CN110951814B - 利用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素e合成酶-1制备前列腺素e1的方法 - Google Patents

利用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素e合成酶-1制备前列腺素e1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用基因工程环氧合酶‑1和基因工程前列腺素E合成酶‑1制备前列腺素E1的方法，属于生物工程领域。该方法通过原核表达的手段表达出前列腺素E1合成所需要的相关酶，即环氧合酶‑1(COX‑1)和前列腺素E合成酶‑1(mPGES‑1)，利用酶与底物反应，进而合成出前列腺素E1。通过此法可以大量表达前列腺素合成酶并且合成出前列腺素E1，能够避免工业生产中活体上取下的组织酶容易污染的问题。同时原核表达出来的酶种类比较单一，表达的酶的浓度也比较高，而且大肠杆菌系统有机物杂质较少，酶促反应后的产物杂质相对较少，有利于前列腺素E1的纯化和利用，为人工合成前列腺素E1开辟了一条新的路径。

Description

利用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1制 备前列腺素E1的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种利用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1制备前列腺素E1的方法。
背景技术
前列腺素(PG)是一组生理活性脂质化合物，称为类二十烷酸，在动物中具有多种激素性作用。前列腺素E1(Prostaglandin E1)为前列腺素家族中的一员，又名前列地尔，是广泛存在于体内的生物活性物质，是一种公认的内源性生理活性物质，具有明显扩张血管作用，还有抑制血小板聚集，降低血液黏度和红细胞聚集性，改善微循环等作用，此外，其对血管内皮有保护作用，防止动脉粥样化脂质斑块形成和改善神经损害等，在临床使用上得到广泛认可，然而天然存在的前列腺素E1含量甚微，所以合成前列腺素E1的研究既具有理论意义，又具有实用价值。
目前的前列腺素E1的制备方法不少，工业上多以羊精囊为原料进行PGE1粗品的制备，具体如下：以羊精囊为原料，经酶制备、孵育、有机溶剂提取、硅胶柱分离制得，如公开号CN105316384A的一种前列腺素E1的制备方法。虽然这种方法现在为合成前列腺素E1的主要方法，但是对新鲜羊精囊的需求量很大，而且活体上取下的组织酶容易造成污染，使整个酶促反应全部失败，同时杂质也较多，不利于前列腺素E1的纯化和利用。因此能够有效的生产前列腺素E1的方法急需优化和改善。
发明内容
本发明针对上述前列腺素E1制备方法的不足，目的是提供一种新的制备前列腺素E1的方法，该方法是利用基因工程手段合成前列腺素E1合成所需要酶(即COX-1和mPGES-1酶)，然后将酶与底物混匀，利用酶促反应合成前列腺素E1。解决了工业上生产前列腺素E1中容易造成反应体系污染，对鲜酶需求量过大，产物杂质过多等问题。
为了实现上述目的，本发明提供了一种前列腺素E1的制备方法，采用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1与底物反应，进而合成出前列腺素E1。
其中，所述底物为氢醌、谷胱甘肽和二高-γ-亚麻酸混合物。环氧合酶(cyclooxygenase,COX)，是前列腺素(PGs)合成所必须的酶，也是PGs合成初始步骤中的关键性限速酶，又称环氧化物水化酶，全称为环氧化物水解酶，能够催化二高-γ-亚麻酸形成羟基化合物PGH1。前列腺素E合成酶(mPGES-1)，它在谷胱甘肽(glutathione，GSH)存在时能非常特异地将PGH1转化成PGE1。
优选地，所述基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1均通过原核系统表达。
大肠杆菌表达系统是一种原核表达系统，它的遗传图谱十分清晰、生理特性明确、基因工程操作比较熟练、所需培养基和营养物质地点、细菌分裂速度快、非常适合发酵生产。同时，大肠杆菌能够高效和大量表达重组蛋白，产生的重组蛋白可占大肠杆菌总蛋白量的30％。大肠杆菌是研究生物工程领域的一种重要模式生物。大肠杆菌表达系统一般是由表达载体、外源目的基因和宿主菌组成。
本发明通过基因重组技术，将优化后的环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1的基因与表达载体连接，通过转化的方式导入原核系统表达系统大肠杆菌中，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导两个重组载体表达COX-1和mPGES-l酶，然后通过大量试验摸索，获得合成前列腺素E1的工艺条件，将COX-1和mPGES-l酶与底物(氢醌、谷胱甘肽和二高-γ-亚麻酸混合物)反应合成前列腺素E1，并用高效液相和质谱的手段验证前列腺素E1成功合成。
具体地，本发明通过GENE BANK中查找获取羊的环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因的编码区，查找在大肠杆菌中不能表达的氨基酸及其对应的密码子，然后优化环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因将大肠杆菌不能表达的密码子替换掉，保证优化后的基因能够在大肠杆菌中表达并且具有活性。优选地，所述基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1的基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
表达载体是大肠杆菌表达系统的核心组成，优选地，本发明中，所述基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1基因的表达载体为pET-28a。具体地，在优化后的环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因的序列的两端，分别添加HindⅢ酶和BamHⅠ酶的没切位点序列，合成pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1重组质粒。对合成后的重组质粒进行验证，并将重组的表达质粒分别转入表达菌株大肠杆菌。优选地，连接环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因的两个重组载体pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1的转化体为大肠杆菌BL21(DE3)。
此外，根据大量的试验摸索，基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1的提取方法优选为：重悬各菌体，在12000rpm的条件下离心得到菌体沉淀；用等体积PB：EDTA-2Na混合缓冲液分别重悬两种菌体，PB：EDTA-2Na的混合比例为4～10:0～6，更优选为6:4，对重悬菌体进行超声破碎，超声条件为：工作10s，间歇10s，循环20min，功率200w；对破碎的菌体分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min，去除细胞残，收集上清液，即得。为了得到高纯度的酶，可过镍柱纯化。
根据大量的试验摸索，上述前列腺素E1的制备方法中，酶与底物反应条件优选为32～37℃、pH7.8～8下反应15～40min，更优选37℃、pH7.8下反应30min，后加入乙腈终止反应，12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜，得到前列腺素E1。
在上述技术方案中，本发明的方法制备前列腺素E1的合成机制为：
二高-γ-亚麻酸(DGLA)经环氧合酶-1(COX-1)催化生成PGG1，从二高-γ-亚麻酸的C-9和C-11中提取氢原子，引入O2与产生的碳自由基形成C-9/C11内过氧化物，C-8和C-12之间环化形成碳碳双键，随后C-15位置再一次氧化添加一个O2，进而形成PGG1。PGG1随后可以被环氧合酶的过氧化物酶活性还原(因此在还原剂例如谷胱甘肽的存在的条件下)形成PGH1(PGH1为一种极其不稳定的前列腺素物质)。PGH1在前列腺素E合成酶-1(mPGES-1)的作用下转化成PGE1。
与现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明提供一种新的前列腺素E1的制备方法，通过原核表达的手段表达出前列腺素E1合成所需要的相关酶，即环氧合酶-1(COX-1)和前列腺素E合成酶-1(mPGES-1)，利用酶与底物反应，进而合成出前列腺素E1。通过此法可以大量表达前列腺素合成酶并且合成出前列腺素E1，能够避免工业生产中活体上取下的组织酶容易污染的问题。同时原核表达出来的酶种类比较单一，而且表达的酶的浓度也比较高，而且大肠杆菌系统有机物杂质较少，酶促反应后的产物杂质相对较少，有利于前列腺素E1的纯化和利用，为人工合成前列腺素E1开辟了一条新的路径。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明前列腺素E1的理论合成途径。
图2为本发明前列腺素E1的合成路线。
图3为本发明实施例2重组质粒pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1的电泳图。图3A的泳道1为DNA marker，泳道2-5为质粒pET-28a-COX-1；图3B的泳道1为DNA marker，泳道2-5为质粒pET-28a-mPGES-1。
图4为本发明实施例2重组质粒pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1双酶切鉴定结果。图4A的泳道1为DNA marker，泳道2、3为COX-1双酶切(1479bp)，泳道4为COX-1质粒；图4B的泳道1为DNA marker，泳道2为mPGES-1，泳道3、4、5为COX-1双酶切(471bp)。
图5为本发明实施例3重组蛋白COX-1和mPGES-1的鉴定。图5A的泳道1为蛋白marker；2为未诱导pET-28a-COX-1-DE3表达的细菌总蛋白；3.4.5:pET-28a-COX-1-DE3诱导表达的细菌总蛋白；6.7.8：pET-28a-COX-1-DE3诱导后，超声破碎后的上清部分。
图5B的泳道1为蛋白marker，2：未诱导的pET-28a-mPGES-1-DE3诱导表达的细菌总蛋白；3.4.5:pET-28a-mPGES-1-DE3诱导表达的细菌总蛋白；6.7：pET-28a-mPGES-1-DE3诱导后，超声破碎后的上清部分。
图6为本发明实施例4重组蛋白COX-1和mPGES-1镍柱纯化结果。图6A的泳道1为蛋白marker，2:pET-28a-COX-1-DE3诱导表达的细菌总蛋白；3、4：COX-1蛋白纯化结果；图6B的泳道4为蛋白marker，3:pET-28a-mPGES-1-DE3诱导表达的细菌总蛋白；1、2：mPGES-1蛋白纯化结果。
图7为本发明实施例5前列腺素E1的标准品和反应底物的高效液相色谱。图7A标准品，图7B为反应底物。
图8为本发明实施例5反应结束和反应前对照的高效液相色谱。图8A为反应结束后，图8B为反应前。
图9为本发明实施例5标准品质谱图。
图10为本发明实施例5反应结束质谱图。
图11为本发明实施例5液相与质谱联用结果。
图12为本发明实施例6峰面积与前列腺素E1含量的关系标准曲线。
图13为本发明实施例6反应时间与前列腺素E1含量的关系。
图14为本发明实施例6反应缓冲液比例与前列腺素E1含量的关系。
图15为本发明实施例6反应pH值与前列腺素E1含量的关系。
图16为本发明实施例6反应温度与前列腺素E1含量的关系。
具体实施方式
本发明提供的前列腺素E1的制备方法的合成机制为：
二高-γ-亚麻酸(DGLA)经环氧合酶-1(COX-1)催化生成PGG1，从二高-γ-亚麻酸的C-9和C-11中提取氢原子，引入O2与产生的碳自由基形成C-9/C11内过氧化物，C-8和C-12之间环化形成碳碳双键，随后C-15位置再一次氧化添加一个O2，进而形成PGG1。PGG1随后可以被环氧合酶的过氧化物酶活性还原(因此在还原剂例如谷胱甘肽的存在的条件下)形成PGH1(PGH1为一种极其不稳定的前列腺素物质)。PGH1在前列腺素E合成酶-1(mPGES-1)的作用下转化成PGE1。前列腺素E1的理论合成途径如图1所示。本发明的具体合成路线如图2所示。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1重组质粒构建和鉴定
通过NCBI中查找获取羊的环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因的编码区，环氧合酶-1在NCBI中基因ID为443551、氨基酸参考序列代码为XP_027821574.1，前列腺素E合成酶-1在NCBI中基因ID为9536、氨基酸参考序列代码为NP_004869.1。查找在大肠杆菌中不能表达的氨基酸及其对应的密码子，然后优化环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因将大肠杆菌不能表达的密码子替换掉，保证优化后的基因能够在大肠杆菌中表达并且具有活性。优化后的环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1的基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
在优化后的环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1基因的序列的两端，分别添加HindⅢ酶和BamHⅠ酶的酶切位点序列，输入到高通量DNA合成仪中合成，将合成的片段插入到pET-28a载体中，送交武汉金开瑞生物工程有限公司合成pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1重组质粒。
对合成后的重组质粒进行验证，并将重组的表达质粒分别转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，对转入后质粒重新进行测序验证。
实施例2重组表达菌株制备和鉴定
1、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞
(1)菌种活化：将-180℃超低温冰箱中储存的大肠杆菌BL21(DE3)按照1:50的接种比例接种到5mL LB液体培养基中，将培养基置于37℃的恒温摇床中，调节160rpm/分钟震荡培养过夜(12-16小时)，至OD600＝0.4左右。
(2)菌种扩大：取100μl上一步活化的菌种，将其加入到5ml灭菌后的LB液体培养基中，在恒温摇床中37℃，160rpm/min振荡培养2小时。
(3)用移液枪取1ml上一步扩大后的菌液，分装到1.5ml的EP管中，冰浴冷却30min，4℃4000rpm 10min收集菌体。
(4)弃上清，保留沉淀，并200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液加入到离心下来的沉淀中，用微量移液器将菌体沉淀吹打混匀，将混匀的菌种放置到冰盒上30分钟以上。
(5)冰浴后，将冷却后的菌种在4℃条件下以4000rpm离心10分钟，弃去上清液并保留沉淀，再次加入200μl预先冷却的0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液器轻柔吹打菌体使之混匀重悬。
(6)将200μL感受态细胞平均分装到两个无菌的离心管中，每个离心管中含有100μL感受态细胞，放置在冰上待用；或者，可以加入20μL的40％灭菌后的甘油，并在-80℃超低温冰箱中保存，待用。
2、转化
(1)向上面制备好的100μL感受态细胞加入1μL重组的质粒，用移液器反复吸取吹打混匀质粒，在冰上放置30分钟以上，在此期间轻轻摇动3次；
(2)冰浴完成以后，小心快速地将冰浴后的离心管转移到42℃水浴中，热冲击90秒钟，立即取出并在冰上放置3分钟；
(3)将600μL预先在37℃预热过的LB培养基加入离心管中；
(4)在恒温振荡培养箱中80rpm振荡30分钟，再以110rpm振荡30分钟，再以150rpm振荡30分钟；(5)12000rpm离心1分钟；
(6)在超净工作台中，弃去部分上清，利用剩余上清用微量移液器反复吸取吹打菌体沉淀，从而使菌体重悬，再倒入配置好的Kan/LB琼脂平板上，晃匀后，正放于37℃恒温箱中培养1小时，然后倒置平板，37℃恒温培养过夜。
3、重组表达菌株的鉴定
在超净工作台中，将从上面随机挑取的单菌落放入5ml LB液体培养基中，在恒温振荡培养过夜，37℃180rpm。提取质粒DNA。具体方法如下：
(1)根据菌株的浓度，取1-5ml上述过夜培养的菌液用1.5ml EP管多次收集，在4℃低温，12000rpm离心2min，弃去上清部分培养基，保留菌体沉淀；
(2)向离心收集的细菌沉淀中加入250μL 4℃储存的缓冲液(Buffer)P1，用移液器混匀细菌沉淀，将小的细菌块打碎。注释：Buffer P1中确认已经加入Rnase A，4℃保存；
(3)向上述EP管中加入250μL Buffer P2，温和地上下翻转混匀6-8次使菌液充分裂解，直到EP内的液体澄清透明。注：避免剧烈摇晃，否则将基因组DNA污染，这一步不应该超过5min；
(4)向EP管中加入350μL Buffer P3，温和并且充分的上下翻转混匀6-8次直到EP管内出现白色絮状沉淀，室温条件下放置2分钟完全除去RNA；
(5)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)在4℃条件下，12000rpm离心10min，使用微量移液器小心地将上清液全部移到吸附柱里面(注意移液器不能够吸取到离心下来的沉淀)，并在4℃条件下以12000rpm离心1min，然后将收集管中的所有液体倒掉，并将吸附柱重新放置到同一个收集管内。
(7)将500μL Buffer PD加入到收集管内，用来洗脱吸附柱上的蛋白，并在4℃条件下12000rpm离心1min。然后，将收集管内的所有液体排出，并将吸附柱放置到同一收集管内；
(8)将600μL漂洗液PW加入到吸附柱CP3中(请先检测是否已加入无水乙醇)，离心1min，倒入收集管中的废液，将吸附柱CP3放入到收集管中。
(9)重复上一步操作；
(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心，目的是将吸附柱中残留的漂洗液PW去除干净；
(11)将吸附柱敞开口放置到室温条件下20min，晾干后，向吸附膜中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。将获得的质粒DNA溶液部分用于继续试验，剩余DNA溶液放置在-20℃冻存备用；
(12)利用上一步提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，双酶切鉴定，对鉴定阳性菌株进行测序鉴定。
质粒双酶切的反应条件：反应体系如表1所示:
表1双酶切反应体系
Figure BDA0002346039780000091
按照上表混合好反应体系，将反应体系转移至37℃恒温培养箱中，双酶切2小时，将酶切反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。
实验结果：
1、重组质粒pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1的提取结果
对重组表达菌株COX-1-pET-28a-BL21(DE3)和mPGES-1-pET-28a-BL21(DE3)构建成功后，提取质粒DNA。
通过琼脂糖凝胶电泳对质粒进行分析，图3A中，1号为DNA MarkerDL15000，2-5号为pET-28a-COX-1质粒条带明显，成功提出pET-28a-COX-1质粒。图3B中，1号为DNA MarkerDL15000，2-5号为pET-28a-mPGES-1质粒条带明显，成功提出pET-28a-mPGES-1质粒。
2、重组质粒双酶切鉴定结果
在构建pET-28a-COX-1和pET-28a-mPGES-1质粒时，分别在两个目的基因的5’端添加了Hind III的酶切位点，同时在3’端添加了BamHⅠ的酶切位点，用Hind III和BamHⅠ酶分别对上面提取的质粒进行双酶切。
图4A中pET-28a-COX-1质粒双酶切得到两条条带，COX-1条带大小为1479bp，双酶切得到的COX-1与DNA Marker对照的结果与基因的大小相符，结果正确。
图4B中pET-28a-mPGES-1质粒双酶切得到两条条带，mPGES-1条带大小为471bp，双酶切得到的mPGES-1与DNA Marker对照的结果与基因的大小相符，但是由于mPGES-1基因比较小，显示的条带不是很清晰，但是结果正确。
实施例3环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1蛋白表达
本发明通过大肠杆菌BL21(DE3)表达重组质粒pet-28a-COX-1和pet-28a-mPGES-1，并向培养体系中加入一定浓度的IPTG诱导表达，获得目的蛋白COX-1和mPGES-1。因为在设计表达基因时在基因的两端加入组氨酸标签，所以用组氨酸标签抗体通过免疫印迹的方法对表达的目的蛋白进行验证。
1、重组菌株的诱导表达过程：
(1)菌种活化：在超净台内，将重组菌株BL21(DE3)-pet-28a-COX-1和BL21-(DE3)-pet-28a-mPGES-1按照1:50的比例分别接种到5ml LB培养基中，并以1:1000的比例加入5μL卡那霉素，在37℃恒温摇床中以180rpm培养过夜(12-16小时)；
(2)扩大培养：将活化好的两种菌株BL21(DE3)-pet-28a-COX-1和BL21-(DE3)-pet-28a-mPGES-1按照1:50的比例分别接种到两个200ml的LB液体培养基中，并各加入200ul卡那霉素(30mg/ml)，每种菌株培养1000ml，在37℃恒温摇床中以180rpm培养2-3小时，相同条件下培养上面的菌株作为对照。
(3)向扩大好的培养基中各加入20ul 1M IPTG母液，在16℃恒温摇床中以120rpm培养24小时(注释：原核表达中低温，低速和长时间诱导培养可以较好地表达可溶性蛋白)，对照中不加入诱导剂；
(4)收集菌体：将上述两种经IPTG诱导后的菌液分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min，弃去上清，保留沉淀；
(5)菌体沉淀洗涤：向收集到的沉淀中加入10ml预冷的PBS溶液将上述两种沉淀重悬，混合均匀，并在4℃条件下，12000rpm离心10min，弃去上清，保留沉淀，重复洗涤3次，然后用PBS混匀后冷冻，在室温条件下溶解，反复冻融3次；
(6)超声破碎：用75％的酒精棉擦拭超声破碎仪的探头，将解冻的菌体放入装满碎冰的烧杯中。超声条件：工作10s，间歇10s，循环20min，功率200w；
(7)总蛋白收集：待菌体超声完毕后，对破碎的菌体分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min，取上清液，丢弃沉淀，原核表达的前列腺素相关合成酶COX-1和mPGES-1酶可溶性蛋白存在于上清；
(8)将收集好的上清(粗酶液)，进行蛋白电泳检测。
2、重组蛋白COX-1和mPGES-1电泳检测结果
对诱导表达后的总蛋白及上清进行SDS-PAGE凝胶电泳检测分析，COX-1蛋白由493个氨基酸组成，大小约为53.8kDa。mPGES-1蛋白由157个氨基酸组成，大小约为17.1kDa。
如图5A所示，通过将重组菌株pET-28a-COX-1-DE3诱导表达后的结果与重组菌株pET-28a-COX-1-DE3未诱导表达的结果对比发现，在大约53.8kDa位置处，诱导后的细菌总蛋白条带中有一条清晰的蛋白条带，而未诱导表达的总蛋白条带中没有，上清中也存在与COX-1蛋白对应的条带，表明目的蛋白COX-1得到了成功的表达。
如图5B所示，通过将重组菌株pET-28a-mPGES-1-DE3诱导表达后的结果与重组菌株pET-28a-mPGES-1-DE3未诱导表达的结果对比发现，在大约17.1kDa位置处，诱导后的细菌总蛋白条带中有一条清晰的蛋白条带，而未诱导表达的总蛋白条带中没有，上清中也存在与mPGES-1蛋白对应的条带，表明目的蛋白mPGES-1得到了成功的表达。
实施例4环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1蛋白的纯化
1、利用镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行分离纯化。具体的操作步骤如下：
(1)首先收集两种蛋白的可溶上清部分，在4℃层析柜中使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤两种上清两次，主要是为了防止上清中较大的颗粒杂质堵塞镍柱。
(2)镍柱的预处理：将20％的乙醇从镍柱中全部倒掉，加入PBS(预先用0.22μm的滤膜过滤一次)清洗掉镍柱中的乙醇，加入PBS的体积为20倍柱体积左右。
(3)柱的平衡处理：在镍柱清洗完毕后，将10倍柱体积的NPI-1(经0.22μm滤膜过滤)加入到镍柱中，使其在重力作用下流出，对镍柱进行平衡。
(4)上样：将过滤好的总蛋白上清溶液加入到镍柱中，使上清流到收集管内，再次将流出液上样，液体流出后进入废液刚。
(5)洗壁：对上清上样后，将10倍柱体积的NPI-1(经0.22μm滤膜过滤)加入到镍柱中，液体流出后进入废液刚。
(6)洗涤杂蛋白：向镍柱中加入10ml NPI-20(经0.22μm滤膜过滤)，清洗掉镍柱中存在的杂蛋白，为了彻底除掉杂蛋白，可以再加入10ml NPI-30，液体流出后进入废液刚。
(7)洗脱环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1蛋白：在将杂蛋白洗掉后，加入10倍柱体积的NPI-200(经0.22μm滤膜过滤)，洗脱镍柱上的目的蛋白，收集完毕后的蛋白溶液放入到4℃冰箱中，以备后续实验处理。
(8)实验后的镍柱处理：首先用10ml1％的冰醋酸溶液(经0.22μm滤膜过滤)对镍柱进行清洗，在使用PBS(经0.22μm滤膜过滤)清洗掉镍柱上附着的冰醋酸，清洗完毕后，使用5ml20％的乙醇溶液对镍柱进行液封，置于4℃条件下，保存。
2、透析袋的处理
(1)将透析袋剪断到合适长度，一般长度为10-20cm。
(2)将透析袋在含2％(m/v)的碳酸氢钠和1mmol/l EDTA的溶液(pH8.0)的沸水中煮10min，取出透析袋用超纯水对透析袋进行清洗。
(3)用专用的夹子夹住透析袋一边，由透析袋的另一侧向透析袋注入超纯水，检验透析袋是否有破损漏液的现象。
3、环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1蛋白的透析
将4℃保存的纯化后的蛋白样品取出，用夹子夹住透析袋的一侧，用微量移液器将蛋白样品分别注入到透析袋内，并用夹子夹紧透析袋的另一侧，确保透析袋不会漏液。将透析袋放入装有1L PBS的烧杯中，同时在烧杯内放置到磁力搅拌器上，同时在烧杯内放入一个转子转动PBS，进行透析除去盐离子。转子的转动速度不宜过快，每12小时更换一次PBS缓冲液，反复透析4次。透析的整个过程保证在4℃条件下进行，能够使酶不丧失活性。
4、环氧合酶-1和前列腺素E合成酶-1蛋白的浓缩
蛋白溶液透析后利用蔗糖进行浓缩，具体操作：在一个干净平皿的底部放置两张干净的滤纸，在滤纸中间放置一层较厚的蔗糖晶体，将透析袋放置到滤纸上，然后在透析袋上依次放置一张滤纸和一层蔗糖，在4℃冰箱内进行蛋白浓缩，当浓缩到只剩下2-3ml蛋白时，用移液器将浓缩后的蛋白转移到1.5ml离心管内，并储存于-20℃冰箱内。
通过镍亲和层析柱对重组菌株pET-28a-COX-1-DE3表达的上清蛋白进行分离纯化，经过透析去除多余咪唑，经过浓缩后获得高浓度高纯度的COX-1蛋白。如图6A所示，大概在位于54.1kDa左右位置处有明显的一条条带，这说明COX-1蛋白顺利纯化。
通过镍亲和层析柱对重组菌株pET-28a-mPGES-1-DE3表达的上清蛋白进行分离纯化，经过透析去除多余咪唑，经过浓缩后获得高浓度高纯度的mPGES-1蛋白。如图6B所示，大概在位于17.2kDa左右位置处有明显的一条条带，这说明mPGES-1蛋白顺利纯化。
实施例5前列腺素E1合成与鉴定
反应底物的制备：用分析天平准确称取氢醌0.00083g，谷胱甘肽0.01245g，二高-γ-亚麻酸40μl加入到烧杯中，加入5mLPB缓冲液和5mlEDTA-2Na缓冲液，分装到15ml的离心管内，4℃冰箱内保存。
(1)由实施例3分别取得的COX-1和mPGES-1的粗酶液，用移液器分别吸取COX-1和mPGES-1的粗酶液200μl，一起加入到已经灭菌的1.5ml离心管内，再向离心管内加入400μl的反应底物混匀，将反应体系置于37℃的恒温水浴锅中，反应1h(反应中反复混匀反应体系，并且打开盖子反复吹打，使体系进入更多氧气促进反应的发生)，向反应体系加入50μl的乙腈与体系混匀终止反应。然后在12000rpm条件下离心20min，取100μl处理后的反应液，过0.22μm微孔滤膜，对所得样品进行高效液相和质谱鉴定，前列腺素E1的峰面积积分不能小于2000。
(2)分别用移液器分别吸取COX-1和mPGES-1的粗酶液200μl，一起加入到已经灭菌的1.5ml离心管内，向体系中加入25μl乙腈和20μl浓盐酸与体系混匀，然后在12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜。
(3)向上一步获得的样品中加入400μl的反应底物，再加入25μl乙腈然后在12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜，对所得样品进行高效液相鉴定，作为对照。高效液相条件条件见表4。
(4)取适量反应底物和前列腺素E1的标准品，过0.22μm微孔滤膜，对底物和标准品分别向高效液相进样，作为对照。
(5)观察高效液相的峰谱图，将目的峰对应的流出检测液进行回收，在通风橱内内进行蒸馏浓缩，然后对浓缩液进行质谱鉴定。
(6)对前列腺素E1的标准品进行质谱鉴定。
表4高效液相条件
Figure BDA0002346039780000141
表4-4质谱条件
Figure BDA0002346039780000142
Figure BDA0002346039780000151
实验结果：
前列腺素E1的高效液相鉴定
前列腺素E1进行定性和定量测量最被公认的方法是高效液相色谱法，药典中对前列腺素E1鉴定也是通过高效液相手段进行定性和定量的。
由图7A可以看出标准品在高效液相色谱图中的保留时间为16.352min，反应底物在高效液相色谱图中10min以后，没有任何有效峰出现。由图7B可以看出反应结果在16.457min处出现有效峰，峰面积积分大于2000，而反应前10min以后未出现任何有效峰。
由图8可以看出反应前无PED1，反应后产生了PED1。
由图9可以看出质谱图中标准品中的分子量为353.2，由图10与图11可以看出质谱图显示出反应结果和液相纯化的结果都存在分子量为353.2的物质，与标准品对应。
实施例6前列腺素E1合成条件的优化
反应底物的制备：用分析天平准确称取氢醌0.00083g，谷胱甘肽0.01245，二高-γ-亚麻酸40μl加入到烧杯中，加入10mLPB缓冲液，分装到15ml的离心管内，4℃冰箱内保存。
前列腺素E1标准品的制备：用分析天平准确称取前列腺素E1，加入到1.5ml灭过菌的离心管内，再加入1ml无水乙醇(色谱级)，混匀。
前列腺素E1的含量曲线：精确称取前列腺素E1的标准品1.12mg，精确加入无水乙醇(色谱级)1ml，过0.22μm微孔滤膜，用无水乙醇逐步将标准品稀释2、4、8、16倍，然后进行高效液相测定标准品的峰面积，标准品的峰面积的积分值不可以小于2000。根据峰面积与标准品浓度的关系绘制标准曲线，标准曲线如图12所示。
高效液相条件检测波长：214nm；流速：1.0ml/min；流动相：乙腈：0.02mol磷酸二氢钾(pH4.9)＝30:70；色谱柱：C18反向色谱柱；进样量：10μl；前列腺素E1的峰面积积分不能小于2000。
1、反应时间对前列腺素E1合成的影响
取实施例3步骤(5)的重悬菌体，在5℃，12000rpm的条件下离心得到菌体沉淀，用PB：EDTA-2Na缓冲液(6:4)10ml分别重悬两种菌体，对菌体进行超声破碎，超声条件：工作10s，间歇10s，循环20min，功率200w。对破碎的菌体分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min，取上清，得粗酶液。用移液器分别吸取重悬的COX-1和mPGES-1的粗酶液3ml，加入到已经灭菌50ml离心管内，再向离心管内加入6ml的反应底物混匀，调节pH值到7.8，在37℃的水浴锅中反应，在反应达到5，10、15、20、25、30、35和40min时依次取出反应体系400μl，加入400μl乙腈，然后进在12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜，对所得样品进行高效液相鉴定和峰面积测定。
结果如图13所示，反应时间在15min基本完成，15-40min反应时间内前列腺素E1合成含量较高，优选时间为30分钟，前列腺素E1合成含量最高。
2、缓冲液比例对前列腺素E1合成的影响
取实施例3步骤(5)的重悬菌体，每种酶平均分成5份，在5℃，12000rpm的条件下离心得到菌体沉淀，用不同比例PB：EDTA-2Na缓冲液(10:0、8:2、6:4、4:6、2:8)混合缓冲液2ml分别重悬两种菌体，对菌体进行超声破碎，超声条件：工作10s，间歇10s，循环20min，功率200w。对破碎的菌体分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min，取上清液，即为粗酶液。用移液器分别吸取用相同比例缓冲液重悬的COX-1和mPGES-1的粗酶液200μl，加入到已经灭菌的1.5ml离心管内，再向离心管内加入400μl的反应底物混匀，调节pH值到7.8，在37℃的水浴锅中反应1h，向反应体系加入400μl的乙腈与体系混匀，然后在12000rpm条件下离心20min，然后取离心后的体系400μl，并加入400μl乙腈，然后进行在12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜，对所得样品进行高效液相鉴定和峰面积测定。
结果如图14所示，PB：EDTA-2Na采用4～10:0～6的缓冲液比例时，前列腺素E1合成含量较高，优选PB：EDTA-2Na为6:4，前列腺素E1反应产物最多。
3、反应pH值对前列腺素E1合成的影响
取实施例3步骤(5)的重悬菌体，在5℃，12000rpm的条件下离心得到菌体沉淀，用PB：EDTA-2Na缓冲液(6:4)10ml分别重悬两种菌体，对菌体进行超声破碎，超声条件：工作10s，间歇10s，循环20min，功率200w。对破碎的菌体分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min。用移液器分别吸取重悬的COX-1和mPGES-1的粗酶液1ml，加入到已经灭菌的5ml离心管内，再向离心管内加入2ml的反应底物混匀，分别调节反应体系的pH值为6.5、7.0、7.5、7.8、8.0、8.5和9.0，在37℃的水浴锅中反应1h，取400μl反应后的体系并加入400μl乙腈，然后在12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜，对所得样品进行高效液相鉴定和峰面积测定。
结果如图15所示，反应体系的pH值为7.8-8.0时，前列腺素E1合成含量较高，优选pH值为7.8，前列腺素E1合成含量最高。
4、反应温度对前列腺素E1合成的影响
取实施例3步骤(5)的重悬菌体，在5℃，12000rpm的条件下离心得到菌体沉淀，用PB：EDTA-2Na缓冲液(6:4)10ml分别重悬两种菌体，对菌体进行超声破碎，超声条件：工作10s，间歇10s，循环20min，功率200w。对破碎的菌体分别离心，4℃条件下，12000rpm离心10min。用移液器分别吸取重悬的COX-1和mPGES-1的粗酶液1ml，加入到已经灭菌的5ml离心管内，再向离心管内加入2ml的反应底物混匀，调节pH值到7.8，分别在温度在22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、47℃的水浴锅中反应1h，取400μl反应后的体系并加入400μl乙腈，然后在12000rpm条件下离心20min，过0.22μm微孔滤膜，对所得样品进行高效液相鉴定和峰面积测定。
结果如图16所示，反应温度采用27℃～42℃时，前列腺素E1合成含量较高，优选温度37℃，前列腺素E1合成含量最高。
对所公开的实施例的上述说明，目的是使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
序列表
<110> 长春理工大学
<120> 利用基因工程环氧合酶-1 和基因工程前列腺素 E 合成酶-1 制备前列腺素 E1的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ggatccatgc gtctggttct gaccgttcgt agcaatctga ttccgagtcc gcctacctat 60
aacattgcac atgattatat cagctgggag agctttagca acgttagcta ttatacccgt 120
attctgccga gcgttccgcg tgattgtccg acaccgatgg gcaccaaagg taaaaaacag 180
ctgccggatg cagaatttct gagccgtcgt tttctgctgc gtcgcaaatt tatccctgat 240
ccgcagggca ccaatctgat gtttgcattt tttgcacagc atttcaccca ccagtttttc 300
aaaaccagcg gtaaaatggg tccgggtttt accaaagcat taggtcatgg tgttgatctg 360
ggtcatattt atggtgataa tctggaacgt cagtatcagc tgcgtctgtt taaagatggc 420
aaactgaaat atcagatgct gaacggtgaa gtttatccgc ctagcgttga agaggcaccg 480
gttctgatgc attatccgcg tggtattccg cctcagagcc agatggcagt tggtcaagaa 540
gtttttggtc tgctgcctgg tctgatgctg tatgcaacca tttggctgcg tgaacataat 600
cgtgtttgtg atctgctgaa agcagaacat ccgacctggg gtgatgaaca actgtttcag 660
accgcacgtc tgattctgat tggtgaaacc attaaaatcg tgatcgaaga gtatgtgcag 720
cagctgagcg gttattttct gcagctgaaa tttgatccgg aactgctgtt tggtgcacag 780
tttcagtatc gtaatcgtat cgccatggaa ttcaatcagc tgtatcattg gcatccgctg 840
atgccggata gctttcgtgt tggtccgcag gattatagct atgaacagtt tctgtttaac 900
acgagcatgc tggttgatta tggtgtggaa gcactggttg atgcatttag ccgtcagcct 960
gcaggtcgta ttggtggtgg tcgtaatatt gatcatcata ttctgcatgt tgccgtggac 1020
gttattaaag aaagccgtgt tctgcgtctg cagccgttta atgaatatcg taaacgcttt 1080
ggcatgaaac cgtataccag ctttcaagaa ctgaccggtg aaaaagaaat ggcagcagaa 1140
ctggaagaac tgtatggcga tattgatgcc ctggaatttt atcctggcct gctgctggaa 1200
aaatgtcatc cgaatagcat ttttggcgaa agcatgattg aaatgggtgc accgtttagc 1260
ctgaaaggtc tgctgggtaa tccgatttgt agtccggaat attggaaagc aagcaccttt 1320
ggcggtgaag tgggttttaa tctggttaaa accgccacac tgaaaaagct ggtttgtctg 1380
aataccaaaa cctgtccgta tgttagcttt catgttccag atccgcgtca agaggatcgt 1440
ccgggtgttg aacgtcctcc gaccgaactg taaaagctt 1479
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
atgcctgccc acagcctggt gatgagcagc ccggccctcc cggccttcct gctctgcagc 60
acgctgctgg tcatcaagat gtacgtggtg gccatcatca cgggccaagt gaggctgcgg 120
aagaaggcct ttgccaaccc cgaggatgcc ctgagacacg gaggccccca gtattgcagg 180
agcgaccccg acgtggaacg ctgcctcagg gcccaccgga acgacatgga gaccatctac 240
cccttccttt tcctgggctt cgtctactcc tttctgggtc ctaacccttt tgtcgcctgg 300
atgcacttcc tggtcttcct cgtgggccgt gtggcacaca ccgtggccta cctggggaag 360
ctgcgggcac ccatccgctc cgtgacctac accctggccc agctcccctg cgcctccatg 420
gctctgcaga tcctctggga agcggcccgc cacctgtga 459

Claims (1)

1.一种制备前列腺素E1的方法，其特征在于，采用基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1与底物反应，进而合成出前列腺素E1；所述基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1均通过原核系统表达，所述基因工程环氧合酶-1的基因序列如SEQID NO.1所示，所述基因工程前列腺素E合成酶-1的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1基因的表达载体均为pET-28a，所述基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1基因的转化体均为大肠杆菌BL21(DE3)；基因工程环氧合酶-1和基因工程前列腺素E合成酶-1的提取方法均为：重悬各菌体，离心得到菌体沉淀；用等体积的PB：EDTA-2Na混合缓冲液分别重悬两种菌体，PB：EDTA-2Na的混合比例为4～10:0～6，对重悬菌体进行超声破碎，对破碎的菌体分别离心，去除细胞残，收集上清液，即得；所述底物为氢醌、谷胱甘肽和二高-γ-亚麻酸混合物，酶与底物的反应条件为32～37℃、pH7.8～8下反应15～40min。
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