis de GC ademas mostro que el acido palmftico, acido estearico y acido oleico fueron los acidos grasos principales, juntos representando 60-70 % en peso de los acidos grasos contenidos en la fase oleosa.
[0048] Una muestra de la fase oleosa aislada fue sometida a un analisis de lfpidos utilizando una columna de vidrio conteniendo 3 g de gel de sflice 60 en 5 ml de cloroformo.
Con este fin 0.1030 g de la fase oleosa en 2-3 ml de cloroformo se aplico sobre la columna, seguido de elucion con:
• 100 ml de cloroformo para eluir lfpidos neutros (esteroles, trigliceridos, acidos grasos);
• 150 ml de acetona: metanol (9:1) para eluir glicolfpidos (cerebrosidos, sulfatidos, mono- y digalactosil digliceridos, glucosidos de esterol) y ceramidas y finalmente
• 100 ml de metanol para eluir fosfolfpidos.
[0049] La composition de la fase oleosa resulto ser de la siguiente manera:
LfPIDOS NEUTROS 47.05 % en peso.
GLICOLfPIDOS Y CERAMIDAS 26.22 % en peso.
FOSFOLfPIDOS 26.73 % en peso
[0050] Ademas, se ha observado que la fase oleosa contenfa 2,71 % en peso de colesterol y 1285 mg/kg de caroteno.
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Ejemplo 2
[0051] El retenido obtenido desde el embudo de Buchner despues de la extraction descrita en el Ejemplo 1 fue sometido a otra extraccion con 200 g de etanol puro (99,9%) a temperature ambiente por la agitation de la mezcla de extraccion durante 1 hora en un matraz de Erlenmeyer con un agitador magnetico y tapon de vidrio.
El extracto fue filtrado por suction con la ayuda de un embudo de Buchner y el retenido fue lavado dos veces con 50 g de etanol en total.
Despues, el etanol fue quitado del filtrado utilizando un evaporador rotatorio (65 °C, 200 mbar) y se dejo enfriar a temperatura ambiente, produciendo un extracto oleoso.
[0052] La cantidad total de material extrafdo durante la segunda extraccion resulto en 5,9 % en peso de la biomasa original.
El analisis ademas mostro que el extracto obtenido en la segunda extraccion contema 5,1 % en peso de EPA. El analisis de GC ademas mostro que la composition de acido graso del segundo extracto fue esencialmente identica a la del primer extracto.
[0053] El retenido de la segunda extraccion fue extrafdo dos veces con una mezcla de cloroformo y metanol para eliminar cualquier material lipfdico residual contenido en esta.
La cantidad total de lfpidos extrafda con esta mezcla de solvente fue 4,3% en peso de la masa extrafda.
El contenido EPA de los lfpidos extrafdos fue 1,7 % en peso.
La cantidad total de EPA quitada de la biomasa humeda por las dos extracciones de etanol y la extraccion de cloroformo/metanol fue 13,4% en peso de sustancia seca.
Este porcentaje iguala la cantidad de EPA normalmente encontrada en Nannochloropsis.
[0054] Muestras del extracto obtenido de la primera extraccion descrita en el Ejemplo 1 y del extracto obtenido de la segunda extraccion fueron sometidas a cromatograffa en capa fina.
Los cromatogramas asf obtenidos mostraron que el primer extracto principalmente consistio en lfpidos polares, glico- y fosfolfpidos y que el segundo extracto en su mayoria consiste en trigliceridos y componentes coloreados (clorofilas).
Ejemplo 3
[0055] Ejemplos 1 y 2 fueron repetidos utilizando un lote diferente de biomasa humeda de Nannochloropsis.
La primera extraccion fue encontrada para eliminar 31,3 % en peso de material extrafdo de la biomasa original (calculada en la sustancia seca), mientras que la segunda extraccion elimino otro 7,3 % en peso.
[0056] Nuevamente, la primera extraccion libero un extracto bifasico que fue separado en una fase oleosa y una fase acuosa por decantation.
La fase oleosa de la primera extraccion contenfa 7,3 % en peso de EPA y el extracto obtenido de la segunda extraccion contenfa 4,4 % en peso de EPA.
Ejemplo comparativo A
[0057] La misma cepa de Nannochloropsis como fue usada en los ejemplos 1-3 fue homogeneizada y secada mediante secado por atomizacion.
Posteriormente, 250 g de la biomasa seca fue sometida a extraccion con dioxido de carbono supercritico (caudal constante de 5-5,5 kg/h).
Durante la extraccion el dioxido de carbono supercritico fue recirculado continuamente.
Los componentes extrafdos fueron quitados por la expansion del dioxido de carbono en una camara de expansion seguido de (re)presurisacion del dioxido de carbono a un estado supercritico.
Primero, la biomasa seca fue extrafda con dioxido de carbono supercritico (300 bar, 90 °C).
Despues, el residuo de extraccion fue extrafdo una vez mas usando dioxido de carbono supercritico (150 bar, 50 °C seguido de 300 bar, 90 °C)
[0058] En la tabla 1 las condiciones de extraccion y los rendimientos de extraccion son resumidos:
Tabla 1
Condiciones de extraccion
Cantidad total extraida (en la masa seca) EPA en el aceite extraido
300 bar, 90 °C, 18 h
23 % en peso 3.3 % en peso
a) 150bar, 50 °C, 5.5 h b) 300 bar, 90 °C, 5.5 h
14 % en peso a) 3.2 % en peso b) 2.8 % en peso
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[0059] Niveles de EPA en el aceite extrafdo fueron significativamente inferiores a aquellos encontrados en los aceites ex^dos de los ejemplos 1-3.
Ademas se descubrio que el residuo obtenido de la segunda extraccion todavfa contema una cantidad sustancial de EPA (13-16% del EPA contenido en la materia prima), a pesar de los largos tiempos de extraccion empleados.
Ejemplo comparativo B
[0060] Dos lotes de la misma cepa de Nannochloropsis como se uso en los ejemplos 1-3 fueron homogeneizados y secados mediante secado por atomizacion.
Posteriormente, la biomasa seca fue extrafda a temperatura ambiente con una mezcla de cloroformo y metanol usando un metodo Blight and Dyer.
La biomasa humeda (20 gramos) fue mezclada con una mezcla de cloroformo/metanol (75 ml) 1:2 (p/p) en un matraz de Erlenmeyer y agitada energicamente durante 3 minutos.
Despues, 20 ml de cloroformo y 20 ml de agua fueron adicionados, seguido de 3 horas de agitacion.
La mezcla fue transferida a un decantador donde la separacion de fase fue dejada ocurrir durante un periodo de dos horas.
La fase (cloroformica) inferior fue recuperada y el solvente organico fue eliminado utilizando un evaporador rotatorio.
La Tabla 2 resume los rendimientos de extraccion asf obtenidos para cada lote de Nannochloropsis:
Tabla 2
Cantidad Total extraida (en la masa seca)
EPA en el aceite extraido
24,6 % en peso
6,0 % en peso
20,0 % en peso
3,2 % en peso
[0061] La extraccion con la mezcla de cloroformo/metanol produce altos rendimientos de EPA.
Sin embargo, como tanto el cloroformo como el metanol son toxicos, se necesita tomar precauciones de seguridad estrictas durante la extraccion y se requiere un procesamiento posterior complejo para reducir niveles de solvente residuales a niveles que son considerados aptos para uso alimentario.
Ejemplo comparativo C
[0062] Dos lotes de la misma cepa de Nannochloropsis como se usaron en los Ejemplos 1-3 fueron homogeneizados y secados mediante secado por atomizacion.
Posteriormente, la biomasa seca (15 g) fue sometida a extraccion con 300 ml de hexano en un extractor Soxhlet a 80 °C durante 12 horas.
La Tabla 3 resume los rendimientos de extraccion asf obtenidos para cada lote de Nannochloropsis:
Tabla 3
Cantidad Total extraida (en la masa seca)
EPA en el aceite extraido
25,4 % en peso
3,9 % en peso
23,2 % en peso
3,9 % en peso
[0063] La extraccion de hexano produjo un rendimiento de lfpido muy alto, pero el nivel de EPA en los aceites extrafdos son considerablemente inferiores a aquellos encontrados en los aceites extrafdos de ejemplos 1-3. Ademas, se ha observado que una alta proportion del EPA fue retenida en el residuo de extraccion (aproximadamente 20%), a pesar de los tiempos de extraccion largos empleados.
Ejemplo 4
[0064] El ejemplo 1 fue repetido excepto que esta vez la biomasa de microalgas de Chorella fusca (Division: Scenedesmus, origen: agua dulce) fue extrafda con etanol.
La biomasa de microalgas usada (ej Source Ingrepro BV, Pafses Bajos) fue suministrada en la forma seca y fue reconstituida con agua de mar (1:1) antes de la extraccion.
Segun especificacion, la biomasa seca tiene un contenido lipfdico de 6-20%, dependiendo de la estacion de cosecha.
[0065] Despues de la evaporation en un evaporador rotatorio y enfriamiento posterior a temperatura ambiente, un extracto bifasico se obtuvo que contenfa 26 % en peso de fase oleosa y 74 % en peso de fase acuosa.
Se encontro que la extraccion elimino 26,4 % en peso de material extrafdo de la biomasa original (calculada en el material seco).
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[0066] El analisis de GC mostro que acido palirritico, acido estearico y acido oleico fueron los acidos grasos principales, juntos representando 60-70 % en peso de los acidos grasos contenidos en la fase oleosa.
Una muestra de la fase oleosa aislada fue sometida al mismo analisis de lfpidos como se describe en el ejemplo 1.
[0067] La composicion de la fase oleosa resulto ser de la siguiente manera:
L^PIDOS NEUTROS 47 % en peso.
GLICOLfPIDOS Y CERAMIDAS 26 % en peso.
FOSFOLfPIDOS 27 % en peso
Ejemplo 5
[0068] El ejemplo 4 fue repetido, excepto que esta vez en vez de etanol puro una mezcla 9:1 de etanol y hexano fue usada.
Despues de la evaporacion en un evaporador rotatorio y enfriamiento posterior a temperatura ambiente, un extracto bifasico se obtuvo que contenfa 31 % en peso de fase oleosa y 69 % en peso de fase acuosa.
Se descubrio que la extraccion elimino 27,4 % en peso de material extrafdo desde la biomasa original (calculado en el material seco).
Ejemplo 6
[0069] La cepa de Nannochloropsis de los ejemplos 1-3 fue sometida a un proceso de extraccion de aceite alternativo implicando tratamiento enzimatico de la biomasa humeda.
Microalgas de Nannochloropsis fueron cosechadas en su fase de crecimiento exponencial y la suspension de celulas fue centrifugada para la eliminacion de agua en exceso y sales con una centrifuga del tipo Alfa Laval CLARA 80.
Cien gramos de la biomasa humeda asf obtenidos fueron introducidos en un matraz de Erlenmeyer y el pH fue ajustado con tampon acetato a 4,5.
Despues, una preparacion enzimatica fue anadida e mtegramente mezclada con la biomasa.
La mezcla resultante fue mantenida a 50 °C con la ayuda de un bano maria y agitada suavemente.
Las suspensiones celulares asf obtenidas fueron filtradas por Papel de Filtro Waltman® estandar para eliminar detrito celular y posteriormente sometidas a centrifugacion moderada (10 minutos a 2000G).
En cualquier caso la centrifugacion libero un extracto bifasico conteniendo una fase acuosa y una fase oleosa.
[0070] La Tabla 4 especifica las preparaciones enzimaticas y condiciones que fueron usadas al igual que el contenido EPA de la fase oleosa:
Tabla 4
Enzima digestiva
Cantidad de enzima anadida Condiciones EPA en fase oleosa
Accelerase® 1000
0.05 ml por gramo de biomasa 1 hora a 50 °C 6.2%
Accelerase® 1000
0.05 ml por gramo de biomasa 5 horas a 50 °C 6.3%
Viscozyme® L
1% en peso de biomasa seca 6 horas a 50 °C 7.3%
Celluclast® BG
1% en peso de biomasa seca 6 horas a 50 °C 7.4%
Viscozyme® L + Celluclast® BG
1% en peso de biomasa seca 6 horas a 50 °C 8.9%
Ejemplo 7
[0071] La biomasa de las siguientes especies de microalgas fue extrafda con etanol:
• Nannochloropsis gaditana Lubian (1982); dDivision: Heterokontophyta, Clase: Eustigmatophyceae. CCAP 849/5 de la coleccion de cultivos de algas y protozoos (CCAP). Aislador: Lubian (pre 1977). Origen: Marino; Bahfa de Cadiz, Cadiz, Espana. Cultivo: Medium SNA; A; sub
• Chlorella fusca. Source Ingrepro BV, Pafses Bajos, contenido de lfpido medio: 6-20% dependiendo de la estacion de cosecha. Division: Scenedesmus. Origen: agua dulce
• Haematococcus pluvialis Flotow (1844), Division: clorofita, clase: Clorophyceae, Orden: Volvocales. CCAP 34/6 de la coleccion de cultivos de algas y protozoos (CCAP). Aislador: Droop (1951). Origen: agua dulce, embalse; Ostpicken Island, Tvarmimme, Finlandia. Cultivo: medio EG:JM; A; cryo
• Isochrisis galbana Parke (1949), Division: Prymnesiophyta (Haptophyta), Clase: Prymnesiophyciae. CCAP 927/1 de la coleccion de cultivos de algas y protozoos (CCAP). Aislador: Parke (1938); origen: Marino; estanque pisdcola; Port Erin Marine Station, Isle of Man, Bretana. Cultivo: Medium f/2, A; sub
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[0072] Las microalgas fueron cosechadas en su fase de crecimiento exponencial y la suspension de celulas fue centrifugada para la elimination de agua en exceso y sales con una centrifuga del tipo Alfa Laval CLARA 80.
Para las especies no marinas el contenido de sal fue ajustado para conseguir la misma concentration de sal como agua de mar.
Los lodos celulares asf obtenidos fueron sometidos a secado en tambor para producir una biomasa de microalgas con un contenido de humedad de aproximadamente 50%.
[0073] Para cada especie de microalgas cien gramos de la biomasa secada en tambor fueron extrafdos con 200 g de etanol puro (99,9%) por la agitation de la mezcla de biomasa y etanol durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando un matraz de Erlenmeyer con un agitador magnetico y tapon de vidrio.
Los extractos asf obtenidos fueron filtrados por suction con la ayuda de un embudo de Buchner y los retenidos fueron lavados dos veces con 50 g de etanol en total.
Despues, mas de 99 % en peso de etanol fue eliminado de los filtrados utilizando un evaporador rotatorio (65 °C, 200 mbar).
[0074] Despues de la evaporation, los extractos se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente.
En esta etapa, la separation de fase ocurrio en todas las muestras, produciendo un extracto bifasico que comprende: una fase inferior acuosa que contiene principalmente sales y componentes glitidicos; y una fase superior oleosa con un punto de fusion de aproximadamente 30 °C.
[0075] Las fases de aceite fueron separadas de las fases acuosas mediante decantation.
El analisis de estas fases de aceite produjeron los datos siguientes:
Microalgas
Lipidos # Eicosapentaenoico (EPA) o docosahexaenoico (DHA) Carotenoides
Isochrisis galbana
48,5 % en peso 1 % en peso (DHA) 1,88 % en peso
Nannochloropsis gaditana
82,3 % en peso 5,6 % en peso (EPA) 4,1 % en peso
Chlorella fusca
97,5 % en peso 1,5 % en peso (EPA) 1.3 % en peso
Haematococcus pluvialis
96,6 % en peso 1,4 % en peso (EPA) 5 % en peso
# Lfpidos = trigliceridos, digliceridos, monogliceridos, fosfatidos, acidos grasos libres

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    REIVINDICACIONES
    1. Extracto de microalgas bifasico que comprende 15-95 % en peso de una fase acuosa y 5-85 % en peso de una fase oleosa, dicho extracto que contiene al menos 1% en peso de acidos grasos de acidos grasos w3 totales seleccionados del grupo consistente en acido eicosapentanoico (EPA), acido docosahexaenoico (DHA) y combinaciones de los mismos, dicho extracto ademas estando caracterizado por el hecho de que contiene:
    • 40-100% en peso de la fase oleosa de Kpidos seleccionados de trigliceridos, digliceridos, monogliceridos, fosfatidos, acidos grasos libres y combinaciones de los mismos;
    • 0,01-10% de carotenoides en peso de la fase oleosa;
    • 0,5-10% de cloruro sodico en peso de la fase acuosa;
    • 0-3 % en peso de material no disuelto aparte de las gotitas dispersas de fase acuosa o fase oleosa; y
    • 0-10% de monoalcohol C1-5 en peso de la fase acuosa.
  2. 2. Extracto segun la reivindicacion 1, donde al menos 10 % en peso de acidos grasos <b3 estan contenidos en lfpidos polares seleccionados de fosfatidos, glicolfpidos y combinaciones de los mismos.
  3. 3. Extracto segun la reivindicacion 1 o 2, donde el extracto contiene 0,01-10% de monoalcohol C1-5 en peso de la fase acuosa.
  4. 4. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el extracto es un extracto de una especie de microalgas de un genero de microalgas o una clase de microalgas seleccionada de Chysophyceae, Xantophyceae, Eustigmatophyceae, Baccilariophyceae, Dinophyceae, Rodophyceae, Phaeophyceae, Chlorophyceae, Prasinophyceae, Cryptophyceae, Botrycoccus, Isochrysis, Tetraselmis, Neochloris, Scenedesmus, Chlorobotrys, Eustigmatos, Pseudostaurastrum, Vischeria, Monodopsis, Ellipsoidion, Pseudocharaciopsis y combinaciones de los mismos.
  5. 5. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde 200 gramos del extracto pueden ser completamente disueltos en 1 litro de monoalcohol C1-5.
  6. 6. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el extracto contiene al menos 1% en peso de material de pared celular de algas celulosicas hidrolizadas de sustancia seca.
  7. 7. Proceso de extraccion de una fase oleosa de microalgas que contienen paredes celulares, dicha fase de aceite que contiene al menos 1% en peso de acidos grasos totales de acidos grasos w3 seleccionados de EPA, DHA y combinaciones de los mismos, el proceso que comprende:
    - combinar biomasa de microalgas humedas con los acidos grasos w3 con una preparacion enzimatica teniendo actividad celulasa, P-glucanasa o P-glucosidasa;
    - permitir que la preparacion enzimatica degrade las paredes celulares de las microalgas;
    - aislar de la biomasa tratada con enzimas al menos 20% en peso de un Kquido de la biomasa de microalgas humeda, dicho lfquido siendo un extracto bifasico comprendiendo 50-95 % en peso de una fase acuosa y 550 % en peso de una fase oleosa; y
    - separar la fase oleosa de la fase acuosa.
  8. 8. Proceso segun la reivindicacion 7, donde la preparacion enzimatica se combina con la biomasa en una cantidad suficiente para proporcionar al menos 1 UI por gramo de sustancia seca de actividad de endoglucanasa y/o al menos 0,2 UI por gramo de sustancia seca de unidades de P-glucanasa y/o al menos 0,8 UI por gramo de sustancia seca de actividad P-glucosidasa.
  9. 9. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde la fase oleosa es separada de la fase acuosa por centrifugacion o decantacion.
  10. 10. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde el extracto bifasico producido en el proceso es un extracto bifasico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  11. 11. Uso de un extracto bifasico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la produccion de productos alimenticios, preparaciones nutricionales de bebidas, productos farmaceuticos, pienso para animales o productos cosmeticos.
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