CN106103693A - 用于微藻生物质的热透化的方法 - Google Patents

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塞缪尔·帕蒂尼尔
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Abstract

本发明涉及一种用于热透化小球藻(Chlorella)属的微藻生物质的方法，该方法以从微藻生物质中回收具体地富含蛋白并且富含寡糖的可溶性级分的方式进行，该方法的特征在于它包括以下步骤：提供微藻生物质；在处于60℃和130℃、优选60℃和90℃之间的温度下逐步地进行热处理，持续1至5分钟；冷却至0和10℃之间的温度；并且回收、浓缩和富集已经从中去除微藻细胞的可溶性级分。

Description

用于微藻生物质的热透化的方法
本发明涉及用于微藻生物质的热透化的方法，这一处理使可能从微藻生物质释放可溶性细胞内内容物，具体地是肽和多肽。
这一热透化方法并不伴随细胞崩解，由此还允许通过本领域普通技术人员另外自身已知的任何固液分离方法，例如正面或切向过滤、离心和/或絮凝，容易地分离由此从残余生物质释放的细胞内内容物。
更具体地说，在其中选择的微藻富含脂质的情况下，本发明的方法使可能在残余生物质中保存感兴趣的脂质级分。
最后，本发明涉及在水溶液中微藻的细胞内内容物的回收和分级，所述细胞内内容物由以下项组成：可溶性肽和多肽、色素、游离脂肪酸、寡糖以及多糖等。
本领域普通技术人员熟知，小球藻是一种潜在的食物来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。
它们被描述为包含45％的蛋白质、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纤维素和10％的矿物质和维生素。
小球藻(Chlorella)生物质的油级分基本上由单不饱和油构成，因此与常见于常规食物产品中的饱和、氢化和多不饱和油相比提供营养和健康优势。
就其作用而言，蛋白级分可以被开发为食物、化妆品乃至制药工业中的功能剂，这归因于其发泡、乳化等的特性。
通常小球藻由此以全生物质形式或以粉形式(通过干燥小球藻生物质获得，该小球藻细胞壁已通过特定机械方式破裂)用于人类或动物消费的食物中。
微藻粉也提供其他益处，例如微量营养素、膳食纤维(可溶性和不溶性的碳水化合物)、磷脂、糖蛋白、植物甾醇、生育酚、生育三烯酚和硒。
为制备将纳入食物组合物中的生物质，从培养基浓缩或收获生物质(通过光自养在光生物反应器中培养，或以异养方式在黑暗中且在可由小球藻同化的碳源存在下培养)。
在本发明所涉及的技术领域中，小球藻的异养生长是优选的(其称为发酵途径)。
在从发酵培养基收获微藻生物质时，该生物质包括主要悬浮于水性培养基中的完整细胞。
为浓缩生物质，然后通过正面和/或切向过滤、通过离心或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式实施固-液分离步骤。
在浓缩之后，可直接处理微藻生物质以生产真空包装的糕点、微藻片、微藻匀浆、完整微藻粉末、经研磨微藻粉或微藻油。
还将微藻生物质干燥以促进生物质在各种应用(特别是食物应用)中的后续处理或应用。
然而，到目前为止，微藻主要用于生产具有高附加值但是小体积的的产物。在这些原因中，提出用来解释这一情况的是大规模生产微藻的高不可及的成本，并且尤其是与用于纯化(“DSP”，下游方法的缩写)所述产物的方法相关联的难度。
如上所述，具有高附加值的很多产物储存在微藻的细胞内区室中，并且用于提取这些产物的方法常规需要细胞崩解步骤。
然而，有效的细胞崩解方法具有不仅最大化产率，而且最大化提取的产物的质量的责任。换言之，这一优化的崩解方法必须避免目标产物的化学污染或降解。
此外，对于大规模生产而言，对于选择的方法，重要的是可转换值这一规模。
最后，在DSP中这一细胞崩解步骤的引入必须是容易的，并且必须对随后的加工/处理步骤不具有负面影响。
所有这些限制影响崩解方法的效率并且由于同样原因影响其能量消耗。
已经研究了用于崩解微藻的不同程序，例如化学的、机械的、酶的、乃至电的(脉冲场)程序。
然而，微藻细胞具有非常结实的膜壁，这使得细胞崩解和感兴趣的产物的提取是非常困难的，并且在能量方面是非常昂贵的。
例如，可使用压力破碎器通过节流孔板抽吸包含细胞的悬浮液以裂解细胞。施加高压(1500巴的最小量)，随后穿过喷嘴瞬间膨胀。细胞可通过三种不同的机制破裂：进入阀、孔板中液体的高剪切以及出口处压力突降，从而使得细胞爆破。该方法释放与细胞碎片混合的细胞内分子。
可使用尼罗(Niro)均质器(GEA尼罗索伊(Niro Soavi)或任一其他高压均质器)来处理大小主要介于0.2微米与5微米之间的细胞。藻类生物质在高压下的此处理通常裂解大于90％的细胞且将大小减小到小于5微米。
可替代地，还可以使用球磨机。在球磨机中，将细胞与小球形颗粒一起以悬浮状态搅动。细胞的破裂是由剪切力、球间研磨以及与球的碰撞所引起。例如，专利US 5 330 913中给出了一种适合的球磨机的描述。这些球使细胞破裂以从中释放细胞内容物。然后以“水包油”乳液形式获得粒径小于起源细胞的悬浮液。然后雾化此乳液且消除水，然而留下包含由细胞碎片、间质可溶性化合物和油组成的异质混合物的干燥粉末。
在使用这些细胞崩解技术时难以解决的是单独地分离细胞内内容物(以便排除膜碎片和脂肪)，并且具体地保存蛋白负载的质量。
用于破坏微藻的刚性的能量事实上会造成感兴趣的细胞内分子的不可逆降解或变形。
已经提出了替代解决方案，例如脉冲场电处理。生物细胞暴露于高强度脉冲电场事实上会改变细胞膜的结构。外源场引起细胞膜的充电。在充足的跨膜电压(0.5-1V)下，磷脂的分子排列改变，这导致细胞膜失去其屏障作用，使得它可渗透。取决于使用的条件，这一细胞膜透化会是可逆的或不可逆的。
然而，为了有效提取细胞内化合物，本领域普通技术人员建议造成细胞膜的不可逆的透化，由此导致其崩解。
然后，细胞膜的这一破裂促进释放细胞内容物的释放，并且在使用补充性溶剂提取技术的情况下，也促进溶剂渗透进入细胞。
尽管是有前景的，但是不幸地，这一技术并不能外推至工业规模以处理在1至200m3的反应器中产生的生物质。
此外，它还产生了从细胞内区室的感兴趣的分子进行分离必需的污染的细胞膜碎片。
其结果是，对于提供用于弱化微藻壁的技术仍存在未满足的需求，该技术能够释放细胞内内容物，而不崩解细胞或削弱其组分的质量。
本申请人公司已经发现，可以通过用于微藻细胞的热透化的方法来满足这一需求。
因此，本申请人公司反对一个技术偏见，该技术偏见认为，用于细胞破碎的热方法，就像由机械崩解引起的剪切力，是用于降解或变性来自微藻的产物的替代的技术(里奇蒙(Richmond)，1986，微藻大量培养手册(Handbook of Microalgal Mass Culture).CRC出版有限公司(CRC Press,Inc)-莫利纳格里马(Molina Grima)等人，2003，微藻生物质和代谢物的回收：方法选项和经济学(Recovery of microalgal biomass and metabolites:process options and economics)，生物技术进步(Biotechnol.Adv.)20:491-515)。
此外，一旦释放自细胞内区室，可以容易地通过本领域普通技术人员已知的任何固液分离技术进行分子的回收，只要由本申请人公司开发的热处理并不导致细胞壁的崩解。
最后，这一可溶性级分的回收打开了用于其内容物的分级的道路，例如通过本领域普通技术人员已知的膜分离技术。
本发明涉及一种用于热透化小球藻属的微藻生物质的方法，该方法以从微藻生物质中回收具体地富含肽和多肽并且富含寡糖的可溶性级分的方式进行。
这一方法包括以下步骤：
-提供微藻生物质；
-在处于60℃和130℃、优选60℃和90℃之间的温度下逐步地进行热处理，持续1至5分钟，
-冷却至0和10℃之间的温度，并且
-回收、浓缩并富集已经从中去除微藻细胞的可溶性级分。
这一方法优选包括以下步骤：
1)通过在异养条件下并且在不存在光的情况下进行发酵来培养该微藻，
2)收集该生物质，
3)任选地，洗涤该生物质以去除源自发酵的间质液的残余物，
4)在处于60℃和130℃、优选60℃和90℃之间的温度下逐步地进行热处理，持续1至5分钟，
5)任选地，冷却至环境温度并且维持在这一温度持续30分钟至3小时以允许细胞内组分扩散进反应介质，
6)冷却至0和10℃之间的温度，优选冷却至约4℃的温度，
7)借助固液分离技术，消除残余生物质，
8)回收、浓缩并富集已经从中去除微藻细胞的可溶性级分。
优选地，小球藻属微藻选自普通小球藻(Chlorella vulgaris)、异养小球藻(Chlorella sorokiniana)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)，并且更特别地为原壳小球藻。在一个具体实施例中，该菌株为原壳小球藻(菌株UTEX 250-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The Culture Collection of Algae at theUniversity of Texas at Austin-USA))。在另一个具体实施例中，该菌株为异养小球藻(菌株UTEX 1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The CultureCollection of Algae at the University of Texas at Austin–USA))。
在异养条件下并且在不存在光的情况下进行培养通常导致产生具有按干细胞的重量计，45％至70％的蛋白含量(通过测量氮含量N×6.25进行评估)的小球藻生物质。
如将在下文示例，分两个步骤进行这一培养：
-在包含葡萄糖和酵母提取物的培养基中进行预培养，在28℃下，伴随振荡，持续72h，
-自身在葡萄糖和酵母提取物中持续多于36h，在28℃下，伴随振荡并且在用氨水调节的pH 6.5下，进行用于产生生物质的培养，
这生成具有按干细胞的重量计，约52％的蛋白含量(用N 6.25进行评估)的大约80g/l的生物质。
然后通过固液分离，通过正面或切向过滤、通过离心或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式收集生物质。
有利地，本申请人公司然后推荐以这样一种方式洗涤生物质，该方式是关于通过生物质的一系列的浓缩(通过离心)/稀释来消除间质可溶性化合物。
出于本发明的目的，术语“间质可溶性化合物”旨在意指发酵培养基中的所有可溶性有机污染物，例如水溶性化合物，例如盐、残余葡萄糖、具有2或3的聚合度(或DP)的寡糖、肽等。
然后将其间质可溶性物质的由此纯化的生物质优先用脱矿质水调节至按重量计5％和35％之间的干物质，优选调节至10％和20％之间的干物质。
然后在60℃和130℃之间的、优选60℃和90℃之间的温度下逐步地进行热处理，持续1至5分钟。这一热处理可以包括2至6个温度步骤。例如，可以包括升高温度的若干步骤，和然后任选地降低温度的若干步骤。温度步骤可以是从10℃至40℃，例如大约10℃、20℃、30℃或40℃。第一步骤能使生物质升高至大约60℃-70℃的温度。术语“大约”旨在意指+或-10％，优选+或-5％。可以在60℃与施加的最大温度之间进行中间步骤，例如在大约90℃和130℃之间。每一步骤可以持续大约10秒和4分钟之间，优选在30秒和3分钟之间。
因此，该处理可以包括能使该生物质达到大约60℃-70℃的温度的第一步骤，能使该生物质达到施加的大约90℃至130℃的最大温度的一个或多个步骤，和任选地能使该生物质温度降低的一个或多个步骤。
如将在下文示例，可以分三个阶段进行该处理：
-在30秒内，将温度从环境温度升高至60℃；
-将温度从60℃升高至90℃，持续另外30秒；
-将温度维持在90℃，持续3分钟。
在一个具体实施例中，该方法包括以下步骤：
o将温度从28℃升高至60℃，持续30秒，
o将温度从60℃升高至90℃，持续30秒，
o将温度维持在90℃，持续1分钟，
o从90℃冷却至60℃，持续30秒，
o从60℃冷却至4℃，优选持续1分钟。
这一处理使能允许细胞内组分扩散进反应介质。
能允许温度冷却至环境温度，并且能以放大这一自由扩散现象的这样一种方式维持在这一温度持续30分钟至3小时。
最后，在这些步骤结束时，允许温度冷却至0和10℃之间的最终温度，优选冷却至约4℃的温度。
因此，本申请人公司已经发现，在这些操作条件下进行的热处理因此充当了细胞膜弱化方法，该方法允许自发释放细胞内区室的可溶性组分。
除了离子物质，有机物质，例如糖(主要是DP1和DP2)，肽和多肽也从细胞排出。
相反地，脂质和疏水有机化合物保留在细胞中，由此清晰地证明，细胞被透化并且并未被溶化/破坏。
因此，根据本发明所述的方法并未导致乳液形成，而是的确形成水性悬浮液。
所有这些可溶性物质通过透化膜的释放类似于渗析型的自由扩散的过程。
因此，滞后时间是必需的，以允许在透化膜的热处理后充分的扩散。
在文献中，用于酵母细胞膜的脉冲场透化的方法(目的是从其提取蛋白)需要从4h至6h(日内瓦(Ganeva)等人，2003，(Analytical Biochemistry)，315,77-84)。
根据本发明，使用在1和5分钟之间的远远更短的反应时间。
有利地，可以使用在30分钟和3小时之间的另外的反应时间，以优化细胞小室的可溶性化合物的扩散。
然后通过固液分离技术，通过正面或切向过滤、通过絮凝、通过离心或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式消除残余生物质，由此使能容易地回收已经从中去除微藻细胞的可溶性级分。
这一可溶性级分基本上由蛋白(50％w/w-80％w/w)和糖(5％w/w-15％w/w)组成。
用于回收可溶性蛋白的常规方法一般基于用三氯乙酸(10％重量/体积)或用硫酸铵沉淀所述蛋白的步骤。
然而，通过沉淀发生的这些分离是非常破坏性的细胞破裂方法(通常是通过超声处理或匀浆)的结果，尽管这些可能事实上增加提取率，尤其是生成变性的低溶解度蛋白。
然后能仅借助通过化学手段(用氢氧化钠裂解)、物理手段(高温处理)或酶手段(蛋白水解酶)的其水解产物(至肽)，设想其重新功能化。
恰恰相反，根据本发明所述的方法使可能释放完整天然肽和多肽，其所有功能性仍可以表达。
此外，本申请人公司已经发现，释放的可溶性肽和多肽的大小变化正比于使用的处理温度。还考虑到，处理时间可能有影响。
此外，本申请人公司提出了分级方法，以分离感兴趣的蛋白或寡糖，所述分级方法主要是膜分级方法。
因此本申请人公司推荐分两个步骤进行该方法：
-从可溶性级分(已经从中去除经热处理的微藻)制备富含可溶性蛋白并且富含寡糖的组合物，在选自以下的膜系统上过滤：单独或组合使用的微孔过滤、超滤、纳米过滤和透析过滤
-使所述组合物经历反渗透型的另外的膜分级处理，以便一方面分离肽和多肽，并且另一方面分离寡糖。
从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。
实例
实例1：通过分批补料发酵进行原壳小球藻的生产
使用的藻种是原壳小球藻UTEX 250
预培养：
-在2l埃伦迈尔烧瓶(Erlenmeyer flask)中的500ml培养基；
-该培养基的组成(以g/l计)：
表1.
孵育在以下条件下进行：持续时间：72h；温度：28℃；振荡：110rpm(伊孚森莫特顿(Infors Multitron)孵育器)。
然后将预培养物转移到30l赛多利斯(Sartorius)型发酵罐中。
用于生物质生产的培养：
该培养基如下：
表2.
在接种后将发酵罐的初始体积(Vi)调节至17l。达到大约20-25l的最终体积。
用于进行发酵的参数如下：
表3.
温度 28℃
pH 5.0–5.2，使用28％w/w NH3
pO2 20％+/-5％(通过振荡来维持)
振荡 最小300rpm
气流速率 15l/min
当残余葡萄糖浓度下降至低于10g/l时，则引入处于在大约800g/l的浓缩溶液形式的葡萄糖，以维持发酵罐中的葡萄糖含量在0与20g/l之间。
结果
在40h时获得包含52％的蛋白的80g/l的生物质。
实例2.原壳小球藻生物质的热透化和可溶性级分的回收
根据实例1获得的生物质经历：
-离心并且洗涤，以达到150g/l的干物质含量并且达到多于90％的纯度(用生物质的干物质与总干物质的比率定义纯度)，然后
-按以下方式热处理：
o将温度从28℃升高至60℃，持续30秒，
o将温度从60℃升高至90℃，持续30秒，
o将温度维持在90℃，持续1分钟
o从90℃冷却至60℃，持续30秒，
o从60℃冷却至4℃，优选持续1分钟。
通过离心分离，从可溶性级分分离由此获得的生物质。然后在60℃，在0.14μm陶瓷膜上微孔过滤所述可溶性级分。
跨膜压固定在0.2和0.6巴之间的值，并且进行微孔过滤，以获得2.5的体积浓缩因子(因此100l的这一微孔过滤的可溶性级分产生40升的渗余物“R1”和60升的渗透物“P1”)。
这一微孔过滤渗透物“P1”具有4％的干物质含量和60％与80％的可溶性蛋白之间的滴度(表示为N×6.25)。
实例3.透化的原壳小球藻生物质的细胞内内容物的蛋白和糖组分的分级
为了获得富含可溶性蛋白并且富含糖的级分，将在实例2结束时获得的具有4％的干物质含量的微孔过滤渗透物“P1”具体地在具有10kDa的截止阈值的膜上进行超滤，以获得：
o具有10％的干物质含量的渗余物“R2”，包含具有大于或等于5kDa的分子量的肽和具有高DP的寡糖；
o具有1％的干物质含量的渗透物“P2”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和具有小于或等于2的DP的寡糖。
然后具体地可以在反渗透膜(具有93％的NaCl排斥程度)上过滤这一渗透物“P2”，以获得：
o具有10％的干物质含量的渗余物“R3”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和DP 2的寡糖，例如蔗糖；
o具有0.1％的干物质含量的渗透物“R3”，包含DP1的寡糖、盐、游离氨基酸和有机酸。

Claims (10)

1.一种用于热透化小球藻(Chlorella)属的微藻生物质的方法，该方法以从微藻生物质中回收具体地富含蛋白并且富含寡糖的可溶性级分的方式进行，该方法的特征在于它包括以下步骤：
-提供微藻生物质；
-在处于60℃和130℃、优选60℃和90℃之间的温度下逐步地进行热处理，持续1至5分钟，
-冷却至0和10℃之间的温度，并且
-回收、浓缩并富集已经从中去除微藻细胞的可溶性级分。
2.如权利要求1所述的热透化方法，其特征在于它包括以下步骤：
1)通过在异养条件下并且在不存在光的情况下进行发酵来培养该微藻，
2)收集该生物质，
3)任选地，洗涤该生物质以去除源自发酵的间质液的残余物，
4)在处于60℃和130℃、优选60℃和90℃之间的温度下逐步地进行热处理，持续1至5分钟，
5)任选地，冷却至环境温度并且维持在这一温度持续30分钟至3小时以允许细胞内组分扩散进反应介质，
6)冷却至0和10℃之间的温度，优选冷却至约4℃的温度，
7)借助固液分离技术，消除残余生物质，
8)回收、浓缩并富集已经从中去除微藻细胞的可溶性级分。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于小球藻属微藻选自：普通小球藻(Chlorella vulgaris)、异养小球藻(Chlorella sorokiniana)和原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)，并且更具体地是原壳小球藻。
4.如权利要求1至3中一项或其他项所述的方法，其特征在于通过固液分离，通过正面或切向过滤或通过离心收集该生物质。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于该热处理包括升高温度的若干步骤，以及然后任选地，降低温度的若干步骤，每一步骤是从10℃至40℃。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于该热处理包括能使该生物质达到大约60℃-70℃的温度的第一步骤，能使该生物质达到施加的大约90℃至130℃的最大温度的一个或多个步骤，和任选地能使该生物质温度降低的一个或多个步骤。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于该热处理包括以下阶段：
-在30秒内，将温度从环境温度升高至60℃；
-将温度从60℃升高至90℃，持续另外30秒；
-将温度维持在90℃，持续3分钟。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于该热处理包括以下阶段：
o将温度从28℃升高至60℃，持续30秒，
o将温度从60℃升高至90℃，持续30秒，
o将温度维持在90℃，持续1分钟，
o从90℃冷却至60℃，持续30秒，
o从60℃冷却至4℃，优选持续1分钟。
9.一种用于从小球藻属的微藻制备富含可溶性肽和多肽并且富含寡糖的组合物的方法，其特征在于在选自以下的膜分离系统上过滤通过进行如权利要求1至8中任一项所述的方法获得的可溶性级分：单独或组合使用的微孔过滤、超滤、纳米过滤和透析过滤。
10.一种用于将如权利要求9所述获得的富含可溶性肽和多肽并且富含寡糖的组合物分级的方法，其特征在于使用反渗透型的膜。
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