CN114616237A - 蛋白质提取新方法 - Google Patents

Abstract

披露了一种提取细胞质蛋白或周质蛋白的方法。该方法包括提供包含细胞的第一细胞悬浮液，这些细胞含有要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白，该第一细胞悬浮液具有第一温度；以及将该第一细胞悬浮液加热至操作温度，在该操作温度下，这些细胞中的至少一部分经受热诱导的裂解，并且该要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的至少一部分不经受不可逆变性。该第一细胞悬浮液的加热包括提供水溶液，该水溶液具有高于该第一温度的第二温度，以及将该第一细胞悬浮液与该水溶液混合，从而获得第二细胞悬浮液，该第二细胞悬浮液具有高于该第一温度的第三温度。披露了一种用于提取细胞质蛋白或周质蛋白的系统。该系统尤其包括静态混合器。

Description

蛋白质提取新方法

技术领域

本申请涉及一种提取细胞质蛋白或周质蛋白的方法，该方法包括将细胞悬浮液加热至如下温度，在该温度下，含有要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的细胞发生热诱导的裂解，并且要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白不发生不可逆变性。本申请还涉及一种用于提取细胞质蛋白或周质蛋白的系统。

背景技术

用于医学和生物技术应用的重组蛋白的大规模生产需要对方法进行开发和优化，以满足产生高质量最终产物的、具有成本效益且可再现的生产方法的需求。由于技术原因或经济原因，在小规模生产中运作良好的方法可能不适用于大规模生产。如果以工业制造为目标，则必须在模拟潜在大规模方法的条件下进行方法开发，随后扩大所开发的生产方法。

在细胞表达的重组蛋白的生产中，有效的细胞裂解和所期望的产物的回收是至关重要的。已经开发和描述了几种用于裂解细胞的方法。这些方法包括机械均质化、超声均质化、压力均质化、热处理、冷冻/解冻循环以及渗透和化学裂解。选择的方法将取决于多种因素，比如要从细胞中提取的目的蛋白的性质、所述蛋白质的亚细胞定位、所涉及的体积和所需的通量(throughput)。

对于热稳定蛋白的提取，通过热处理进行裂解可能是有利的，因为它可以导致不期望的宿主细胞蛋白的沉淀和/或不溶性聚集体的去除，并且因此有助于后续纯化。此外，当在筛选阶段使用时，通过热处理进行裂解将有利于热稳定变体，这些热稳定变体更有可能导致正确折叠的蛋白质的产率更高。

然而，对于大规模生产，加热和冷却细胞悬浮液所需的时间可能影响总产率，因为目的蛋白可能开始沉淀或降解。加热和冷却细胞悬浮液所需的时间还可能导致产生与产物相关的杂质的问题。因此，通过热处理进行裂解对于通过细胞表达进行的蛋白质大规模生产不是最佳的，因为在较大的生物反应器或容器中加热和冷却需要很长的时间，导致提取方法的结果控制不佳。因此，需要改进的提取程序以提高大规模细胞表达方法中的过程效率和蛋白质产率。

发明内容

本发明的一个目的是提供目的细胞质蛋白或周质蛋白的有效提取，即提供这种蛋白的高产率和/或高质量，特别是在大规模生产中。本发明的另一个目的是提供目的细胞质蛋白或周质蛋白的提取，同时避免或减少要提取的目的蛋白的沉淀或降解。本发明的再一个目的是提供目的细胞质蛋白或周质蛋白的提取，同时避免或减少与产物相关的杂质的产生。

在本发明的一个方面中，通过提取细胞质蛋白或周质蛋白的方法实现本发明的这些目的以及其他目的(在研究了以下描述后对本领域技术人员应是显而易见的)，该方法包括：

-提供包含细胞的第一细胞悬浮液，这些细胞含有要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白，该第一细胞悬浮液具有第一温度，以及

-将该第一细胞悬浮液加热至操作温度，在该操作温度下，这些细胞中的至少一部分经受热诱导的裂解，并且该要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的至少一部分不经受不可逆变性，

其中该第一细胞悬浮液的加热包括：

-提供水溶液，该水溶液具有高于该第一温度的第二温度，以及

-将该第一细胞悬浮液与该水溶液混合，从而获得第二细胞悬浮液，该第二细胞悬浮液具有高于该第一温度的第三温度。

因此，换句话说，提取细胞质蛋白或周质蛋白的方法可以包括：

-提供包含细胞的第一细胞悬浮液，这些细胞含有要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白，该第一细胞悬浮液具有第一温度，以及

-将该第一细胞悬浮液加热至操作温度，在该操作温度下这些细胞发生热诱导的裂解，并且要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白不发生不可逆变性，

其中该第一细胞悬浮液的加热包括：

-提供水溶液，该水溶液具有高于该第一温度的第二温度，以及

-将该第一细胞悬浮液与该水溶液混合，从而获得第二细胞悬浮液，该第二细胞悬浮液具有高于该第一温度的第三温度。

因此，将第一细胞悬浮液加热至操作温度导致目的细胞质蛋白或周质蛋白的释放，从而提供释放的目的细胞质蛋白或周质蛋白。将包含要裂解的细胞的第一细胞悬浮液与较热的溶液混合允许将该细胞悬浮液快速加热至裂解温度，进而允许增加要提取的目的蛋白的回收率。第一细胞悬浮液可以与水溶液以分批模式或连续地(优选连续地)混合。第一细胞悬浮液和水溶液之间的混合比可以在1:0.1至1:14的范围内，优选在1:1至1:14的范围内，更优选在1:2至1:12的范围内，更优选在1:3至1:10的范围内。预期通过将第一细胞悬浮液与水溶液混合实现的稀释降低了粘度并且降低了要提取的目的蛋白粘附于其他蛋白质和/或与其他蛋白质共沉淀的风险。

使用根据本发明的方法，可以通过使细胞经受不超过10min，比如在0.1s至10min的范围内，优选不超过5min，比如在0.1s至5min的范围内，更优选不超过1min，比如在0.1s至1min的范围内，更优选不超过10s，比如在0.1s至10s的范围内，最优选不超过1s，比如在0.1s至1s的范围内的加热来达到第三温度。

本文中，目的细胞质蛋白或周质蛋白的提取是指目的蛋白从其所表达的细胞的细胞质或周质中释放。本文中，细胞发生热诱导的裂解并且要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白不发生不可逆变性的操作温度涉及如下温度，在该温度下，细胞的至少小部分、优选主要部分或基本上全部经受裂解，并且要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的蛋白质分子的至少小部分、优选主要部分或基本上所有部分不经受不可逆变性。本文中，变性是指蛋白质部分或全部失去以其天然状态存在的四级、三级和/或二级结构的方法。

水溶液通常是缓冲溶液，通常用于细胞和蛋白质的处理。换句话说，水溶液具有适用于本方法的组成。因此，本领域技术人员能够调整水溶液的组成以优化要提取的目的蛋白的回收。水溶液组成的调整通常包括选择合适的缓冲组分、合适的盐浓度、电导率和/或pH、和/或任何添加剂。这样的添加剂可以包括保护目的蛋白免受修饰或降解的添加剂，或增强不期望的细胞组分沉淀的添加剂。

因此，水溶液可以具有pH和/或电导率，和/或可以含有增强目的蛋白提取的添加剂。此外，水溶液可以具有pH和/或电导率，和/或可以含有增强对目的蛋白的保护使其免受修饰、降解、错误折叠或沉淀的添加剂。此外，水溶液可以具有pH和/或电导率，和/或可以含有增强不期望的细胞组分(比如宿主细胞蛋白、DNA、RNA、内毒素或其他细胞组分)的变性或沉淀的添加剂。此外，水溶液可以具有pH和/或电导率，和/或可以含有影响(优选降低)细胞发生裂解的温度的添加剂。

通常通过对细胞培养物进行离心或过滤来提供第一细胞悬浮液。还可以通过将冷冻细胞沉淀(优选通过离心或过滤从细胞培养物获得)与热缓冲溶液混合来提供第一细胞悬浮液。

第一温度，即所提供的包含细胞(这些细胞含有要提取的目的蛋白)的细胞悬浮液的温度，可以在0℃至37℃的范围内，优选在2℃至37℃的范围内，更优选在8℃至30℃的范围内，更优选在18℃至25℃的范围内。可替代地，第一温度可以低于0℃，则细胞悬浮液包含防冻配制剂，比如甘油。

操作温度，即细胞发生裂解的温度，可以低于90℃，比如在20℃至90℃的范围内，优选在40℃至90℃的范围内，更优选在50℃至90℃的范围内，更优选在60℃至90℃的范围内，更优选在70℃至90℃的范围内，更优选在70℃至85℃的范围内，最优选在75℃至85℃的范围内。

第二温度，即所提供的水溶液的温度，可以低于110℃，比如在40℃至110℃的范围内，优选在50℃至110℃的范围内，更优选在60℃至99℃的范围内，更优选在70℃至99℃的范围内，更优选在80℃至99℃的范围内，更优选在90℃至99℃的范围内，最优选在90℃至95℃的范围内。

第三温度，即通过混合第一细胞悬浮液和水溶液获得的第二细胞悬浮液的温度，可以低于90℃，比如在40℃至90℃的范围内，优选在50℃至90℃的范围内，更优选在60℃至85℃的范围内，更优选在65℃至85℃的范围内，更优选在65℃至80℃的范围内，更优选在65℃至78℃的范围内，最优选在68℃至78℃的范围内。可替代地，第三温度可以在70℃至80℃的范围内。在第三温度下，要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的至少一部分优选不经历不可逆变性。

第一细胞悬浮液的加热还可包括将第二细胞悬浮液从第三温度加热至操作温度。因此，通过与较热的溶液混合来加热第一细胞悬浮液之后可以进行朝向裂解温度的额外加热。如果仅通过将第一细胞悬浮液与较热的溶液混合不能达到操作温度(这可能是对要混合的流体的混合比和温度施加限制时的情况)，则这种额外的加热是合适的。此外，这种额外的加热允许精确控制第二细胞悬浮液的温度。将第二细胞悬浮液从第三温度加热至操作温度优选通过间接热交换进行，比如在管式热交换器或板式热交换器中。

优选地，第三温度比操作温度低不超过10℃，优选不超过5℃。期望的是通过将第一细胞悬浮液与较热的溶液混合而将其加热至裂解温度。因此，第三温度接近于操作温度是有利的。5℃或10℃的剩余温差将允许通过额外加热来微调温度。

可替代地，第一细胞悬浮液的加热还可包括将第二细胞悬浮液从第三温度冷却至操作温度。因此，通过与较热的溶液混合来加热第一细胞悬浮液之后可以进行冷却。如果通过将第一细胞悬浮液与较热的溶液混合达到高于所期望的操作温度的温度，则这种冷却是合适的。此外，这种冷却允许精确控制第二细胞悬浮液的温度。将第二细胞悬浮液从第三温度冷却至操作温度优选通过间接热交换进行，比如在管式热交换器或板式热交换器中。优选地，第三温度比操作温度高不超过10℃，优选高不超过5℃。如上所述，5℃或10℃的剩余温差将允许通过冷却来微调温度。

可替代地，第三温度可以是操作温度。在通过将第一细胞悬浮液与较热的溶液混合可以(以适当的精度)直接达到操作温度的情况下，可以省去朝向裂解温度的额外加热。

该方法还可包括将第二细胞悬浮液维持在操作温度下。尽管在升高的温度下长时间保持细胞悬浮液，比如在加热和后续冷却悬浮液期间，可能不利地影响要提取的目的蛋白的回收，但是仅达到裂解温度对于最佳提取可能是不够的。因此，在提取方法中包括将第二细胞悬浮液在操作温度下维持一段时间是有利的。本文中，在操作温度下的维持是指基本上在操作温度下的维持，即也在导致来自第二细胞悬浮液的任何不期望的热损失的较低温度下的维持。第二细胞悬浮液可在操作温度下维持在1s至20min的范围内或在10s至20min的范围内，优选在1s至10min的范围内或在10s至10min的范围内，更优选在1s至5min的范围内或在10s至5min的范围内，最优选在10s至4min的范围内，比如在10s至30s的范围内或在1min至4min的范围内的时间段。

该方法可以还包括将第二细胞悬浮液从操作温度冷却到第四温度，该第四温度优选是经可逆变性的要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的至少一部分经受复性的温度。因此，换句话说，该方法还可以包括将第二细胞悬浮液从操作温度冷却到第四温度，该第四温度优选是经可逆变性的要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白发生复性的温度。如已经提到的，将细胞悬浮液长时间维持在升高的温度下可能不利地影响要提取的目的蛋白的回收。因此，在提取方法中包括将第二细胞悬浮液从操作温度冷却到第四温度是有利的。出于相同的原因，在用于从细胞碎片和/或天然宿主细胞蛋白质中分离要提取的目的蛋白的任何后续程序之前冷却第二细胞悬浮液是有利的。为了能够最终以其天然形式回收要提取的目的蛋白，第四温度是经可逆变性的要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白质发生复性的温度。本文中，经可逆变性的要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白发生复性的温度涉及要提取的目的蛋白的任何经可逆变性的蛋白分子的至少小部分、优选主要部分或基本上全部经受复性至其天然状态的温度。第四温度可以在2℃至37℃的范围内，优选在8℃至30℃的范围内或在25℃至37℃的范围内，更优选在18℃至25℃的范围内。

优选地，在同时高于第一温度和第四温度的温度下的停留时间不超过20min，比如在1s至20min的范围内或在10s至20min的范围内，优选不超过10min，比如在1s至10min的范围内或在10s至10min的范围内，更优选不超过5min，比如在1s至5min的范围内或在10s至5min的范围内。

提取目的细胞质蛋白或周质蛋白并可能冷却细胞悬浮液后，该方法还可包括从细胞碎片和/或天然宿主细胞蛋白中分离目的细胞质蛋白或周质蛋白。此类分离方法是本领域技术人员熟知的，并且通常包括沉淀、过滤、离心和/或一种或多种形式的色谱法。

细胞可以是比如大肠杆菌细胞的原核细胞，或真核细胞。

要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白可包含细菌受体蛋白的三螺旋束蛋白结构域或其变体。在特定的实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。这样的结构域的非限制性实例是i)来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的五个不同的三螺旋结构域，比如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域是蛋白Z的变体，其衍生自葡萄球菌蛋白A的结构域B(Wahlberg E等人,2003,PNAS[美国科学院院报]100(6):3185-3190)和ii)链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(ABD)(Kraulis等人,FEBS Lett 378:190,1996)或其衍生物。

第一细胞悬浮液与水溶液的混合可以在静态混合器或搅拌容器中进行，优选在静态混合器中进行。如本领域中的常规，静态混合器可以是包含一系列固定叶片(通常为螺旋叶片)的管，或者是条的网格，通常为相互啮合和/或互连的条。优选地，所述混合在静态混合器中以连续模式进行。当第一细胞悬浮液流与静态混合器中的水溶液流相遇时，几乎立即获得温度高于所提供的第一细胞悬浮液的第二细胞悬浮液。

在本发明的另一个方面，上述目的通过用于提取目的细胞质蛋白或周质蛋白的系统来实现，该系统包括：

-具有入口和出口的细胞悬浮液供应管道，该细胞悬浮液供应管道的入口可连接到细胞悬浮液容器；

-具有入口和出口的水溶液供应管道，该水溶液供应管道的入口可连接到水溶液容器；

-具有至少一个入口和出口的静态混合器，该静态混合器的该至少一个入口与该细胞悬浮液供应管道的出口和该水溶液供应管道的出口流体连通；

-第一热交换器，其具有用于要加热的细胞悬浮液的入口和用于经加热的细胞悬浮液的出口，该第一热交换器的入口与该静态混合器的出口流体连通；

-第二热交换器，其具有用于要冷却的细胞悬浮液的入口和用于经冷却的细胞悬浮液的出口，该第二热交换器的入口与该第一热交换器的出口流体连通；

-具有入口和出口的排出管道，该排出管道的入口与该第二热交换器的出口流体连通，并且该排出管道的出口可连接到蛋白质悬浮液容器或蛋白质悬浮液处理系统。

该系统适于执行上述披露的方法。静态混合器使细胞悬浮液快速加热至裂解温度，进而允许增加要提取的目的蛋白的回收率。如本领域中的常规，静态混合器可以是包含一系列固定叶片(通常为螺旋叶片)的管，或者是条的网格，通常为相互啮合和/或互连的条。静态混合器可以具有一个入口(其与细胞悬浮液供应管道的出口和水溶液供应管道的出口流体连通)，或者具有两个入口(其中一个与细胞悬浮液供应管道的出口流体连通，并且另一个与水溶液供应管道的出口流体连通)。

第一热交换器和第二热交换器可以独立地为管式热交换器、板式热交换器、或被夹套或容器包围的管道。

该系统还可包括在第一热交换器的出口和第二热交换器的入口之间提供流体连通的保持管道，该保持管道优选地被夹套或容器包围，或被隔热材料包围，或被加热毯比如电加热毯包围。保持单元提供了在一段时间内将细胞悬浮液的温度基本上维持为第一热交换器所达到的温度的机会。在保持单元中的停留时间可以在1s至20min的范围内或在10s至20min的范围内，优选在1s至10min的范围内或在10s至10min的范围内，更优选在1s至5min的范围内或在10s至5min的范围内。如通常的实践，可以通过相对于细胞悬浮液的流速选择保持单元的合适体积来获得期望的停留时间，反之亦然。

细胞悬浮液供应管道可包括用于将细胞悬浮液朝细胞悬浮液供应管道的出口输送的泵。水溶液供应管道可包括用于将水溶液朝水溶液供应管道的出口输送的泵。这些泵中的一个或两个可以是正排量泵，比如蠕动泵。

该系统还可包括至少一个加热单元，其将加热介质提供给第一热交换器和/或保持单元的夹套或容器。

该系统可适于在本文别处披露的温度和/或流动下操作。优选地，通过静态混合器、第一热交换器、保持单元和第二热交换器以及通过连接它们的管道的流动是湍流的，从而减少例如细胞碎片或蛋白质在管道和设备中的滞留。

附图说明

图1是根据本发明的系统的示意图。

图2示出了实施例3的SDS-PAGE分析。

图3示出了实施例4的SDS-PAGE分析。

具体实施方式

图1示出了用于提取细胞质蛋白或周质蛋白的系统100。系统100包括细胞悬浮液供应管道102和水溶液供应管道104，它们都连接到静态混合器106。系统100还包括串联连接的第一热交换器108、保持单元110和第二热交换器112。静态混合器106连接到第一热交换器108。该系统还包括排出管道114。第二热交换器112连接到排出管道114。

细胞悬浮液供应管道102连接到细胞悬浮液容器120并包括蠕动泵122。水溶液供应管道104连接到水溶液容器124并包括蠕动泵126。排出管道114连接到蛋白质悬浮液容器128。保持单元110设有夹套130。

在系统操作期间，细胞悬浮液容器120提供室温下的第一细胞悬浮液，而水溶液容器124提供95℃下的缓冲溶液。泵122、126将第一细胞悬浮液和缓冲溶液从容器120、124输送到静态混合器106，在该静态混合器中，细胞悬浮液和水溶液以1:5的比例混合，产生约70℃的第二细胞悬浮液。将第二细胞悬浮液送至第一热交换器108，在该第一热交换器中，第二细胞悬浮液的温度升至75℃。将第二细胞悬浮液从第一热交换器108经由保持单元110送至第二热交换器112，在该第二热交换器中，第二细胞悬浮液的温度降低至25℃。第二细胞悬浮液在保持单元110中的停留时间为5min。第二细胞悬浮液从第二热交换器112经由排出管道114送至蛋白质悬浮液容器128，可以从该蛋白质悬浮液容器中收集该第二细胞悬浮液用于进一步处理。

系统100还包括加热单元140。加热单元经由管道142提供有自来水。加热单元140对自来水进行加热，并分别经由管道144和146向第一热交换器108和夹套130提供加热介质。加热介质分别经由管道148和150返回到加热单元130。管道142中的自来水还向第二热交换器112提供冷却介质。冷却介质经由管道152排出。

实施例

实施例1，BPEP01的热诱导提取

本实施例的描述涉及培养、使用静态混合器的热诱导提取、和后续分析两个重复生产批次的称为BPEP01的约19kDa多肽，其包含两个拷贝的Z变体(Z01)和衍生自链球菌蛋白G的GA3的白蛋白结合结构域。包括与使用发酵罐的热处理的比较。

材料与方法

培养：培养规模为6L或20L。用含有产物的基因片段的质粒转化大肠杆菌T7E2细胞(基因桥公司(GeneBridges))。使用含有50mg/l卡那霉素的Vegitone LB培养基(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))产生研究细胞库(RCB)。当培养物达到OD600＝0.94时，加入甘油至终浓度为15％，并将培养物等分到小瓶中(1ml/小瓶)，将这些小瓶在-80℃下冷冻。

用200μl/l解冻的RCB小瓶接种摇瓶培养基(6.7g/l酵母氮碱(贝迪公司(BectonDickinson))、5.5g/l葡萄糖一水合物、7g/l磷酸氢二钾、1g/l柠檬酸三钠二水合物、50mg/ml卡那霉素)。在30℃下温育至OD600>4后，用摇瓶培养物接种含有培养基(3.75g/l硫酸铵、3.3g/l磷酸氢二钾、4.95g/l磷酸二氢钾、1.88g/l柠檬酸三钠二水合物、1ml/l消泡剂204(西格玛奥德里奇公司)、6.1mol/l硫酸镁、50mg/l卡那霉素、1.2g/l葡萄糖、74mg/l氯化铁(III)六水合物、24mg/l硫酸锌七水合物、4mg/l硫酸铜(II)五水合物、16mg/l硫酸锰(II)一水合物、10mg/l氯化钙二水合物)的发酵罐至OD600为0.05-0.1。培养通常在37℃下在搅拌和超压(≤0.5巴)下运行以将溶解氧水平控制在≥30％。将pH控制在pH＝7，并且在接种后3h开始葡萄糖进料。在17.5h后，将温度降至33℃，并且在18h后，加入0.6mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白质产生。27-30h后停止培养。

细胞浓缩：通过离心或切向流过滤来收获培养物。在23℃下以9,800×g离心15min，并且弃去上清液。为了反映大规模分离器，使用10mM磷酸钠(pH 7.0)将细胞沉淀重悬浮，产生约700g/kg细胞浆液。在2×0.5m² 1000kDa再生纤维素过滤器(P2C01MV05，默克密理博公司(Merck-Millipore))上进行切向流过滤，其中将培养物浓缩至三分之一，随后用三个渗滤体积的50mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)渗滤。

使用静态混合器系统进行热诱导提取：将10mM磷酸钠、2mM EDTA、pH 7(预期在热处理期间导致pH 6.5)[放热缓冲液1]在多发酵罐系统(System Greta，贝拉赫生物技术公司(Belach Bioteknik))的培养基制备罐中加热至91℃-95℃。在两个单独的热处理运行中，使用蠕动泵将23℃细胞浓缩物(分别为约1.6L和约4.3L)和加热的放热缓冲液1分别以30ml/min和137ml/min的流速引入静态混合器(PMS3，ESSKA.se Industriteknik公司)，得到5.6倍稀释的细胞浓缩物。混合后，将细胞悬浮液引入放置在设定为76℃-78℃的水浴中的保持单元(

6.4×1.6mm管，体积为56cm³，华盛百得公司(Watson Marlow))。所得设置导致将细胞悬浮液加热至约76℃(操作温度)，保持时间为20s。在加热和保持后，将细胞悬浮液引入置于装有冰水的桶中的冷却盘管(S30，布赖格博拉吉公司(Bryggbolaget))。反复向水中加入冰以将热处理的细胞悬浮液中的温度保持在约25℃。

使用发酵罐进行热诱导提取：将细胞浓缩物与50mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)混合，随后加入EDTA至终浓度为2mM，并用0.5M磷酸氢二钠将pH调节至pH 6.5，得到3.8倍稀释的细胞浓缩物。使用带夹套的发酵罐BR20(贝拉赫生物技术公司)的加热系统，在76℃下加热细胞悬浮液3分钟。加热、保持和冷却至25℃的总时间为约1h，模拟在200L发酵罐中的大规模热处理。

蛋白质分析：通过小规模亲和色谱法纯化小部分，随后对纯化的洗出液进行Abs280测量从而进行定量。

结果

对使用静态混合器系统得到的热处理的细胞悬浮液中的产物进行定量，在两个代表性运行中显示平均100％回收率。作为比较，使用发酵罐热处理程序导致87％回收率。因此，就产物回收率而言，使用静态混合器得到的方法改进为15％。

实施例2，BPEP02的热诱导提取

本实施例的描述涉及培养、使用静态混合器的热诱导提取、和后续分析称为BPEP02的约19kDa多肽，其包含两种不同的Z变体(Z02a和Z02b)和衍生自链球菌蛋白G的GA3的白蛋白结合结构域。包括与使用发酵罐的热处理的比较。

材料与方法

培养：培养规模为2L或20L。培养基本上如实施例1中所述进行，不同之处在于RCB制备期间的最终OD600为0.80，培养17.5h后将温度降低至31℃。

细胞浓缩：通过离心或切向流过滤来收获培养物。在4℃下以15,900×g离心25min，并且弃去上清液。在2×0.5m² 1000kDa再生纤维素过滤器(P2C01MV05，默克密理博公司(Merck-Millipore))上进行切向流过滤，其中将培养物浓缩至三分之一，随后用三个渗滤体积的10mM磷酸盐缓冲液(pH 8)渗滤。

使用静态混合器系统进行热诱导提取：在对细胞进行热处理之前将其冷冻。将25mM磷酸钠、2mM EDTA、pH 8(预期在热处理期间导致pH 7.3)[放热缓冲液2]在多发酵罐系统(System Greta，贝拉赫生物技术公司(Belach Bioteknik))的培养基制备罐中加热至91℃-95℃。使用两个蠕动泵将23℃细胞浓缩物(约6L)和加热的放热缓冲液2分别以25ml/min和142ml/min的流速引入静态混合器(PMS3，ESSKA.se Industriteknik公司)，得到6.7倍稀释。混合后，将细胞悬浮液引入放置在设定为76℃的水浴中的保持单元(S30，布赖格博拉吉公司，估计体积为500cm³)。所得设置导致将细胞悬浮液加热至约76℃(操作温度)，持续3min。加热后，将细胞悬浮液引入置于装有冰水的桶中的冷却盘管(S30，布赖格博拉吉公司)。反复加入冰以将热处理的细胞悬浮液的最终温度保持在约25℃。

使用发酵罐进行放热：在对细胞进行热处理之前将其冷冻。将细胞浓缩物与179mM磷酸盐、11mM柠檬酸盐缓冲液混合，随后加入EDTA至终浓度为2mM，得到5倍稀释的细胞。所得细胞悬浮液的pH为7.3。使用发酵罐BR20(贝拉赫生物技术公司)的加热系统，在76℃下加热细胞悬浮液3分钟。加热、保持和冷却至25℃的总时间为75min。

蛋白质分析：通过小规模亲和色谱法纯化小部分，随后对纯化的洗出液进行Abs280测量从而进行定量。

结果

对使用静态混合器系统得到的热处理的细胞悬浮液中的产物进行定量，显示69％回收率。作为比较，使用发酵罐热处理程序，回收率为46％。因此，就产物回收率而言，使用静态混合器得到的方法改进为50％。

实施例3，BPEP03的热诱导提取

本实施例的描述涉及培养、使用静态混合器的热诱导提取、和后续分析称为BPEP03的约19kDa多肽，其包含两个拷贝的Z变体(Z03)和衍生自链球菌蛋白G的GA3的白蛋白结合结构域。包括与使用发酵罐的热处理的比较。

材料与方法

培养：培养规模为1L。培养基本上如实施例1中所述进行，不同之处在于培养17.5h后将温度降低至31℃。

细胞浓缩：通过离心收获培养物。在23℃下以9,800×g离心15min，并且弃去上清液。为了反映大规模分离器，将细胞沉淀重悬浮在10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，产生约700g/kg细胞浆液。

使用静态混合器系统进行热诱导提取：将25mM磷酸盐、2mM EDTA、pH 8.5[放热缓冲液3]在多发酵罐系统(System Greta，贝拉赫生物技术公司(Belach Bioteknik))的培养基制备罐中加热至91℃-95℃。使用两个蠕动泵将23℃细胞浓缩物(约0.15L)和加热的放热缓冲液3分别以25ml/min和114ml/min的流速引入静态混合器(PMS3，ESSKA.seIndustriteknik公司)，得到5.6倍稀释的细胞浓缩物。混合后，将细胞悬浮液引入放置在设定为77.6℃的水浴中的保持单元(S30，Matrevolution公司，估计保持体积为417ml)。所得设置导致将细胞悬浮液瞬时加热至75℃，pH约7.4，保持时间为3min。在加热并将悬浮液保持在操作温度后，将细胞悬浮液引入置于装有冰水的桶中的冷却盘管(S30，Matrevolution公司)。反复加入冰以将热处理的细胞悬浮液的最终温度保持在约25℃。

使用发酵罐进行热诱导提取：将细胞浓缩物与25mM磷酸盐、2mM EDTA、pH 8.5混合，得到与针对上述静态混合器程序所述相同比例的细胞浓缩物和缓冲液。使用发酵罐BR20(贝拉赫生物技术公司)的加热系统对细胞悬浮液进行加热，以模拟在>200L发酵罐中的大规模热处理。因此，在发酵罐中设定加热曲线，其中设定从25℃加热到75℃，花费约50min，随后进行在75℃持续3min的保持步骤，最后在30min内冷却至25℃。加热、保持和冷却的总时间为约83min。

蛋白质分析：通过小规模亲和色谱法纯化小部分，随后对纯化的洗出液进行Abs280测量从而进行定量。此外，对纯化的级分进行SDS-PAGE分析，以评估与产物相关的杂质，比如二聚化和降解。

结果

对使用静态混合器热处理得到的热处理的细胞悬浮液中的产物进行定量，显示71％回收率，而发酵罐中的热处理导致33％回收率。因此，就产物回收率而言，使用静态混合器得到的方法改进为115％。

在比较期间，与发酵罐热处理的样品相比，静态混合器热处理的样品在产物质量方面的主要优势也被检测到，如SDS-PAGE分析中描述。图2示出了分别用静态混合器热处理(泳道2)和在发酵罐中热处理(泳道3)后，以8μg装载在凝胶上的含有BPEP03的亲和纯化的裂解物的SDS-PAGE分析。将

Sharp蛋白标准品(Mw：260、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)装载在泳道1中。来自发酵罐的热处理样品显示出更多的降解和二聚化。除了当使用静态混合器时具有增加的回收率和有利的样品分布之外，使用静态混合器进行热处理的方法使得工业生产成为可能，而基于发酵罐的热处理是不可行的。

实施例4，BPEP04的热诱导提取

本实施例的描述涉及培养、使用静态混合器的热诱导提取、和后续分析称为BPEP04的约14kDa白蛋白结合蛋白，其包含链球菌蛋白G的两个白蛋白结合结构域GA2和GA3，和C末端半胱氨酸残基。包括与使用发酵罐的热处理的比较。

材料与方法

培养(1L规模)、分别使用实验室规模静态混合器系统和发酵罐的热诱导提取、以及蛋白质分析基本上如实施例3所述进行。

结果

对来自用静态混合器热处理或用发酵罐热处理得到的热处理的细胞悬浮液中的产物进行定量，均显示100％回收率。然而，比较显示与发酵罐热处理的样品相比，静态混合器热处理的样品在产物质量方面具有优势，如SDS-PAGE分析中描述。图3示出了分别用静态混合器热处理(泳道2)和在发酵罐中热处理(泳道3)后，以8μg装载在凝胶上的含有BPEP04的亲和纯化的裂解物的SDS-PAGE分析。将

Sharp蛋白标准品装载在泳道1中。来自发酵罐的热处理样品显示更多降解和更高比例的多聚体形式(二聚体、三聚体和四聚体)。

实施例5，BPEP05的热诱导提取

本实施例的描述涉及培养、使用静态混合器的热诱导提取、和后续分析称为BPEP05的约6.7kDa多肽，其包含一个拷贝的Z变体(Z04)，和C末端半胱氨酸残基。包括与使用发酵罐的热处理的比较。

材料与方法

培养(1L规模)以及分别使用静态混合器系统和发酵罐的热诱导提取基本上如实施例3所述进行，不同之处在于用已经在30℃温育5h的TSB+YE-培养基进行的培养物接种摇瓶起始培养物，而不是建立RCB。通过超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)进行产物的定量。

结果

分别用静态混合器和发酵罐热处理得到的热处理的细胞悬浮液中的产物的UPLC-MS定量显示，与发酵罐热处理相比，使用静态混合器热处理的回收率提高了43％。

实施例6，BPEP01的大规模放热

已经成功地证明了在大规模方法中使用根据本发明的热处理生产BPEP01。培养和收获基本上如实施例1所述进行，但是以100L培养规模并使用圆盘堆叠式离心机(GEA威斯特法利亚公司(GEA Westfalia))进行细胞浓缩。在静态混合器中使用与实施例1中相同比例的细胞悬浮液和[放热缓冲液1]并使用表示为S175的热处理系统进行热处理，其中保持单元体积为13.6L且总流速为6.8L/min，在76℃±1℃的操作温度下保持2min。大规模运行的回收率为100％，与实施例1中描述的小规模运行中获得的回收率相当一致。由此，本实验的结果证实了可扩展性和工业实用性。

实施例7，BPEP02的大规模放热

为了生产BPEP02，在大规模方法中使用根据本发明的热处理成功地运行了三个批次，其中两个在GMP(良好操作规范)下进行。培养和收获基本上如实施例2所述以300L培养规模进行。在静态混合器中使用与实施例2中相同比例的细胞悬浮液和[放热缓冲液2]并使用表示为S163的热处理系统进行热处理，其中保持单元体积为26L且总流速为8.67L/min，在80℃-84℃的操作温度下保持3min。三次大规模运行的回收率为73％-85％，与实施例2中描述的小规模运行中获得的回收率相当一致。由此，本实验的结果证实了可扩展性和工业实用性。

Claims (15)

1.一种提取细胞质蛋白或周质蛋白的方法，该方法包括：

-提供包含细胞的第一细胞悬浮液，这些细胞含有要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白，该第一细胞悬浮液具有第一温度，以及

-将该第一细胞悬浮液加热至操作温度，在该操作温度下，这些细胞中的至少一部分经受热诱导的裂解，并且该要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的至少一部分不经受不可逆变性，

其中该第一细胞悬浮液的加热包括：

-提供水溶液，该水溶液具有高于该第一温度的第二温度，以及

-将该第一细胞悬浮液与该水溶液混合，从而获得第二细胞悬浮液，该第二细胞悬浮液具有高于该第一温度的第三温度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该第一细胞悬浮液的加热还包括：

-将该第二细胞悬浮液从该第三温度加热至该操作温度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该第三温度比该操作温度低不超过10℃，优选不超过5℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中该第三温度是该操作温度。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括：

-将该第二细胞悬浮液维持在该操作温度下，优选地维持在1s至20min的范围内或在10s至20min的范围内，优选在1s至10min的范围内或在10s至10min的范围内，更优选在1s至5min的范围内或在10s至5min的范围内，最优选在10s至4min的范围内，比如在10s至30s的范围内或在1min至4min的范围内的时间段。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括：

-将该第二细胞悬浮液从该操作温度冷却到第四温度，该第四温度优选是经可逆变性的要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白的至少一部分经受复性的温度。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括：

-从细胞碎片和/或天然宿主细胞蛋白中分离该目的细胞质蛋白或周质蛋白。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

-该第一温度在0℃至37℃的范围内，优选在2℃至37℃的范围内，更优选在8℃至30℃的范围内，更优选在18℃至25℃的范围内；和/或

-该操作温度低于90℃，比如在20℃至90℃的范围内，优选在40℃至90℃的范围内，更优选在50℃至90℃的范围内，更优选在60℃至90℃的范围内，更优选在70℃至90℃的范围内，更优选在70℃至85℃的范围内，最优选在75℃至85℃的范围内；和/或

-该第二温度低于110℃，比如在40℃至110℃的范围内，优选在50℃至110℃的范围内，更优选在60℃至99℃的范围内，优选在70℃至99℃的范围内，更优选在80℃至99℃的范围内，更优选在90℃至99℃的范围内，最优选在90℃至95℃的范围内；和/或

-该第三温度低于90℃，比如在40℃至90℃的范围内，优选在50℃至90℃的范围内，更优选在60℃至85℃的范围内，更优选在65℃至85℃的范围内，更优选在65℃至80℃的范围内，更优选在65℃至78℃的范围内，最优选在68℃至78℃的范围内。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中该第四温度在2℃至37℃的范围内，优选在8℃至30℃的范围内或在25℃至37℃的范围内，更优选在18℃至25℃的范围内。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中在同时高于该第一温度和该第四温度的温度下的停留时间不超过20min，比如在1s至20min的范围内或在10s至20min的范围内，优选不超过10min，比如在1s至10min的范围内或在10s至10min的范围内，更优选不超过5min，比如在1s至5min的范围内或在10s至5min的范围内。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些细胞是比如大肠杆菌细胞的原核细胞，或真核细胞。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该要提取的目的细胞质蛋白或周质蛋白包含细菌受体蛋白的三螺旋束蛋白结构域或其变体。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一细胞悬浮液与该水溶液的混合在静态混合器或搅拌容器中进行，优选在静态混合器中进行。

14.一种用于提取细胞质蛋白或周质蛋白的系统，该系统包括：

-具有入口和出口的细胞悬浮液供应管道，该细胞悬浮液供应管道的入口可连接到细胞悬浮液容器；

-具有入口和出口的水溶液供应管道，该水溶液供应管道的入口可连接到水溶液容器；

-具有至少一个入口和出口的静态混合器，该静态混合器的该至少一个入口与该细胞悬浮液供应管道的出口和该水溶液供应管道的出口流体连通；

-第一热交换器，其具有用于要加热的细胞悬浮液的入口和用于经加热的细胞悬浮液的出口，该第一热交换器的入口与该静态混合器的出口流体连通；

-第二热交换器，其具有用于要冷却的细胞悬浮液的入口和用于经冷却的细胞悬浮液的出口，该第二热交换器的入口与该第一热交换器的出口流体连通；

-具有入口和出口的排出管道，该排出管道的入口与该第二热交换器的出口流体连通，并且该排出管道的出口可连接到蛋白质悬浮液容器或蛋白质悬浮液处理系统。

15.根据权利要求14所述的系统，该系统还包括在该第一热交换器的出口和该第二热交换器的入口之间提供流体连通的保持管道，该保持管道优选地被夹套或容器包围，或被隔热材料包围，或被加热毯比如电加热毯包围。

Images