CN115991731A - 一种耐热性蛋白质的回收方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐热性蛋白质的回收方法，涉及化学工程与技术领域和蛋白质分离纯化技术领域。其包括如下步骤：将经热变性处理后的待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合，经冻融处理，然后采用稀释复性的方法使得蛋白混合液中的蛋白复性，再对复性后的蛋白混合液进行分离纯化。本发明提供的回收方法简单易行，便于推广应用。

Description

一种耐热性蛋白质的回收方法

技术领域

本发明涉及化学工程与技术领域和蛋白质分离纯化技术领域，具体而言，涉及一种耐热性蛋白质的回收方法。

背景技术

蛋白质是一类由氨基酸聚合而成的大分子物质，它是一切生命的物质基础，也是生物体行使功能的重要载体。蛋白质的获取和改造一直是生命科学研究的热点之一，虽然重组表达技术为大量获得某种蛋白质提供了极大的便利，但细胞破碎液是一个成分复杂的混合体系，而将目标蛋白提取并纯化至较高的纯度绝非易事。

有一类蛋白质，由于其天然的耐热性，使得它们的纯化工作可以大大简化。这是因为，大多数蛋白都是热敏性的，在较高的温度下会发生变性，蛋白结构的改变导致蛋白质的沉降系数改变，在离心作用下极易发生沉降。而耐热性的蛋白在高温环境下仍然稳定，保留在上清溶液中。通过简单的离心处理，就可以将大部分杂蛋白去除。因此，对于耐热性蛋白，热处理是一种简单有效的纯化方法。

在热处理过程当中，杂蛋白大量沉降的同时部分目标蛋白也会跟随沉降，伴有共沉降的现象发生，而如何将目标蛋白从热变性沉淀中回收，鲜有报道。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐热性蛋白质的回收方法，从而实现耐热性蛋白质的再回收利用，有助于提升耐热性蛋白质的利用率。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种耐热性蛋白质的回收方法，其包括如下步骤：将经热变性处理的待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合，经冻融处理，然后采用稀释复性的方法使得蛋白混合液中的蛋白复性，再对复性后的蛋白混合液进行分离纯化。

尿素为一种蛋白变性剂，尿素溶液中蛋白质分子通常呈变性状态。由于热变性的待回收蛋白沉淀通常情况下不可溶解，发明人将蛋白沉淀物与尿素溶液混合后，经过冻融处理可以促进大部分蛋白溶解于尿素中，便于后续的复性、分离纯化。后续复性阶段，通过稀释尿素的浓度，可以使得蛋白逐步复性，进而通过常规的分离纯化方法实现耐热性蛋白的再回收。

发明人经过长期的筛选发现，仅有尿素适合于耐热性蛋白质的回收，尿素既可以在冻融处理后溶解热变性沉淀，又没有太强的变性作用，有利于后续的复性。

本发明提供的回收方法简单易行，便于推广应用。经过实验验证，回收后的耐热性蛋白具有较高的纯度，活性良好。通常情况下热变性沉淀被当作废弃物处理，本发明通过从热变性沉淀中回收部分目标蛋白，显然可以提高目标蛋白的整体回收率。

前述的热变性的待回收蛋白沉淀是指：蛋白经过热处理后，热敏性蛋白变性失活，经过离心使得热敏性蛋白沉淀，而大部分耐热性蛋白因具有对热稳定性而留存于上清液中，只有少量耐热性蛋白伴随着热敏性蛋白发生沉淀，这部分蛋白沉淀即为经热变性处理后的待回收蛋白沉淀。

例如，前述的热变性处理是指在60-70℃下热处理10-15min。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述稀释复性是指：降低尿素的浓度以使得蛋白混合液中的蛋白复性。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述稀释复性包括：将冻融后的蛋白混合液缓慢加入缓冲液中。通过将蛋白混合液缓慢加入缓冲液的方式，有助于彻底对蛋白进行复性，避免添加过快导致部分蛋白无法复性或复性失败。发明人发现，若将缓冲液直接兑入冻融后的蛋白混合液中，复性效果差。

在一种可选的实施方式中，以3-5mL/h的速度将混合液加入缓冲液中。在上述添加速度下，回收后的产物具有较高的纯度和活性。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述稀释复性后的分离纯化步骤包括：将蛋白混合液进行离心去除沉淀，然后取上清液进行层析纯化。通过离心去除不溶物，以提高回收的产物的纯度，降低产物中杂蛋白的含量。

在一种可选的实施方式中，纯化是指将上清液过固定化金属离子层析纯化。

在一种可选的实施方式中，将上清液过Ni²⁺层析柱，再用不同浓度咪唑的1×PBS缓冲液对层析柱进行梯度洗脱，收集洗脱液。

在一种可选的实施方式中，上清液过Ni²⁺层析柱后，先用1×PBS缓冲液冲洗层析柱，再依次用含50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L咪唑的1×PBS缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。在上述梯度洗脱条件下，能够获得较高的耐热蛋白回收率和纯度。

在其他实施方式中，上述分离纯化方法也可采用等电点沉淀法、盐析法、离子交换层析、分子筛、超速离心等方法，只要能实现耐热性蛋白的分离纯化均在本发明的保护范围之内。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合以形成混悬液，尿素溶液的浓度为2-8mol/L。

在一种可选的实施方式中，待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合后，在摇床上震荡2-3h以形成混悬液。通过震荡有助于蛋白沉淀物与尿素充分接触形成悬浮液，以助于后续在冻融后蛋白溶于尿素溶液中。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述冻融是指：将混悬液置于-15～-20℃下冷冻，而后置于室温下解冻。该冻融方法操作便捷。

在一种可选的实施方式中，在-15～-20℃下冷冻6-24h。例如过夜冷冻。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述耐热性蛋白质选自耐热核酸酶或耐热植酸酶。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述耐热核酸酶选自Taq DNA聚合酶、耐热核酸酶HII、核糖核酸酶A、牛小肠碱性磷酸酶或酵母焦磷酸酶。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种耐热性蛋白的回收方法。由于经热变性处理后的待回收蛋白沉淀通常情况下不可溶解，发明人将蛋白沉淀物与尿素溶液混合后，经过冻融处理可以促进大部分蛋白溶解于尿素中，便于后续的复性、分离纯化。后续复性阶段，通过稀释尿素的浓度，可以使得蛋白逐步复性，进而通过常规的分离纯化方法实现耐热性蛋白的再回收。

本发明提供的回收方法简单易行，便于推广应用。经过实验验证，回收后的耐热性蛋白具有较高的纯度，回收后的耐热性蛋白可以维持较好的活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1所对应Taq DNA聚合酶纯化的SDS-PAGE效果图，M：proteinmarker；1：加热前细胞破碎液上清；2：65℃热处理后的离心上清&固定化金属离子(Ni²⁺)层析纯化上样液；3：流穿液；4：50mmol/L咪唑洗脱；5：100mmol/L咪唑洗脱；6：200mmol/L咪唑洗脱，箭头指示Taq DNA聚合酶条带所处位置。

图2为本发明实施例2所对应固定化金属离子(Ni²⁺)层析纯化的SDS-PAGE效果图，M：protein marker；1：上样液；2：流穿液；3：50mmol/L咪唑洗脱；4：100mmol/L咪唑洗脱；5：200mmol/L咪唑洗脱，箭头指示Taq DNA聚合酶条带所处位置。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件进行。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1.进行Taq DNA聚合酶表达载体的构建。

根据Taq DNA聚合酶的氨基酸序列设计引物，人工合成基因，在5’端引入EcoR I位点，在3’端引入Hind III位点，合成的基因片段先克隆入商品化质粒pUC57质粒进行测序。测序正确的片段用EcoR I和Hind III双酶切切下来，回收后连入经过同样双酶切的商品化质粒pET-28a中，得到pET-28a-Taq载体，该载体表达的蛋白其N端带有多聚组氨酸标签(His-tag)，方便采用固定化金属离子(Ni²⁺)亲合层析进行纯化。

2.Taq DNA聚合酶的表达

表达载体pET-28a-Taq转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB平板(含卡那霉素50mg/L)，37℃恒温箱过夜培养。

从过夜培养的LB平板上挑取单个菌落到装有50mL LB培养基的250mL摇瓶中，置于37℃恒温摇床，200rpm，培养20h作为种子液。

将培养好的种子液接种到装有100mL自诱导培养基的1000mL摇瓶中，共接种8瓶，每瓶的接种量为5％(v/v)，置于恒温摇床，200rpm，37℃培养4h后转为16℃培养20h。其中，自诱导培养基的配方为：乳糖2g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L；甘油8ml/L。

收集所有培养液，离心后弃去上清，收集菌体的离心瓶暂时放置于-20℃冷冻保存。

3.表达Taq DNA聚合酶的细胞破碎及热处理。

收集菌体的离心瓶取出放置于室温下，待菌体解冻后，加入200mL含300mmol/LNaCl的1×PBS缓冲液，使菌体混悬，再用高压均质机破碎细胞。将细胞破碎液离心(8000rpm,10min)，取上清用含300mmol/L NaCl的1×PBS缓冲液稀释至500mL，分装于两个500mL摇瓶中，置于65℃水浴摇床，100rpm，孵育15min。热处理后，离心(8000rpm,10min)，可以观察到离心瓶底部有大量白色沉淀，这些即为热变性沉淀，沉淀留待下一步处理，离心上清通过固定化金属离子(Ni²⁺)层析进行纯化。

Ni柱层析纯化方法如下：

将装有16mL Ni-IDA 6FF琼脂糖纯化树脂的纯化柱用1×PBS缓冲液平衡，之后将热变性样品离心上清上样，然后用1×PBS缓冲液冲洗层析柱，再用含有不同浓度咪唑的1×PBS缓冲液梯度洗脱，其中咪唑浓度依次为50mmol/L；100mmol/L；200mmol/L。

收集洗下来的各组分，各加入loading buffer制成上样样品，SDS-PAGE凝胶电泳。实验结果见附图1。可以看出，Taq DNA聚合酶的表达水平比较低，细胞破碎液中目标蛋白条带不明显。因为Taq DNA聚合酶对于大肠杆菌细胞是一个异源的毒性蛋白，其表达水平低为正常情况，热处理给目标蛋白带来的损失难以直接观察到。

65℃加热后的离心上清中还含有较多的杂蛋白，通过固定化金属离子(Ni²⁺)层析纯化后，100mmol/L咪唑和200mmol/L咪唑的洗脱样品中目标蛋白的纯度已经达到了较高水平，即一步层析就产生了较好的纯化效果，这证明了热处理这一方法的有效性。

实施例2

热变性沉淀的回收，具体包括如下步骤：

用小钢勺将实施例1步骤3中的离心瓶底部的白色沉淀(热变性沉淀)打碎，加入50ml尿素(8mol/L)溶液，置于跷板脱色摇床震荡2-3h，待沉淀充分散开，将混悬液倒至一个50ml离心管中，可以观察到溶液呈浑浊态，这表明热变性沉淀无法用8mol/L尿素溶解。

将盛放混悬液的离心管放置于-20℃冷冻保存。第二天，将离心管取出放置于室温环境下解冻，可以观察到，经过冻融处理后，热变性沉淀混悬液变得澄清，这表明热变性沉淀已经溶解尿素溶液中。

溶解在8mol/L尿素溶液中的蛋白质呈变性状态，为了得到天然状态的蛋白质需要经过复性处理。复性具体包括如下步骤：

将50ml尿素溶液通过稀释复性的方法缓慢滴加到装有450mL1×PBS缓冲液的烧杯中，烧杯放置在磁力搅拌器上通过磁浮转子保持缓慢搅拌，控制滴加速度为5mL/h。待滴加完成后，继续保持缓慢搅拌2-3h，将烧杯中的溶液离心(8000rpm,10min)，沉淀弃去，取上清过固定化金属离子(Ni²⁺)层析纯化。

纯化方法如下：

将装有16mL Ni-IDA 6FF琼脂糖纯化树脂的纯化柱用1×PBS缓冲液平衡，之后将上清液上样，然后用1×PBS缓冲液冲洗层析柱，再用含有不同浓度咪唑的1×PBS缓冲液梯度洗脱，其中咪唑浓度依次为50mmol/L；100mmol/L；200mmol/L。

收集洗下来的各组分，各加入loading buffer制成上样样品，SDS-PAGE凝胶电泳。实验结果见附图2。可以看出，100mmol/L咪唑和200mmol/L咪唑的洗脱样品中有目标蛋白，因为复性液未进行热处理，洗脱样品中目标蛋白的纯度远不如实施例1热处理之后的纯化样品。

后续将100mmol/L咪唑和200mmol/L咪唑的洗脱样品进一步纯化，经检测确认回收的Taq DNA聚合酶具有活性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，其包括如下步骤：将经热变性处理后的待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合，经冻融处理，然后采用稀释复性的方法使得蛋白混合液中的蛋白复性，再对复性后的蛋白混合液进行分离纯化。

2.根据权利要求1所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述稀释复性是指：降低尿素的浓度以使得蛋白混合液中的蛋白复性。

3.根据权利要求2所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述稀释复性包括：将冻融后的蛋白混合液缓慢加入缓冲液中；

优选地，以3-5mL/h的速度将混合液加入缓冲液中。

4.根据权利要求3所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述稀释复性后的分离纯化步骤包括：将蛋白混合液进行离心去除沉淀，然后取上清液进行层析纯化；

优选地，所述纯化是指将上清液过固定化金属离子层析纯化。

5.根据权利要求4所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，将上清液过Ni²⁺层析柱，再用不同浓度咪唑的1×PBS缓冲液对层析柱进行梯度洗脱，收集洗脱液。

6.根据权利要求5所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，上清液过Ni²⁺层析柱后，先用1×PBS缓冲液冲洗层析柱，再依次用含50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L咪唑的1×PBS缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。

7.根据权利要求1所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述热变性处理是指在60-70℃下热处理10-15min；

优选地，所述待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合以形成混悬液，所述尿素溶液的浓度为2-8mol/L；

优选地，所述待回收蛋白沉淀与尿素溶液混合后，在摇床上震荡2-3h以形成混悬液。

8.根据权利要求7所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述冻融是指：将所述混悬液置于-15～-20℃下冷冻，而后置于室温下解冻；

优选地，在-15～-20℃下冷冻6-24h。

9.根据权利要求1-8任一项所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述耐热性蛋白质选自耐热核酸酶或耐热植酸酶。

10.根据权利要求9所述的耐热性蛋白质的回收方法，其特征在于，所述耐热核酸酶选自Taq DNA聚合酶、耐热核酸酶HII、核糖核酸酶A、牛小肠碱性磷酸酶或酵母焦磷酸酶。

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