CN116144689A - 重组猫血清淀粉样蛋白a的表达载体、宿主菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法。所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A。本发明以猫SAA前体蛋白第19至219位氨基酸作为表达位点，通过GST标签增强重组蛋白的可溶性及表达量，通过添加酶切位点去除GST标签以还原SAA蛋白在基体内的折叠结构，并利用组氨酸标签实现分离纯化，可以大量有效获取高活性、高纯度的猫SAA蛋白，为开发特异性抗体提供了保证。

Description

重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法。

背景技术

血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A，SAA)是机体受到感染和损伤时分泌的一种急性期反应蛋白(APP)，主要由肝脏产生。机体正常血清中SAA以恒量存在，但在炎症或感染急性期的48-72h内SAA可增加数百至上千倍，尤其是病毒性疾病，SAA上升非常明显，并且在疾病的恢复期内迅速下降，是一种灵敏的炎症诊断指标和预后标志物，有利于诊断感染性疾病和炎症性疾病，且诊断结果不受外界因素的干扰，相对更加稳定和精确。在猫出现多种炎症性疾病或传染性疾病如支原体、病毒感染的时候，SAA能最快速产生应答，因而是猫最有效的炎症标志物，在临床上检测猫血清中的SAA含量具有很高的诊断价值。

鉴于血清淀粉样蛋白A在临床治疗及诊断中的重要性，SAA蛋白的相关研究越来越受到重视。目前，在市场上人SAA检测试剂盒已经商业化，但国产化的猫SAA检测试剂盒还较为空缺，虽然不同物种中，SAA蛋白存在一定同源性，但在检测的实际应用中仍存在一定差异，需要进行技术改进。大肠杆菌作为优良的基因工程表达宿主菌，具有生长周期短、生产成本低、转化率高并且可以高表达目的蛋白等优点，使的大肠杆菌表达系统广泛应用于体外表达SAA重组蛋白，目前普遍采用在SAA的一端添加组氨酸标签，来实现SAA的表达与纯化，但是SAA为高疏水性蛋白，容易体外聚集，而且表达量低，导致表达获得的蛋白生物活性较低，并且活性不稳定，这些缺点极大地限制了现有SAA表达系统的应用。因此，优化血清淀粉样蛋白A的表达方法，提高其表达量和生物活性是当前急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法，以解决现有技术中血清淀粉样蛋白A表达量和/或生物活性低的技术问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A(SAA)。

进一步地，所述重组猫血清淀粉样蛋白A还包括烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切位点，所述烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点位于所述组氨酸标签和所述成熟猫血清淀粉样蛋白A之间，所述重组猫血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述表达载体的出发载体为pGEX-4T-1。

本发明的第二方面提供了一种宿主菌，所述宿主菌携带如上所述的表达载体。

进一步地，所述宿主菌包括大肠杆菌。

本发明的第三方面提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，包括以下步骤：

S1、将如上所述的表达载体导入大肠杆菌中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌，得发酵液；

S2、将所述发酵液离心后收集菌体，之后使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀，得到含有重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液；

S3、利用凝血酶处理所述洗涤液，亲和层析纯化，收集洗脱液，透析后得到酶切切除谷胱甘肽巯基转移酶标签的所述重组猫血清淀粉样蛋白A。

进一步地，步骤S1中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌包括以下步骤：将活化后的菌液加入到添加氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.5-0.55时，加入0.8mM IPTG，置于16℃培养16h。

进一步地，步骤S2中，使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀包括以下步骤：加入破菌液A进行超声破碎，离心收集细胞沉淀，之后加入破菌液B重悬，再次进行超声破碎，离心收集细胞沉淀；该细胞沉淀用于后续分离重组猫血清淀粉样蛋白A；其中，所述破菌液A包括：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT和0.1M NaCl；所述破菌液B包括2M尿素和PBS。

进一步地，步骤S2中，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀包括以下步骤：用所述洗涤液重悬所述细胞沉淀，超声破碎，得到含有所述重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液和包涵体；其中，所述洗涤液包括：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT、0.1MNaCl和1％ Triton X-100。

进一步地，步骤S3中，利用凝血酶处理所述洗涤液包括以下步骤：将所述凝血酶加入到所述洗涤液中，所述凝血酶与所述洗涤液中蛋白的质量比为1：100-500，30℃酶切16h。

本发明的优点及积极效果为：

本发明以猫SAA前体蛋白第19至219位共111个氨基酸作为表达位点，在其N端依次添加GST标签、凝血酶酶切位点和组氨酸标签，由于猫SAA蛋白疏水性较强，通过GST标签的高度可溶性可增强重组蛋白的可溶性及表达量，通过添加酶切位点利用酶切法去除GST标签，最大可能性地还原SAA蛋白在基体内的折叠结构，保持其有效的生物活性，并利用组氨酸标签实现高活性重组猫SAA蛋白的分离纯化；由此，表达载体中猫SAA蛋白以融合蛋白的形式进行原核表达时，在宿主菌内的表达含量高，并通过亲和纯化大量有效获取高活性、高纯度的猫SAA蛋白，为开发特异性抗体提供了保证，继而为开发猫SAA商业化检测试剂盒奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1构建表达载体时PCR扩增成熟猫SAA基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例1菌落PCR鉴定表达载体转化阳性克隆的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例1诱导表达重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图4为本发明实施例1诱导表达重组蛋白的破细胞上清和包涵体的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图5为本发明实施例1采用TEV酶切重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图6为本发明实施例1采用凝血酶酶切重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图7为本发明实施例1用凝血酶酶切之后纯化所得的重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图8为本发明实施例2犬SAA蛋白与猫SAA蛋白序列比对结果图；

图9为本发明实施例2采用ELISA实验纯化后的猫SAA蛋白与抗体亲和力结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A(SAA)。

成熟猫SAA为缺失了猫SAA前体蛋白的N-端的信号肽(第1-19个氨基酸)，SAA前体蛋白是指由SAA cDNA编码，在细胞内合成的未切除信号肽的SAA全长蛋白，而成熟猫SAA是指在细胞内切除信号肽，分泌到血清中的具有生物功能的SAA蛋白。

在本发明中，根据分析猫SAA蛋白氨基酸性质及二级和三级结构，选择最适合用于表达的氨基酸区域，具体为猫SAA前体蛋白第19(含)至219(含)位共111个氨基酸，即去除信号肽后的成熟猫SAA蛋白，在其N端依次添加GST标签、凝血酶酶切位点和组氨酸标签，形成融合蛋白，即表达质粒中用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列(融合基因)按3’端向5’端为依次连接的编码GST标签的基因序列、编码凝血酶酶切位点的基因序列、编码组氨酸标签的基因序列和编码成熟猫SAA蛋白的基因序列。其中，猫SAA蛋白疏水性较强，而GST标签蛋白高度可溶，并可在大肠杆菌中大量表达，故选择GST标签来增强蛋白的可溶性及表达量；为了避免非SAA蛋白自身氨基酸影响融合蛋白结构，继而影响表达之后的SAA蛋白活性，选用凝血酶(thrombin)酶切法去除标签蛋白，由此保证酶切之后的蛋白能够去掉GST标签，获得高活性的重组猫SAA蛋白，组氨酸标签用于重组猫SAA蛋白的分离纯化。本发明所提供的表达载体，解决了猫SAA蛋白疏水性强、蛋白结构变化继而所产生的活性低的问题，将本实施例的表达载体导入原核宿主菌中，以融合蛋白的形式进行原核表达，可以在宿主菌内提高猫SAA蛋白的表达含量和其中可溶性的表达量，并通过纯化大量有效获取高活性、高纯度的猫SAA蛋白，为开发特异性抗体提供了保证，继而为开发猫SAA商业化检测试剂盒奠定了基础。

可选地，所述重组猫血清淀粉样蛋白A还包括烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切位点，所述烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点位于所述组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A之间，所述重组猫血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。由于融合蛋白较大，蛋白折叠会导致酶切识别位点位于蛋白结构内部，无法被酶的活性中心所识别，从而导致酶切效率低下，故设计凝血酶(thrombin)和TEV酶双酶切位点，来提高酶切的可行性。另外，在GST标签被切除之后，组氨酸标签、TEV酶酶切位点、猫SAA蛋白一同被洗脱下来，经活性验证证明TEV酶切位点的保留不影响SAA活性。

可选地，上述所述的用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

需要注意的是，用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列依据氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。本领域技术应当理解，由于遗传密码的简并性，不同于本发明所示例的基因序列同样可以编码得到本发明的融合蛋白，因此，本发明提供的用于编码如上所述的用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列不作为对本发明保护范围的限定。

可选地，所述组氨酸标签为8×His标签。

可选地，所述表达载体的出发载体为pGEX-4T-1。通过将编码GST标签的基因序列、编码thrombin酶切位点的基因序列、编码组氨酸标签的基因序列、编码TEV酶切位点的基因序列和编码成熟猫SAA蛋白的基因序列形成的融合基因连接到出发载体pGEX-4T-1的多克隆位点内，获得本发明如上所述的表达载体，表达得到的重组蛋白从N端到C端依次为：GST标签、thrombin酶切位点、组氨酸标签、TEV酶切位点和成熟猫SAA。

本发明另一实施例提供了一种宿主菌，所述宿主菌携带如上所述的表达载体。

宿主菌根据出发载体的类型选择，本发明优选采用原核表达载体，宿主菌选用原核细胞，常用的原核宿主的例子包括大肠杆菌等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主菌后，在适合条件下培养该宿主细胞，即可表达出融合蛋白，然后通过收集表达的重组蛋白，酶切切除其GST标签，再通过亲和纯化分离出重组猫SAA。

基于相同的发明构思，本发明又一实施例提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，包括以下步骤：

S1、将如上所述的表达载体导入大肠杆菌中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌，得发酵液；

S2、将所述发酵液离心后收集菌体，之后使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀，得到含有重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液；

S3、利用凝血酶处理所述洗涤液，亲和层析纯化，收集洗脱液，透析后得到酶切切除谷胱甘肽巯基转移酶标签的所述重组猫血清淀粉样蛋白A。

通过本发明的重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，SAA蛋白纯化得率高，而且最大可能地还原SAA蛋白在体内的折叠结构，保持其有效的生物活性，进而获得高浓度、高纯度和高活性的的猫SAA蛋白，有助于扩展其应用。

步骤S1中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌包括以下步骤：将活化后的菌液加入到添加氨苄青霉素(Amp)和氯霉素(Chl)的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.5-0.55时，加入0.8mM IPTG，置于16℃培养16h。

步骤S2中，使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀包括以下步骤：加入破菌液A进行超声破碎，离心收集细胞沉淀，之后加入破菌液B重悬，再次进行超声破碎，离心收集细胞沉淀；该细胞沉淀用于后续分离重组猫血清淀粉样蛋白A。其中，破菌液A包括：50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT和0.1M NaCl；破菌液B包括2M尿素和PBS(pH8.0)。

步骤S2中，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀包括以下步骤：用所述洗涤液重悬所述细胞沉淀，破碎，得到含有重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液和包涵体；其中，所述洗涤液包括：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT、0.1M NaCl和1％ TritonX-100。

步骤S3中，利用凝血酶处理所述洗涤液包括以下步骤：将所述凝血酶加入到所述洗涤液中，所述凝血酶与所述洗涤液中蛋白的质量比为1：100-500，30℃酶切16h。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌的构建及蛋白表达

根据UniProt所得：猫SAA基因位于细胞膜外，其中1-18aa编码信号肽，故构建的区域选择19-129aa，将该区域的序列全基因合成到pUC57载体上，质粒命名为pUC57-SAA(19-129aa)，再以该质粒为模板，PCR扩增合成成熟猫SAA编码基因和组氨酸标签编码基因以及烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切位点的基因序列，将该目的基因插入到pGEX-4T-AB1中，构建表达载体，质粒命名为pGEX-4T-AB1-SAA(19-129aa)或pGEX-4T-AB1-SAA，其中pGEX-4T-AB1以pGEX-4T-1为出发载体，多克隆位点插入有编码谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签和凝血酶酶切位点。将构建得到的表达载体pGEX-4T-AB1-SAA(19-129aa)进行大肠杆菌诱导表达，得到的重组蛋白带有GST—thrombin—8His—TEV标签，其结构从N端到C端为：GST—thrombin—8His—TEV—SAA(19-129aa)。由于重组蛋白较大，蛋白折叠会导致酶切识别位点位于蛋白结构内部，无法被酶的活性中心所识别，从而导致酶切效率低下，故设计凝血酶(thrombin)和TEV酶双酶切位点，来提高酶切的可行性。

本实施例中所涉重组蛋白(融合蛋白)氨基酸序列(见SEQ ID NO：1)：

其中，下划线实直线所示为GST氨基酸序列，下划线虚直线所示为凝血酶(thrombin)氨基酸序列，下划线波浪线所示为8His氨基酸序列，阴性部分所示为TEV氨基酸序列，斜体部门所示为SAA(19-129aa)氨基酸序列。

本实施例中所涉重组蛋白(融合蛋白)碱基序列按3’端向5’端(见SEQ ID NO：2)：

其中，下划线实直线所示为GST碱基序列，下划线虚直线所示为凝血酶(thrombin)碱基序列，下划线波浪线所示为8His碱基序列，阴性部分所示为TEV碱基序列，斜体部分所示为SAA(19-129aa)碱基序列，最后一个三联体密码子为终止密码子。

一、表达载体pGEX-4T-AB1-SAA(19-129aa)构建

使用Primer5进行引物设计，序列如表1所示：

表1表达载体构建所用引物序列

以上述引物、采用试剂盒(购自ABclonal，货号：RK20715)进行PCR扩增，PCR体系(总计50μL)：Gloria Nova HS 2X HF Master Mix 25μL、ddH₂O 22μL、pUC57-SAA(19-129aa)模板1μL、上/下游引物1+1μL。PCR扩增反应程序设置：98℃变性45s，(98℃解链10s、60℃退火30s、72℃延伸，延伸速率2kb/1min)×30cycLe，72℃延伸10min，4℃∞。

PCR反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证(见图1)，可以看到具有333bp的单一条带，说明前述步骤得到了纯的目的基因，之后采用爱博泰克AFTSpin多功能DNA回收试剂盒进行回收(购自ABclonal，货号：RK30100)回收目的条带，得到SAA(19-129aa)目的片段。

将上述纯化的目的片段采用同源重组的方式与酶切后的pGEX-4T-AB1载体进行连接。连接体系(总计10μL)：质SAA(19-129aa)目的片段2μL、酶切后pGEX-4T-AB1载体3μL、2×MultiF Seamless Assembly Mix(购自ABclonal，货号：RM20523)5μL；50℃反应30min。

将连接产物10μL全部转入DH5α感受态细胞，经过冰浴、热激、复苏及过夜培养12～16h后。采用通用引物pGEX5'和pGEX3'进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示，可见看到表达载体成功转入大肠杆菌。取菌落PCR鉴定中的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证，测序正确后的表达载体用于后续的蛋白表达。

二、小量表达

(1)培养基分装：向LB液体培养基中添加氨苄青霉素(Amp)和氯霉素(Chl)(Amp终浓度：50μg/mL；Chl终浓度：34μg/mL)，混匀后分装于3个10mL EP管中，每管3mL，分别设置为阴性对照组、37℃诱导表达组和16℃诱导表达组。

(2)挑取单菌落：挑取三个形态大小均一的单菌落，分别转移至相应装有10mL培养基的EP管中。

(3)菌液诱导：将接种后的培养基放入摇床中37℃、220rpm培养，当OD600达到0.5-0.55左右时进行诱导表达，诱导表达条件为：0.8mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(购自Biosharp，货号：BS119)，37℃、220rpm培养4h；或者用0.8mM IPTG诱导，16℃、220rpm培养16h。

(4)超声破碎：将诱导后的菌液12000rpm、4℃离心5min，弃上清；取1mL破菌液A(包括：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT和0.1M NaCl)悬浮菌体。设置超声破碎仪程序为：2mm变幅杆，功率150W，破菌时间3s，间隔时间3s，总时长3min。将破碎后的菌液12000rpm离心8min，收集上清液，沉淀(即包涵体)溶解于150μL8M尿素-PBS缓冲液中。

(5)SDS-PAGE凝胶电泳：将破碎所得上清液与6×Loading Buffer按体积比5:1混合制样；包涵体与2×Loading Buffer按体积比1:1混合制样。制好的样品与牛血清白蛋白(BSA，购自BioFroxx，货号：4240GR025)、Marker、阴性对照一起进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结果如图3所示。

由图可知，pGEX-4T-AB1-SAA(19-129aa)表达的重组蛋白大小为40.4kDa。37℃小试在包涵体中有明显目的蛋白条带表达，在上清中无明显目的蛋白条带表达；16℃小试在上清和包涵体中均有明显目的蛋白条带表达，相比于现有的表达系统，提高了上清液中的可溶性蛋白的表达量。一般情况下，上清表达的蛋白活性优于包涵体经过变性、复性纯化得到的蛋白活性，故尽量从上清中获得蛋白，使蛋白折叠达到最接近活性状态。基于上述蛋白性质，最终选择16℃进行扩大培养。

三、大量表达与纯化

SAA蛋白疏水性较强，大部分蛋白以包涵体形式存在，而聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：30188928)是一种温和的非离子型表面活性剂，可破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，而不破坏蛋白质-蛋白质的连接，不会使蛋白变性，也就是说，其可使蛋白质溶解和分离，同时保留蛋白质的天然构象、功能及相互作用，故在进行大量表达破碎菌体过程中应用Triton X-100来洗涤蛋白。

取小摇测试表达正确的活化菌液接种至300mL LB液体培养基(含Amp终浓度50μg/mL和Chl终浓度34μg/mL)中，置于37℃、220rpm摇床中培养，当OD₆₀₀的值达到0.5-0.55时，加入0.8mM IPTG，置于16℃、220rpm摇床中培养16h。之后收集菌体进行超声破碎。

超声破碎操作如下：

Ⅰ.将诱导完成的菌液4000rpm离心10min，弃上清，取30mL破菌液A(包括：50mMTris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT和0.1M NaCl)悬浮菌体。

Ⅱ.设置超声破碎仪程序为：变幅杆6，功率350W，破菌时间3s，间隔时间3s，总时长10min，9000rpm离心10min得到上清液1和沉淀。

Ⅲ.取30mL破菌液B(包括2M尿素和PBS(pH8.0))重悬菌体后再次破碎5min(超声破碎仪程序同步骤Ⅱ)，9000rpm离心10min得到上清液2和沉淀。

Ⅳ.用10mL洗涤液(包括：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mMDTT、0.1M NaCl和1％ Triton X-100)重悬菌体后再次破碎3min(超声破碎仪程序同步骤Ⅱ)，得到洗涤液和包涵体。

Ⅴ.经纯水润洗后，用8M尿素-PBS缓冲液充分溶解包涵体，12000rpm离心1min，收集包涵体溶液。

Ⅵ.将得到的上清液1、上清液2和洗涤液均用Loading Buffer进行2倍稀释，包涵体溶液2倍稀释和10倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图4所示。

在上清1和上清2中得到少量pGEX-4T-AB1-SAA(19-129aa)蛋白，在经Triton X-100洗涤后，较多蛋白被溶解到洗涤液中，选择蛋白含量较多的洗涤液进行酶切去除GST标签。

GST标签切除操作如下：

a)TEV酶酶切

设置酶切条件：TEV酶(公司内部自制保存)与蛋白质量比为1：2、1：5和1：10，酶切温度为30℃，酶切时间为16h。将蛋白与TEV酶混匀后进行酶切，酶切完成后用LoadingBuffer进行2倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果图5所示。TEV酶切后重组蛋白中的标签未被成功切除，TEV酶切不成功和SAA蛋白的折叠有关。

b)凝血酶酶切

设置酶切条件：凝血酶(购自Solarbio，货号：T8021)与蛋白质量比为1：100、1：300和1：500，酶切温度为30℃，酶切时间为16h；将蛋白与凝血酶混匀后进行酶切。酶切完成后用Loading Buffer进行2倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图6所示。凝血酶与蛋白质量比为1：500时，30℃酶切16h即可将GST标签完全切除，形成2个条带，之后采用亲和纯化除去GST标签的重组蛋白，此时重组蛋白仅含有组氨酸标签、TEV酶切位点和成熟猫SAA，TEV酶切位点的存在不影响成熟猫SAA蛋白的活性。

重组蛋白亲和纯化分离操作如下：

采用Ni-NTA亲和纯化基质预装柱(购自蓝晓，货号：A4023205)纯化。

Ⅰ.用30mL纯水洗去Ni-NTA亲和纯化基质(预装柱1mL)中的乙醇(商品化填料用20％乙醇保存)，向基质中加入10mL 0.2M硫酸镍溶液，用巴氏吸管温和混匀后静置10min，控制流速为2mL/min，流出液体，之后用30mL纯水洗去残留的硫酸镍，用30mL结合缓冲液(Binding Buffer)平衡基质，控制流速为2mL/min，流出液体；

II.凝血酶酶切后的样品与基质混合，4℃下旋转孵育40min，将孵育后的样品转移至预装柱后流出液体，用30mL洗杂缓冲液(Washing Buffer)洗脱，去除与基质未结合或弱结合的杂蛋白，控制流速为2mL/min，流出液体，收集流穿液；

Ⅲ.用3ml洗脱缓冲液(Elution Buffer)洗脱目的蛋白，流速为0.5mL/min，将洗脱液转移至透析袋中，透析换液至1×PBS中；

Ⅵ.将酶切前样品、酶切后样品及透析后的目的蛋白用Loading Buffer进行2倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结果见图7。

纯化所用缓冲液配方见表2：

表2 Ni-NTA亲和纯化缓冲液配方

由图7可知，表达载体表达之后得到了大量的重组蛋白，从包涵体中分离得到了去除GST标签的纯度较高的猫SAA蛋白，蛋白浓度1mg/mL，纯度达到90％。

实施例2猫SAA蛋白活性验证

目前在市场上并无具有代表性的检测猫SAA的试剂盒，序列比对结果显示犬SAA蛋白与猫SAA氨基酸序列相似度高达87.6％(比对结果如图8所示)，故选用Canine SAA ELISAKit(购自abcam，货号：ab205072)来验证酶切后纯化所得SAA蛋白的活性。

将各组样品按表3进行稀释，根据试剂盒内说明书进行实验操作。

表3标准品/样品配制表

结果如图9所示，酶切后所得猫SAA蛋白的OD值与SAA蛋白标准品相近，经ELISA实验检测其与抗体结合力较强，生物活性较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A。

2.根据权利要求1所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，所述重组猫血清淀粉样蛋白A还包括烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点，所述烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点位于所述组氨酸标签和所述成熟猫血清淀粉样蛋白A之间，所述重组猫血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pGEX-4T-1。

5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌携带如权利要求1-4任一项所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包括大肠杆菌。

7.一种重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将如权利要求1-4任一项所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体导入大肠杆菌中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌，得发酵液；

S2、将所述发酵液离心后收集菌体，之后使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀，得到含有重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液；

S3、利用凝血酶处理所述洗涤液，亲和层析纯化，收集洗脱液，透析后得到酶切切除谷胱甘肽巯基转移酶标签的所述重组猫血清淀粉样蛋白A。

8.根据权利要求7所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，其特征在于，步骤S2中，使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀包括以下步骤：

加入破菌液A进行超声破碎，离心收集细胞沉淀，之后加入破菌液B重悬，再次进行超声破碎，离心收集细胞沉淀；其中，所述破菌液A包括：50mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT和0.1M NaCl，所述破菌液B包括2M尿素和PBS。

9.根据权利要求7所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，其特征在于，步骤S2中，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀包括以下步骤：

用所述洗涤液重悬所述细胞沉淀，超声破碎，得到含有所述重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液和包涵体；其中，所述洗涤液包括：50mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mMDTT、0.1M NaCl和1％Triton X-100。

10.根据权利要求7所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，其特征在于，步骤S3中，利用凝血酶处理所述洗涤液包括以下步骤：

将所述凝血酶加入到所述洗涤液中，所述凝血酶与所述洗涤液中蛋白的质量比为1：100-500，30℃酶切16h。

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