KR20160134657A

KR20160134657A - 미세조류 바이오매스의 열 투과화를 위한 방법

Info

Publication number: KR20160134657A
Application number: KR1020167022948A
Authority: KR
Inventors: 다미앙 파스; 사무엘 파티니에; 마릴린 길레망
Original assignee: 로께뜨프레르
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2016-11-23
Also published as: CN106103693A; EP3119872A1; WO2015140467A1; JP2017507662A; US20180223245A1; US20170081630A1; MX2016011970A

Abstract

본 발명은, 클로렐라 속 미세조류의 바이오매스를 열 투과화하여, 이로부터 특히 단백질과 올리고당체가 풍부한 가용성 분획들을 회수하기 위한 방법으로서, 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계; 60℃ 내지 130℃의 온도, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 1 분 내지 5 분 동안 단계별로 열 처리하는 단계; 0℃ 내지 10℃의 온도까지 냉각하는 단계; 및 미세조류 세포가 제거된 가용성 분획들을 회수(recovery), 농축(concentration) 및 부유화(enrichment)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

Description

미세조류 바이오매스의 열 투과화를 위한 방법{METHOD FOR THERMAL PERMEABILIZATION OF A MICROALGAE BIOMASS}

본 발명은, 가용성 세포내 함유물, 특히 펩티드 및 폴리펩티드를 미세조류 바이오매스로부터 방출시킬 수 있는 처리 방법인, 미세조류 바이오매스의 열 투과화(thermal permeabilization)를 위한 방법에 관한 것이다.

상기 열 투과화 방법은, 세포 붕괴를 수반하는 것이 아니며, 이에 의하여 더욱이 그 자체로서 당업자들에게 공지된 임의의 고체-액체 분리 방법, 예를 들어 전면 또는 접선 여과, 원심분리 및/또는 응집에 의해 잔류 바이오매스로부터 방출된 세포내 함유물을 또한 용이하게 분리할 수 있게 한다.

더욱 구체적으로, 선택된 미세조류에 지질이 풍부한 경우 본 발명의 방법은 잔류 바이오매스 중에 관심있는 지질 분획을 보존하는 것을 가능하게 만든다.

마지막으로, 본 발명은 가용성 펩티드 및 폴리펩티드, 안료, 유리 지방산, 올리고당체 및 다당체 등으로 구성되는 미세조류의 세포내 함유물을 수용액 중에서 회수 및 분획화하는 것에 관한 것이다.

클로렐라가 단백질과 기타 다른 필수 영양소가 풍부하기 때문에 식품의 잠재적 원천이 되고 있다는 것은 당업자들에게 널리 공지되어 있다.

클로렐라는 단백질 45%, 지방 20%, 탄수화물 20%, 섬유소 5%, 그리고 무기질과 비타민 10%를 함유한다고 기술되어 있다.

클로렐라 바이오매스의 오일 분획은 본질적으로 단일 불포화 오일로 구성되어 있으므로, 통상의 식품들에서 종종 발견되는 포화 수소화 및 다가 불포화 오일과 비교되었을 때 영양상 및 건강상 이점들을 제공한다.

단백질 분획은 자체의 발포 특성 또는 유화 특성 등을 가지므로, 그 일부는 식품, 화장품 또는 심지어 제약 산업에서조차도 작용제로 이용될 수 있다.

따라서 클로렐라는 통상 클로렐라 바이오매스의 건조에 의해 얻어지며, 세포벽이 특히 기계적 수단에 의해 파괴된 가루 형태로서, 또는 온전한 바이오매스의 형태로서 사람 또는 동물 섭취용 식품에 사용된다.

미세조류 가루는 또한 미량영양소, 식이 섬유(가용성 및 불용성 탄수화물), 인지질, 당단백, 식물성 스테롤, 토코페롤, 토코트리에놀 및 셀레늄과 같은 기타 다른 이익들을 제공한다.

식품 조성물에 혼입될 바이오매스를 제조하기 위하여, 바이오매스는 (광 생물반응기 내 광 독립영양생육에 의한 배양, 또는 차광 조건에서 종속영양생육에 의한 배양, 그리고 클로렐라에 의해 동화될 수 있는 탄소원의 존재 하에서의 배양을 통해) 배양 배지로부터 농축되거나 회수된다.

본 발명이 관련된 기술 분야에서는 클로렐라의 종속영양 생장(발효 경로라고 공지되어 있음)이 바람직하다.

발효 배지로부터 미세조류 바이오매스가 획득될 때, 바이오매스는, 대부분이 수성 배양 배지 중 현탁액에 존재하는 비변형 세포들을 포함한다.

바이오매스를 농축하기 위해서는 더욱이 전면 및/또는 접선 여과, 원심분리 또는 당업자들에게 공지된 임의의 수단에 의해 고체-액체 분리 단계가 수행된다.

농축 후, 미세조류 바이오매스는 진공 팩킹된 케이크, 미세조류 플레이크, 미세조류 균질화물, 비변형 미세조류 분말, 분쇄 미세조류 가루 또는 미세조류 오일을 제조하도록 직접 처리될 수 있다.

미세조류 바이오매스는 또한 후속 처리를 용이화하도록, 또는 바이오매스를 다양한 분야, 특히 식품 분야에서 사용하도록 건조된다.

그러나 지금까지 미세조류는 주로 부가가치가 크고 부피는 작은 생성물들을 제조하는데에 사용되었다. 이러한 상황을 뒷받침해주는 이유들 가운데 주된 이유는 미세조류의 대규모 제조에 가공할만한 비용이 든다는 것과, 특히 상기 생성물들을 정제하는 공정(하류 공정(Down Stream Process; DSP))과 연관하여 어려움이 따른다는 것이다.

상기 진술한 바와 같이, 부가가치가 큰 다수의 생성물들은 미세조류의 세포내 구획에 저장되어 있으며, 이 생성물들을 추출하는 방법들은 통상 세포 붕괴 단계를 필요로 한다.

그러나 효율적인 세포 붕괴 공정은 수율뿐만 아니라, 추출된 생성물의 질도 최대화하여야 한다. 다시 말하면, 이처럼 최적화된 붕괴 공정은 목표로 하는 생성물들의 화학적 오염 또는 분해를 막아야 한다는 것이다.

뿐만 아니라 대규모 제조를 위해서는, 선택된 공정이 해당 규모에 맞도록 바뀔 수 있는 것이 중요하다.

마지막으로, DSP에 이러한 세포 붕괴 단계를 도입하는 것이 용이해야 하며, 후속 공정/처리 단계에 악영향을 끼치지 말아야 한다.

이러한 모든 한계들은 붕괴 공정의 효율에 영향을 미치며, 같은 이유로 이 공정의 에너지 소모에도 영향을 미친다.

미세조류 붕괴를 위한 다양한 절차들, 예를 들어 화학적, 기계적, 효소적 또는 심지어 전기적(펄스장) 절차들이 연구되어 왔다.

그러나 미세조류 세포들은 매우 단단한 막벽(membrane wall)을 가지고 있어서, 세포 붕괴 및 관심있는 생성물의 추출을 매우 어렵게 만들뿐더러, 에너지의 관점에서 비용도 매우 많이 들게 한다.

예를 들어, 가압 파괴 장치(pressure disruptor)는 세포를 함유하는 현탁액을 제한된 오리피스를 통과시켜 펌핑함으로써 세포를 용해하는데 사용될 수 있다. 고압(최소 1500 bar)이 적용되면, 노즐을 통과하면서 순간적으로 팽창이 일어난다. 세포는 3 가지의 상이한 기작, 즉 밸브로 운송되는 기작, 오리피스에서 액체에 의해 고전단력이 가하여지는 기작, 그리고 배출구에서 압력이 급강하됨으로써 세포가 폭발하는 기작에 의해 파괴될 수 있다. 이 방법은 세포 파편들과 혼합되어 있는 세포내 분자들을 방출시킨다.

Niro 균질화기(GEA Niro Soavi 또는 기타 다른 임의의 고압 균질화기)는 크기가 주로 0.2 마이크론 내지 5 마이크론 사이인 세포들을 처리하는 데 사용될 수 있다. 고압 하에서 이루어지는 조류 바이오매스의 이러한 처리는 일반적으로 90%를 초과하는 세포를 용해함으로써 이 세포의 크기를 5 마이크론 미만으로 감소시킨다.

대안적으로 볼밀(ball mill)도 또한 사용될 수 있다. 볼밀의 경우 세포는 현탁액 중에서 작은 구형 입자들과 함께 교반된다. 세포의 파괴는 전단력, 볼들 사이의 밀 작용(milling), 그리고 볼들과의 충돌에 의해 유발된다. 적절한 볼밀의 설명은, 예를 들어 미국 특허 5 330 913에 제공되어 있다. 이러한 볼들은 세포를 파괴하여 세포로부터 세포 함유물을 방출시킨다. 그 다음, 원래 세포들보다 크기가 작은 입자들의 현탁액은 “수중유” 에멀전의 형태로 얻어진다. 이후, 이 에멀전은 분무화되면서 물이 제거되는데, 다만 이때 세포 파편, 틈새 가용성 화합물(interstitial soluble compound) 및 오일로 구성된 불균질 혼합물을 함유하는 건조 분말이 생성된다.

이러한 세포 붕괴 기술들이 사용될 때 해결되어야 할 숙제는, 특히 단백질 부하물(protein load)의 질이 보존되어야 하고, 세포내 함유물(막 파편 및 지방 제외)만이 분리되어야 한다는 것이다.

미세조류의 강성을 무너뜨리는데 사용되는 에너지는 사실상 관심있는 세포내 분자들의 비가역적 분해 또는 변성을 초래할 수 있다.

대안적 해결책들, 예를 들어 펄스장 전기 처리(pulse-field electrical treatment)가 제안되었다. 생물학적 세포들의 고강도 펄스 전기장에의 노출은 사실상 세포막의 구조를 변형시킬 수 있다. 외부 장은 막의 하전을 유발한다. 충분한 경막 전압(0.5 V 내지 1 V)에서 인지질의 분자 배열이 변화되면 막은 자체의 차단능을 상실하게 되고, 이로써 상기 막은 투과성이 된다. 사용된 조건들에 따라서 상기 막 투과화는 가역적일 수 있거나 아니면 비가역적일 수 있다.

그러나 세포내 화합물의 효율적 추출을 위해 당업자들에게는 막의 비가역적 투과화를 초래하여 이 막을 붕괴시킬 것이 권고되고 있다.

이러한 막의 파열이 세포 함유물의 방출을 용이화하고, 그리고 보충적 용매-추출 기법이 사용되는 경우에도 또한 용매의 세포로의 침투를 용이화한다.

이러한 기법이 전도 유망하긴 하지만, 불행하게도 1 ㎥ 내지 200 ㎥의 반응기 내에서 생산된 바이오매스를 처리하도록 해당 기법의 규모가 산업적 규모로 추정될 수 없다.

더군다나 상기 기법은 오염성 막 파편들을 생성하기도 하므로, 세포내 구획에 존재하는 관심 분자들로부터 이 파편들을 분리하는 것이 필요할 것이다.

결과적으로, 미세조류 벽을 약화시키기 위한 기술로서, 세포를 붕괴시키거나 세포의 구성성분들의 질을 떨어뜨리지 않고 세포내 함유물을 방출시킬 수 있는 기술을 제공함에 있어 충족되지 못한 요구사항이 남아있다.

본 출원 법인은, 이러한 요구사항은 미세조류 세포의 열 투과화를 위한 방법에 의해 충족될 수 있음을 발견하였다.

따라서 본 출원 법인은, 기계적 붕괴에 의하여 유발되는 전단력과 같이 세포 파괴를 위한 열 이용 방법들은 미세조류로부터 생성된 생성물을 분해 또는 변성하는데 대신 사용되는 기술에 불과하다라는 기술적 편견([Richmond, 1986, Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, Inc - Molina Grima et al., 2003], [Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics, Biotechnol. Adv. 20:491-515])에 맞서고자 한다.

더욱이 본 출원 법인에 의해 개발된 열 처리가 세포벽의 붕괴를 초래하지 않는다는 것을 고려할 때, 일단 분자들이 세포내 구획으로부터 방출되면 이러한 분자들의 회수는 당업자들에게 공지된 임의의 고체-액체 분리 기술에 의하여 용이하게 수행될 수 있다.

마지막으로, 이러한 가용성 분획의 회수는, 예를 들어 당업자들에게 공지된 막 분리 기법에 의한 미세조류의 함유물들의 분획화에 대한 길을 터준다.

본 발명은 클로렐라속 미세조류의 바이오매스를 열 투과화하여, 특히 펩티드 및 폴리펩티드와 올리고당체가 풍부한 가용성 분획들을 클로렐라속 미세조류 바이오매스로부터 회수하는 방법에 관한 것이다.

본 방법은

- 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계;

- 60℃ 내지 130℃의 온도, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 1 분 내지 5 분 동안 단계별로 열 처리하는 단계;

- 0℃ 내지 10℃의 온도까지 냉각하는 단계; 및

- 미세조류 세포가 제거된 가용성 분획들을 회수, 농축 및 부유화(enrichment)하는 단계

를 포함한다.

상기 방법은 바람직하게

1) 종속영양 조건 및 빛의 부재 하에서 발효에 의해 미세조류를 배양하는 단계;

2) 바이오매스를 수집하는 단계;

3) 선택적으로, 상기 바이오매스를 세정하여 발효로부터 생성된 틈새 유체의 잔류물을 제거하는 단계;

4) 60℃ 내지 130℃의 온도, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 1 분 내지 5 분 동안 단계별로 열 처리하는 단계;

5) 선택적으로, 상온까지 냉각한 다음, 이 온도에서 30 분에서 3 시간 동안 유지하여, 세포내 구성성분들이 반응 배지로 확산될 수 있도록 만드는 단계;

6) 0℃ 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 약 4℃의 온도까지 냉각하는 단계;

7) 고체-액체 분리 기법에 의하여 잔류 바이오매스를 제거하는 단계; 및

8) 미세조류 세포들이 제거된 가용성 분획들을 회수, 농축 및 부유화하는 단계

를 포함한다.

바람직하게 클로렐라속의 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 구체적으로는 클로렐라 프로토테코이데스이다. 하나의 특정 구현예에서, 균주는 클로렐라 프로토테코이데스(균주 UTEX 250 - 미국 오스틴 소재, 텍사스 대학교의 조류 배양 수집소(The Culture Collection of Algae))이다. 다른 특정 구현예에서, 균주는 클로렐라 소로키니아나(균주 UTEX 1663 - 미국 오스틴 소재, 텍사스 대학교의 조류 배양 수집소)이다.

종속영양 조건 및 빛의 부재 하에서 이루어지는 배양은 통상 (질소 함량 N x 6.25를 측정함으로써 평가되는) 단백질 함량이 건조 세포의 중량을 기준으로 45% 내지 70%인 클로렐라 바이오매스의 제조를 초래한다.

이하에서 예시될 바와 같이, 이러한 배양은

- 28℃에서 72 시간 동안 글루코스 및 효모 추출물을 함유하는 배지 중 진탕이 진행되면서 이루어지는 예비배양 단계;

- 28℃에서 36 시간을 초과하는 시간 동안 글루코스 및 효모 추출물 중 진탕이 진행되고, pH는 수성 암모니아로 6.5로 맞추어지면서 이루어지는 바이오매스 자체의 제조를 위한 배양 단계

의 2 개의 단계들로 수행되며, 이것으로 (N x 6.25에 의해 평가되는) 단백질 함량이 건조 세포의 중량을 기준으로 약 52%인, 약 80 g/l의 바이오매스를 생성한다.

이후 바이오매스는 고체-액체 분리, 전방 또는 접선 여과, 원심분리, 또는 더욱이 당업자들에게 공지된 임의의 수단에 의해 수집된다.

그다음, 유리하게 본 출원 법인은 바이오매스의 농축(원심분리에 의함)/희석의 연속 수행에 의한 틈새 가용성 화합물을 제거하는 방식으로 바이오매스를 세정할 것을 권고한다.

본 발명을 위해서, 용어 “틈새 가용성 화합물”은 발효 배지의 모든 가용성 유기 오염물질들, 예를 들어 수용성 화합물, 예를 들어 염, 잔류 글루코스, 중합도(DP) 2 또는 3인 올리고당체, 펩티드 등을 의미하는 것으로 의도된다.

따라서 자체의 틈새 가용성 물질이 제거된 바이오매스는 이후 우선적으로 탈염수를 이용하여 건물량 5 중량% 내지 35 중량%, 바람직하게는 건물량 10 중량% 내지 20 중량%로 맞추어진다.

그 다음, 60℃ 내지 130℃의 온도, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 1 분 내지 5 분 동안 단계별로 이루어지는 열 처리가 수행된다. 이러한 처리는 2 개 내지 6 개의 온도 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어 이러한 처리는, 온도를 상승시키는 몇 개의 단계와, 이후 선택적으로 온도를 강하시키는 몇 개의 단계를 포함할 수 있다. 온도 단계들은 10℃ 내지 40℃, 예를 들어 약 10℃, 20℃, 30℃ 또는 40℃일 수 있다. 제1 단계는 바이오매스의 온도를 약 60℃ 내지 약 70℃로 만들 수 있다. 용어 “약”은 + 또는 - 10%, 바람직하게는 + 또는 - 5%를 의미하는 것으로 의도된다. 중간 단계들은 60℃ 내지 적용 최고 온도, 예를 들어 90℃ 내지 130℃에서 수행될 수 있다. 각각의 단계는 약 10 초 내지 약 4 분, 바람직하게는 30 초 내지 3 분 동안 지속될 수 있다.

따라서 처리는, 바이오매스 온도를 약 60℃ 내지 약 70℃의 온도로 만들 수 있는 제1 단계, 적용된 최고 온도가 약 90℃ 내지 약 130℃에 도달할 수 있도록 만드는 단계 1 개 이상, 그리고 선택적으로 온도가 강하될 수 있도록 만드는 단계 1 개 이상을 포함할 수 있다.

이하에 예시될 바와 같이, 처리는

- 온도를 30 초 이내에 상온에서 60℃까지 상승시키는 단계;

- 온도를 추가 30 초 동안 60℃에서 90℃까지 상승시키는 단계; 및

- 온도를 3 분 동안 90℃로 유지하는 단계

의 3 개의 단계들로 수행될 수 있다.

하나의 특정 구현예에서, 상기 방법은

- 온도를 30 초 동안 28℃에서 60℃까지 상승시키는 단계;

- 온도를 30 초 동안 60℃에서 90℃까지 상승시키는 단계;

- 온도를 1 분 동안 90℃에서 유지시키는 단계;

- 30 초 동안 90℃에서 60℃까지 냉각하는 단계; 및

- 바람직하게 1 분 동안 60℃에서 4℃까지 냉각하는 단계

를 포함한다.

이러한 처리는 세포내 구성성분들을 반응 배지로 확산될 수 있도록 만들 수 있다.

온도를 상온까지 냉각하고, 이 온도로 30 분 내지 3 시간 동안 유지함으로써 자유 확산 현상이 증강될 수 있다.

마지막으로 이러한 단계들의 종료시에 온도는 최종 온도 0℃ 내지 10℃, 바람직하게는 온도 약 4℃까지 냉각될 수 있다.

따라서 본 출원 법인은 이러한 작동 조건 하에서 수행된 열 처리가, 세포내 구성성분중 가용성 구성성분의 자발적 방출을 가능하게 만드는 막 약화 공정으로서의 역할을 한다는 것을 발견하였다.

이온성 물질, 유기 물질, 예를 들어 탄수화물(주로 DP1 및 DP2) 이외에도, 펩티드 및 폴리펩티드가 세포로부터 배출된다.

역으로, 지질과 소수성 유기 화합물이 세포 내에 유지되며, 이에 의하여 세포는 투과화되되 용해/파괴되지는 않음이 명확하게 입증된다.

그러므로 본 발명에 따른 방법은 에멀전을 형성하지 않는 대신에, 사실상 수성 현탁액을 형성한다.

이러한 가용성 물질들 모두의 투과화된 막을 통한 방출은 투석형의 자유 확산 과정과 유사하다.

결과적으로, 지연 시간은 막을 투과화하는 열 처리 이후에 확산이 충분히 이루어질 수 있도록 만들기 위해 필요할 수 있다.

문헌에서, 효모로부터 단백질을 추출하기 위한 효모 막의 펄스장 투과화는 4시간 내지 6 시간의 시간을 필요로 한다(Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84).

본 발명에 따르면, 더욱 짧은 반응 시간, 즉 1 분 내지 5 분이 사용된다.

유리하게, 세포 구성성분 중 가용성 화합물들의 확산을 최적화하기 위해서 추가 반응 시간 30 분 내지 3 시간이 사용될 수 있다.

이후 잔류 바이오매스는 전방 또는 접선 여과, 응집, 원심분리 또는 당업자들에게 공지된 임의의 수단에 의한 고체-액체 분리 기법에 의해 제거되며, 이로 말미암아 미세조류 세포가 제거된 가용성 분획을 용이하게 회수하는 것이 가능하다.

이러한 가용성 분획은 본질적으로 단백질(50%w/w 내지 80%w/w)과 탄수화물(5%w/w 내지 15%w/w)로 구성된다.

가용성 단백질을 회수하기 위한 통상의 공정들은 일반적으로 상기 단백질을 트리클로로아세트산(10% 중량/부피) 또는 황산암모늄으로 침전시키는 단계를 바탕으로 한다.

그러나 이러한 침전에 의한 분리는 (보통 초음파 분해 또는 균질화에 의하여) 매우 파괴적인 세포 파괴 공정들을 수반하는데, 이때 이와 같은 세포 파괴 공정들은 사실상 추출 수율을 높일 수 있고, 특히 변성된 단백질들의 용해도를 낮춘다.

그러므로 오로지 화학적 수단(수산화나트륨에 의한 용해), 물리적 수단(고온 처리) 또는 효소적 수단(단백 분해 효소)에 의한 단백질의 가수분해에 따른 생성물(펩티드)에 의한 재작용기화를 구상할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 이와는 정반대로 비변형 원산 펩티드 및 폴리펩티드가 방출되도록 만들 수 있는데, 이 경우 이것들의 모든 작용기들은 여전히 발현되어 있을 수 있다.

더욱이 본 출원 법인은 방출된 가용성 펩티드 및 폴리펩티드의 크기가 사용된 처리 온도에 비례하여 달라진다는 것을 발견하였다. 또한 처리 시간이 영향을 미칠 수 있는 것으로 고려된다.

뿐만 아니라 관심있는 단백질 또는 올리고당체를 분리하기 위한 분획화 공정들이 본 출원 법인에 의해 제안되는데, 상기 분획화 공정들은 주로 막 분획화 공정이다.

따라서 본 출원 법인은 상기 공정을

- 미세여과, 한외여과, 나노여과 및 정용여과로 이루어진 군으로부터 선택되는 여과가 단독으로 또는 조합되어 수행됨으로써 막계 상에서 여과된 가용성 분획(열 처리된 미세조류가 제거된 분획)들로부터 가용성 단백질과 올리고당체가 부유화된 조성물을 제조하는 단계;

- 한편으로는 펩티드와 폴리펩티드를, 그리고 다른 한편으로는 올리고당체를 분리하기 위해 상기 조성물을 대상으로 역 삼투형의 추가 막 분획화 처리를 수행하는 단계

의 2 단계로 수행할 것을 권고한다.

본 발명은, 예시적이면서 비제한적인 것으로 의도되는 이하 실시예들을 통하여 더욱 명확하게 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 유가 배양식 발효에 의한 클로렐라 프로토테코이데스의 생산

사용된 균주는 클로렐라 프로토테코이데스 UTEX 250이다.

전배양:

- 2 l들이 에를렌마이어 플라스크 내 배지 500 ml;

- 배지 조성물(g/l);

대량원소 (g/l)	글루코스	40
	K₂HPO₄	3
	Na₂HPO₄	3
	MgSO_4.7H2O	0.25
	(NH₄)₂SO₄	1
	시트르산	1
	클레롤 FBA 3107(소포제)	0.1
미량원소 및 비타민(mg/l)	CaCl₂.2H2O	30
	FeSO4.7H2O	1
	MnSO4.1H2O	8
	CoSO4.7H2O	0.1
	CuSO4.5H2O	0.2
	ZnSO4.7H2O	0.5
	H3BO3	0.1
	Na2MoO4 · 2H2O	0.4
	티아민 HCl	1
	바이오틴	0.015
	B12	0.01
	판토텐산칼슘	0.03
	p-아미노벤조산	0.06

지속시간 72 시간; 온도 28℃; 진탕속도: 110 rpm(Infors Multitron 항온처리기)의 조건 하에서 배양이 수행된다.

이후 전배양액은 30 l 들이 Sartorius형 발효기로 운반된다.

바이오매스 생산용 배양액

배지는 다음과 같다:

대량원소(g/l)	글루코스	40
	KH₂PO₄	1.8
	NaH₂PO₄	1.4
	MgSO_4.7H2O	3.4
	(NH₄)₂SO₄	0.2
	클레롤 FBA 3107(소포제)	0.3
미량원소 및 비타민(mg/l)	CaCl₂.2H2O	40
	FeSO4.7H2O	12
	MnSO4.1H2O	40
	CoSO4.7H2O	0.1
	CuSO4.5H2O	0.5
	ZnSO4.7H2O	50
	H3BO3	15
	Na2MoO4 · 2H2O	2
	티아민 HCl	6
	바이오틴	0.1
	B12	0.06
	판토텐산칼슘	0.2
	p-아미노벤조산	0.2

발효기의 초기 부피(Vi)는 접종후 17 l로 조정한다. 최종 부피는 약 20 l 내지 25 l가 된다.

발효를 수행하기 위한 매개변수들은 다음과 같다:

온도	28 ℃
pH	5.0 ~ 5.2(28% w/w NH₃에 의해 맞춤)
pO₂	20% +/- 5%(진탕에 의해 유지됨)
진탕속도	최소 300 rpm
송풍량	15 l/분

잔류 글루코스 농도가 10 g/l 미만일 때, 발효기 내 글루코스 함량을 0 g/l 내지 20 g/l로 유지하기 위해 약 800 g/l로 농축된 용액 형태의 글루코스를 도입한다.

결과

40 시간 이내에 단백질을 52% 함유하는 바이오매스 80 g/l가 얻어진다.

실시예 2. 클로렐라 프로토테코이데스 바이오매스의 열 투과화 및 가용성 분획의 회수

실시예 1에 따라서 얻은 바이오매스는

- 원심분리 및 세정되어 건물 함량 150 g/l가 되고, 순도(총 건물량에 대한 바이오매스 건물량의 비율에 의해 정의되는 순도)는 90%를 초과하게 된 다음,

- 다음의 방법으로 열 처리된다:

· 온도를 30 초 동안 28℃에서 60℃까지 상승;

· 온도를 30 초 동안 60℃에서 90℃까지 상승;

· 온도를 1 분 동안 90℃에서 유지;

· 30 초 동안 90℃에서 60℃까지 냉각; 및

· 바람직하게 1 분 동안 60℃에서 4℃까지 냉각.

이와 같이 얻은 바이오매스는 원심분리에 의한 분리법으로 가용성 분획으로부터 분리된다. 상기 가용성 분획은 이후 60℃에서 0.14 ㎛ 세라믹 막 상에서 미세여과된다.

경막 압력은 0.2 bar 내지 0.6 bar의 값에서 고정되고, 미세여과는 부피 농도 인자(volume concentration factor)가 2.5가 되도록 수행된다(따라서 이 미세여과된 가용성 분획 100 l로부터는 농축물 “R1” 40 리터와, 투과물 “P1” 60 리터가 생성된다).

이와 같은 미세여과 투과물 “P1”은 건물 함량이 4%이고, 가용성 단백질의 역가(N x 6.25로 표시됨)는 60% 내지 80%이다.

실시예 3. 투과화된 클로렐라 프로토테코이데스 바이오매스의 세포내 함유물중 단백질 및 당체 구성성분들의 분획화

가용성 단백질과 당체가 풍부한 분획들을 얻도록 실시예 2의 종료시에 얻어진 미세여과 투과물 “P1”(건물 함량 4%)은 특히 컷-오프 역치값(cut-off threshold)이 10 kDa인 막상에서 한외여과되고, 그 결과 다음과 같은 것들을 얻는다:

· 건물 함량이 10%이고, 분자량이 5 kDa 이상인 펩티드와 DP가 높은 올리고당체를 함유하는 농축물 “R2”;

· 건물 함량이 1%이고, 분자량이 5 kDa 미만인 펩티드와 DP가 2 이하인 올리고당체를 함유하는 투과물 “P2”.

이후 상기 투과물 “P2”는 특히 (NaCl 배출도가 93%인) 역 삼투성 막 상에서 여과될 수 있으며, 그 결과 다음과 같은 것들이 얻어질 수 있다:

· 건물 함량이 10%이고, 분자량이 5 kDa 미만인 펩티드와 DP 2의 올리고당체, 예를 들어 수크로스를 함유하는 농축물 “R3”;

· 건물 함량이 0.1%이고, DP 1의 올리고당체, 염, 유리 아미노산 및 유기산을 함유하는 투과물 “R3”.

Claims

클로렐라 속 미세조류의 바이오매스를 열 투과화하여, 이로부터 단백질과 올리고당체가 특히 풍부한 가용성 분획들을 회수하기 위한 방법으로서,
- 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계;
- 60℃ 내지 130℃의 온도, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 1 분 내지 5 분 동안 단계별로 열 처리하는 단계;
- 0℃ 내지 10℃의 온도까지 냉각하는 단계; 및
- 미세조류 세포가 제거된 가용성 분획들을 회수, 농축 및 부유화하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은
1) 종속영양 조건 및 빛의 부재 하에서 발효에 의해 미세조류를 배양하는 단계;
2) 바이오매스를 수집하는 단계;
3) 선택적으로, 상기 바이오매스를 세정하여 발효로부터 생성된 틈새 유체의 잔류물을 제거하는 단계;
4) 60℃ 내지 130℃의 온도, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 1 분 내지 5 분 동안 단계별로 열 처리하는 단계;
5) 선택적으로, 상온까지 냉각한 다음, 이 온도에서 30 분에서 3 시간 동안 유지하여, 세포내 구성성분들이 반응 배지로 확산될 수 있도록 만드는 단계;
6) 0℃ 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 약 4℃의 온도까지 냉각하는 단계;
7) 고체-액체 분리 기법에 의하여 잔류 바이오매스를 제거하는 단계; 및
8) 미세조류 세포들이 제거된 가용성 분획들을 회수, 농축 및 부유화하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 열 투과화 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 클로렐라속의 미세조류는 클로렐라 불가리스, 클로렐라 소로키니아나 및 클로렐라 프로토테코이데스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 구체적으로는 클로렐라 프로토테코이데스인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오매스는 고체-액체 분리, 전방 또는 접선 여과, 또는 원심분리에 의해 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열 처리는 온도를 상승시키는 몇 개의 단계와, 이후 선택적으로 온도를 강하시키는 몇 개의 단계를 포함하고, 각각의 단계는 10℃ 내지 40℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열 처리는 바이오매스 온도를 약 60℃ 내지 약 70℃의 온도로 만들 수 있는 제1 단계, 적용된 최고 온도가 약 90℃ 내지 약 130℃에 도달할 수 있도록 만드는 단계 1 개 이상, 그리고 선택적으로 온도가 강하될 수 있도록 만드는 단계 1 개 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열 처리는
- 온도를 30 초 이내에 상온에서 60℃까지 상승시키는 단계;
- 온도를 추가 30 초 동안 60℃에서 90℃까지 상승시키는 단계; 및
- 온도를 3 분 동안 90℃에서 유지하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열 처리는
- 온도를 30 초 동안 28℃에서 60℃까지 상승시키는 단계;
- 온도를 30 초 동안 60℃에서 90℃까지 상승시키는 단계;
- 온도를 1 분 동안 90℃에서 유지시키는 단계;
- 온도를 30 초 동안 90℃에서 60℃까지 냉각하는 단계; 및
- 온도를 바람직하게 1 분 동안 60℃에서 4℃까지 냉각하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 방법을 수행함으로써 얻어진 가용성 분획들은, 미세여과, 한외여과, 나노여과 및 정용여과로 이루어진 군으로부터 선택되는 여과가 단독으로 또는 조합되어 수행됨으로써 막 분리계 상에서 여과되는 것을 특징으로 하는, 가용성 펩티드 및 폴리펩티드와 올리고당체가 풍부한 조성물을 클로렐라 속 미세조류로부터 제조하기 위한 방법.
역삼투형 막이 사용되는 것을 특징으로 하는, 가용성 펩티드 및 폴리펩티드와, 올리고당체가 풍부한, 제9항에 의하여 얻은 조성물을 분획화하기 위한 방법.