CN108424441B - 一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核糖核酸酶抑制剂(RI)包涵体的复性方法。本发明的方法在复性过程中应用了RNase A，使RI的复性得率大大提高，而RNase A很容易在后续的纯化过程中，经由一定浓度无机盐在偏酸性的条件下除去，而RI则可以藉由适当的纯化标签而结合于纯化柱上，从而很方便地进行纯化，得到高纯度的RI。

Description

一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法

技术领域

本发明属于化学及生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法。

背景技术

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor，RI)是哺乳动物细胞浆中的一种酸性蛋白质，分子量50kD。它能够以1：1的比例结合并抑制胰腺核糖核酸酶超家族中的RNase A和血管形成因子(Angiogenin，Ang)。RI与Ang的结合引起人们的关注是因为Ang具有促进新生血管内皮生长的活性，而新生血管形成是实体肿瘤组织生长所必需的。将RI注射到小鼠的移植肿瘤组织内，导致实体肿瘤组织大面积坏死及新生血管明显减少。根据RI一级结构的一个重要特点，32个半胱氨酸残基全部为还原状态，认为RI具有抗氧化的作用。这一作用在细胞水平得到证实：能够过表达RI的C6细胞抗过氧化氢损伤的能力明显增强。因此，通过基因工程的方法生产具有生物活性的RI无疑具有重要作用。

RI是一种多功能的体内重要的调节分子，是核糖核酸酶A(RNase A)的抑制剂，它与RNase A紧密结合，形成马蹄形的立体结构，从而导致核糖核酸酶的活性受到抑制。它参与基因的表达与调控，是具有重要功能的一种蛋白质。在RI的结构中，有11对二硫键和8个游离的巯基。巯基是RI的活性必需基团，巯基的氧化会导致RI的失活。作为RNase A的抑制剂，RI在体外实验中可以保护mRNA及rRNA免受RNase的降解，导致蛋白质合成旺盛。在生长旺盛的组织如再生肝和妊娠鼠肝中皆可检测到RI活力增强。在衰老过程中，人体RI活力下降，RNase A活力上升，RNA降解加快，蛋白合成速度下降。即当内外环境改变时，易使含有30个-SH的RI的活性下降甚至失活，导致体内主要以RNase A-RI，复合物形式而存在的RNaseA呈游离状态，加速RNA(特别是mRNA，及rRNA)降解，进而影响蛋白质的合成速率，引起组织萎缩、功能下降。RI及RNase A的活性与机体的状态及年龄有关，故可作为研究衰老的指标之一。总之，RI通过对RNA和蛋白质的调节作用而对组织细胞的功能状态起调节作用。

核糖核酸酶抑制剂(RI)的制备方法主要是直接从人体胎盘提取、大肠杆菌重组可溶性表达、包涵体复性这三种方法获得。

直接从人体胎盘提取核糖核酸酶抑制剂(RI)的方法是由美国Promega公司最早发现并建立的，但是采用该方法所使用的原料人体胎盘近来受到国家的管控，而且人体胎盘也会存在母体病毒污染的风险，提取收率偏低，再加上存放的时间、温度都会对核糖核酸酶抑制剂(RI)产生不确定的影响，无法实现大规模的生产。

因此，当前多采用基因工程的方法，使用大肠杆菌系统进行制备。大肠杆菌表达系统具有技术成熟、目的蛋白表达量高、操作简单等特点。通过克隆人体胎盘的核糖核酸酶抑制剂的基因序列，构建表达载体，在大肠杆菌中进行表达，成为一种全新获得核糖核酸酶抑制剂(RI)的方式。但是核糖核酸酶抑制剂(RI)序列中含有11对二硫键和8个游离的巯基，在进行大肠杆菌诱导表达过程中蛋白结构易于错误折叠，表达产物主要以包涵体的形式存在。

中国专利申请CN102234649A报道可以进行RI的可溶性表达，但是需要在RI序列5’-端加入TrxA硫氧还蛋白融合标签，纯化过程中采用TEV酶切的方式再将标签去除，该方法存在着TrxA标签切除不彻底、TEV酶残留污染等问题。

中国专利申请CN1584031A报道人来源的核糖核酸酶抑制剂(RI)可以经原核系统(大肠杆菌)、真核系统(酵母)进行表达，然后菌体破碎、亲和层析纯化，但并未公开提及其表达的可溶性程度。

美国专利申请US005552302A报道人来源的核糖核酸酶抑制剂(RI)经原核表达后，可溶性(而且有活性)部分只占总表达量的0.1％。这也说明实际上RI在进行原核系统进行表达后，主要还是以包涵体形式存在。

美国专利申请US28215194A报道人来源的核糖核酸酶抑制剂(RI)经原核表达后，主要形成包涵体，然后对包涵体进行变性、溶解、柱纯化等得到高纯度的RI。但是采用该种复性方法，复性得率不高(20g菌体只能得到300万单位的RI)。

由此可知，现有技术中，核糖核酸酶抑制剂(RI)主要还是通过包涵体复性的方法来进行制备。李春宇等比较了稀释复性、凝胶柱复性、透析复性等不同的复性方法，结果显示，稀释复性得率为12.3％、凝胶柱复性得率为10.7％、透析复性得率为1％。

由此结果可以推测，稀释复性效果最好，但是复性得率仍然较低，大部分的包涵体未能被有效利用。因此，复性得率低是当前核糖核酸酶抑制剂(RI)大规模生产工艺中面临的瓶颈问题。

综合以上因素，本领域迫切需要进一步开发高效低成本生产核糖核酸酶抑制剂(RI)的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核糖核酸酶抑制剂(RI)包涵体的复性方法。

在本发明的第一方面，提供一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法，所述方法包括：

(1)对核糖核酸酶抑制剂包涵体进行变性、溶解；

(2)对(1)的变性产物进行复性；其中，在复性液中添加核酸酶RNase A；和

(3)对(2)的复性产物进行柱纯化，获得可溶性核糖核酸酶抑制剂。

在一个优选例中，步骤(1)之前，还包括以下步骤：

重组表达核糖核酸酶抑制剂，获得含有包涵体的表达宿主；

对表达宿主进行破碎，分离出包涵体。

在另一优选例中，表达宿主破碎、裂解后，进行离心获取沉淀，洗涤；

较佳地，利用裂解缓冲液裂解，所述的裂解缓冲液包含：Tris-HCl、无机盐、甘油；

较佳地，利用洗涤缓冲液洗涤，所述洗涤缓冲液包含：Tris-HCl、无机盐、表面活性剂。

在另一优选例中，所述的无机盐包括解离为阳离子或阴离子的无机盐；较佳地，所述的阳离子选自：钾离子或钠离子；较佳地，所述的阴离子是EDTA离子或氯离子。

在另一优选例中，所述的表面活性剂包括离子型、非离子型表面活性剂两种；较佳地，所述的离子型表面活性剂选自：脱氧胆酸钠；较佳地，所述的非离子型表面活性剂是曲拉通(Triton X-100)。

在另一优选例中，所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5；所述的EDTA的终浓度是1±0.5mM；或所述的表面活性剂的终浓度是1±0.5mM。

在另一优选例中，步骤(1)中，利用变性液对包涵体进行变性、溶解，其包含：选自尿素、十二烷基肌氨酸钠或SDS的变性剂。

在另一优选例中，所述的变性剂是尿素，其终浓度是6±2M；

所述的变性剂是十二烷基肌氨酸钠，其终浓度是1±0.5％(w/v)；

所述的变性剂是SDS，其终浓度是2±1％(w/v)；

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的复性液包含：Tris-HCl、无机盐、还原剂等。

在另一优选例中，所述的核酸酶RNase A在复性液中的终浓度为15±12mM；较佳地为15±10mM；

所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5；

所述的还原剂为DTT，其终浓度是1±1mM；较佳地，其终浓度为1±0.5mM。

在另一优选例中，步骤(2)中，对(1)的变性产物进行复性时，将(1)的变性产物与复性液按照1:(10±5)的体积比例混合；较佳地，复性时间是20±10hr，复性温度是4±1℃。

在另一优选例中，步骤(3)中，将(2)的复性产物上样至纯化柱，利用洗涤缓冲液洗去与核糖核酸酶抑制剂结合的核酸酶RNase A；然后，利用梯度洗脱缓冲液进行梯度洗脱，得到纯化的可溶性核糖核酸酶抑制剂。

在另一优选例中，所述的洗涤缓冲液包含(但不限于)：NaAC/HAC、无机盐、还原剂；较佳地，所述的NaAC/HAC的终浓度为35±15mM，PH为5.0±0.5；较佳地，所述的无机盐的终浓度是300±15mM；较佳地，所述的还原剂的终浓度是1±0.5mM；

所述的梯度洗脱液包含Tris-HCl、无机盐、甘油、还原剂等，较佳地，所述的Tris-HCl终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5；较佳地，所述的无机盐的终浓度是50±15mM；较佳地，所述的还原剂的终浓度是1±0.5mM；

所述的梯度洗脱液中包含咪唑，其浓度范围是10mM～550mM。

在另一优选例中，所述的核糖核酸酶抑制剂连接有标签序列，所述的纯化柱是能够识别该标签序列的柱；较佳地，所述的标签是His-tag，所述的纯化柱是Ni柱。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为使用本发明的方法纯化后的RI包涵体的SDS-PAGE检测。

图2为复性后的核糖核酸酶抑制剂RI用Ni柱纯化的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

本发明经过深入的研究，揭示了一种新的核糖核酸酶抑制剂(RI)包涵体的复性方法，包括获得包涵体，对包涵体变性、溶解，用复性缓冲液进行稀释复性，复性液进行柱纯化，得到核糖核酸酶抑制剂。本发明人在复性过程中应用了RNase A，使RI的复性得率大大提高，而RNase A很容易在后续的纯化过程中，经由一定浓度无机盐(如300mM左右)在偏酸性(如PH5.0附近)的条件下洗掉，而RI则可以藉由适当的纯化标签而结合于纯化柱上，从而很方便地进行纯化，得到高纯度的RI。本发明的方法操作简便、经济、复性收率高，为核糖核酸酶抑制剂的大规模工业化生产提供了基础。

本发明涉及一种核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法，所述方法包括以下步骤：(1)对核糖核酸酶抑制剂包涵体进行变性、溶解；(2)对(1)的变性产物进行复性；其中，在复性液中添加核酸酶RNase A；(3)对(2)的复性产物进行柱纯化，获得可溶性核糖核酸酶抑制剂。

一般而言，步骤(1)之前，还包括以下步骤：重组表达核糖核酸酶抑制剂，获得含有包涵体的表达宿主；对表达宿主进行破碎、洗涤，分离出包涵体。

适用于本发明的重组表达的宿主是原核细胞，或称为原核宿主。常用的原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌等。在进行重组表达时，需要将RI的编码基因插入到适合的重组载体中，所述的表达载体可包含一个或多个编码RI的基因序列，还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。

作为本发明的优选方式，将表达宿主用裂解缓冲液高速分散，离心沉淀用洗涤缓冲液洗涤，再用裂解缓冲液高速分散，去除包涵体表面残留的去污剂，得到纯化后的包涵体。

作为本发明的优选方式，表达宿主破碎、裂解后，进行离心获取沉淀(以包涵体为主要成分)，洗涤，去除包涵体表面附着的膜蛋白等，获得较纯的核糖核酸酶抑制剂的包涵体。

利用裂解缓冲液裂解时，所述的裂解缓冲液包含：Tris-HCl、无机盐、甘油。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、钠离子、氯离子或钾离子；更佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；更佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为50±10mM，甘油的终浓度为10±5％；所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5。

利用洗涤缓冲液洗涤时，所述洗涤缓冲液包含：Tris-HCl、无机盐、表面活性剂。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、钠离子、氯离子或钾离子；较佳地，所述的去污剂选自：曲拉通、SDS、脱氧胆酸钠等。更佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；更佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为50±10mM，甘油的终浓度为10±5％。更佳地，所述的去污剂由曲拉通、脱氧胆酸钠产生；更佳地，所述的去污剂曲拉通的终浓度为2±0.5％；脱氧胆酸钠的终浓度为1±0.5％；所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5。

作为本发明的优选方式，对核糖核酸酶抑制剂包涵体进行变性、溶解的方法包括以下步骤：将纯化后的包涵体，用重悬缓冲液重悬；将包涵体重悬液快速加入包涵体变性液中，搅拌。

所述的重悬缓冲液包括Tris-HCl、无机盐、还原剂等。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、氯离子、钠离子；较佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；较佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为50±10mM；较佳地，所述的还原剂是DTT；更佳地，所述的还原剂DTT的终浓度为1±0.5mM；所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5。

所述的包涵体变性液包括Tris-HCl、无机盐、还原剂、变性剂等。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、氯离子、钠离子；较佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；较佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为50±10mM；较佳地，所述的还原剂是DTT，变性剂是尿素、SDS或十二烷基肌氨酸钠；较佳地，所述的变性剂尿素的终浓度是6±2M，十二烷基肌氨酸钠的终浓度是1±0.5％(w/v)，SDS的终浓度是2±1％(w/v)；更佳地，所述的还原剂DTT的终浓度为1±0.5mM，变性剂尿素的终浓度是6±2M；所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5。

作为本发明的优选方式，对变性产物进行复性包括以下步骤：1)将包涵体变性液，加入复性缓冲液中，快速搅拌；2)将步骤1)得到的复性液，置于约4℃冰柜，缓慢搅拌复性。优选地，所述的快速搅拌包括用内置搅拌器搅起漩涡，使溶液快速混合；较佳地搅拌时间是20±10min；较佳地为20±5min。

所述的复性缓冲液包括Tris-HCl、无机盐、还原剂、甘油、核酸酶RNase A等。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、氯离子、钠离子；较佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；较佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为50±10mM；较佳地，所述的还原剂是DTT；更佳地，所述的还原剂DTT的终浓度为1±0.5mM，所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5，所述的甘油的终浓度为5±1％；

所述的核酸酶RNase A的终浓度是15±12mM；较佳地，所述的核酸酶RNase A在复性液中的终浓度为15±10mM；较佳地为15±8mM，如范围在5～25；7～23；10～20；12～18mM等。

作为本发明的优选方式，所述的将包涵体变性液加入复性缓冲液中，是包涵体变性液按照1:(10±5)的体积比例与复性液混合；较佳地，按照1:(10±4)的体积比例进行混合；更佳地，较佳地，按照1:(10±2)的体积比例进行混合。

作为本发明的优选方式，复性的时间是20±10hr；较佳地，复性时间是20±5hr。所述的复性温度是4±1℃。

作为本发明的优选方式，所述的核糖核酸酶抑制剂RI连接有标签序列，所述的纯化柱是能够识别该标签序列的柱。为了进行蛋白纯化，可以设计合适的标签，较佳地，所述的标签是His-tag(包含6～10个His；较佳地为6×His)，所述的纯化柱是Ni柱。其它多种合适的标签也可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，c-Myc，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1(见表1)。

表1

表位	肽	SEQ ID NO:	相应抗体
				6-His	HHHHHH	1	BAbCO<sup>*</sup>
FLAG	DYKDDDK	2	4E11
				HA	YPYDVPDYA	3	12Ca5
c-Myc	EQKLISEEDL	4	9E10
				AU1	DTYRYI	5	BAbCO
EE	EYMPME	6	anti-EE
				4A6	SFPQFKPQEI	7	4A6
ε	KGFSYFGEDLMP	8	anti-PKC
				B	QYPALT	9	D11,F10
gE	QRQYGDVFKGD	10	3B3
				Ty1	EVHTNQDPLD	11	BB2,TYG5

作为本发明的优选方式，所述的包涵体复性液的柱纯化方法包括以下步骤：1)将复性液进行稀释，上样至Ni离子交换柱；2)上样结束，先利用洗涤缓冲液进行洗涤，去除与和糖核酸酶抑制剂结合的RNase A；3)洗涤结束，用梯度洗脱缓冲液将RI进行梯度洗脱，得到高纯度的活性RI。

所述的洗涤缓冲液包括NaAC/HAC、无机盐、还原剂、甘油等。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、氯离子、钠离子；较佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；较佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为300±15mM；较佳地，所述的还原剂是DTT；更佳地，所述的还原剂DTT的终浓度为1±0.5mM，所述的NaAC/HAC的终浓度为35±15mM，PH为5.0±0.5，所述的甘油的终浓度为5±1％；

所述的梯度洗脱液包括Tris-HCl、无机盐、还原剂、甘油、咪唑等。较佳地，所述的无机盐选自：EDTA、氯离子、钠离子；较佳地，所述的无机盐由EDTA、氯化钠产生；较佳地，EDTA的终浓度为1±0.5mM，氯化钠的终浓度为50±15mM；较佳地，所述的还原剂是DTT；更佳地，所述的还原剂DTT的终浓度为1±0.5mM，所述的Tris-HCl的终浓度为35±15mM，PH为7.5±0.5，所述的甘油的终浓度为5±1％；所述的咪唑的浓度范围是10mM～550mM。

与现有技术相比，本发明的核糖核酸酶抑制剂包涵体的复性方法具有下列优点：

(1)本发明提供的方法，在复性过程中加入核糖核酸酶抑制剂RI的特异性配体RNase A，有助于RI在复性过程中的正确折叠，可大大提高RI的复性得率。

(2)本发明提供的方法中复性液中的RNase A很容易经无机盐在偏酸性(PH5.0附近)的条件下洗掉，而RI可设计为结合于亲和柱上，从而很方便地进行柱纯化，得到高纯度的RI。

(3)本发明提供的方法的复性时间远少于传统的稀释复性、透析复性等，节省了时间。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、RI包涵体的纯化

(1)核糖核酸酶抑制剂RI载体的构建

从分离自人体的废弃的胎盘组织中抽提总RNA，然后进行RT-PCR扩增RI基因序列(在N端加入6×His-tag)，经酶切回收、连接pET28b载体，转化DH5a感受态细胞，挑单克隆培养后抽提质粒(pET28b-6*His-RI)转化表达宿主菌。

(2)菌体制备

将构建的BL21DE3表达菌株，接种到含有100ml LB培养基(Kana⁺)，37℃，230rpm，16hr。将种子液按照1％的接种量转接2×YT培养基，进行发酵培养，当菌液OD600达到0.9时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mM，诱导4.5小时，诱导结束后离心收集菌体，-20℃暂存。

(3)包涵体的纯化

取10g菌体，按1g/10ml的比例与裂解缓冲液混合，高速分散，冰浴超声(输出功率400～500W，间隔5S，2次)，离心(7500rpm，30min)沉淀，用洗涤缓冲液重悬并高速分散混匀，再次冰浴超声(输出功率400～500W，间隔5S，2次)，离心(7500rpm，30min)沉淀。

重复洗涤一次，然后再用裂解缓冲液重悬混匀，离心(7500rpm，30min)。

重复洗涤一次，得到纯化后的包涵体(3g)。

纯化后的RI包涵体的SDS-PAGE检测如图1。可见，经纯化后，能洗掉大部分结合在表面的膜蛋白等杂质。

裂解缓冲液配方：EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，Tris-HCl35mM，PH为7.5。

洗涤缓冲液配方：曲拉通2％，脱氧胆酸钠1％，EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，Tris-HCl 35mM，PH为7.5。

实施例2、RI包涵体的复性

(1)包涵体的变性、溶解

取1g纯化后的包涵体，加入10ml重悬缓冲液中，快速搅拌1hr，然后将上述重悬液加入4℃保存的10ml包涵体变性液中，快速搅拌30min，此时包涵体全部溶解，为透明状。

重悬缓冲液配方：DTT 1mM，EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，Tris-HCl15mM，PH为7.5。

包涵体变性液配方：DTT 1mM，变性剂尿素6M，Tris-HCl 35mM，EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，PH为7.5。

(2)包涵体的复性

将上述变性液快速倒入4℃保存的100ml复性液中，快速搅拌混匀，然后低速搅拌20hr，得到经处理的复性液。

按照cCMP的测活方法，1g包涵体经复性后，得到了426万单位的RI。

复性液配方：DTT 1mM，EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，Tris-HCl 35mM，PH为7.5，甘油5％(v/v)，RNase A 15mM。上述复性液配方中添加：核酸酶RNase A 15mM。

实施例3、RI复性液的柱纯化(4℃层析)

(1)上样

将前述获得的经处理的复性液稀释至蛋白浓度为0.5～1mg/ml，并调节PH＝8.0，上样至Ni-sepharose FF(10ml，GE公司)，流速＝2ml/min。

(2)洗杂去除RNase A

上样结束，先用柱平衡缓冲液洗2倍柱体积，换用洗涤缓冲液洗柱，流速＝2ml/min，同时进行SDS-PAGE电泳，检测洗涤液的杂带情况，当洗涤液中无RNase A条带时，结束洗涤。

柱平衡缓冲液配方：DTT 1mM，EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，Tris-HCl35mM，PH为7.5。

洗涤缓冲液配方：DTT 1mM，EDTA 1mM，氯化钠300mM，NaAC/HAC 35mM，PH为5.0，甘油5％(v/v)。

(3)RI的梯度洗脱

用梯度洗脱缓冲液，对Ni-sepharose FF进行0～100％的线性梯度洗脱，跑SDS-PAGE得到高纯度的RI，收集合并RI条带部分，对应RI存储缓冲液进行透析，3次。

按照cCMP的测活方法，1g包涵体得到了368万单位的RI。

复性后的核糖核酸酶抑制剂RI用Ni柱纯化的SDS-PAGE图谱如图2。其中，wash处为用洗涤缓冲液洗涤的RNase A条带，说明RNase A在洗涤过程中被洗掉；E1～E8为Ni柱梯度洗脱液的分步收集，其中无RNase A杂带，只有RI条带。

梯度洗脱缓冲液配方：DTT 1mM，EDTA 1mM，氯化钠50mM，甘油10％(v/v)，Tris-HCl35mM，PH为7.5，咪唑500mM。

实施例4、RI包涵体的放大复性及纯化(纯化阶段需4℃层析)

(1)包涵体的变性、溶解

取20g纯化后的包涵体，加入200ml重悬缓冲液(配方同前)中，快速搅拌1.5hr，然后将上述重悬液加入4℃保存的300ml包涵体变性液(配方同前)中，快速搅拌30min，此时包涵体全部溶解，为透明状。

(2)包涵体的复性

将上述变性液快速倒入4℃保存的3500ml复性液(基础配方同前，其中添加：核酸酶RNase A 20mM)中，快速搅拌混匀，然后低速搅拌20hr，得到复性液。

按照cCMP的测活方法，20g包涵体经复性后，复性液中具有得到了9850万单位的RI。

(3)RI复性液柱纯化

将复性液稀释至蛋白浓度在0.5-1mg/ml，并调节PH＝8.0，上样至Ni-sepharoseFF(300ml，GE公司)，流速＝10ml/min。

上样结束，先用柱平衡缓冲液(配方同前)洗2.5倍柱体积，换用洗涤缓冲液(配方同前)洗柱，流速＝5ml/min，同时跑SDS-PAGE电泳检测洗涤液的杂带情况，当洗涤液中无RNase A条带时，结束洗涤。

用梯度洗脱缓冲液(配方同前)，对Ni-sepharose FF进行0～100％的线性梯度洗脱，跑SDS-PAGE得到高纯度的RI，收集合并RI条带部分，对应RI存储缓冲液进行透析，4次。

按照cCMP的测活方法，20g包涵体得到了8372万单位的RI。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围。

序列表

<110> 上海兆维科技发展有限公司

<120> 179459

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 2

His His His His His His

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 2

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 3

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 4

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 5

Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 6

Glu Tyr Met Pro Met Glu

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 7

Ser Phe Pro Gln Phe Lys Pro Gln Glu Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 8

Lys Gly Phe Ser Tyr Phe Gly Glu Asp Leu Met Pro

1 5 10

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 9

Gln Tyr Pro Ala Leu Thr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 10

Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly Asp

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 多肽(polypeptide)

<400> 11

Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro Leu Asp

1 5 10

Claims (20)

1.一种核糖核酸酶抑制因子包涵体的复性方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 对核糖核酸酶抑制因子包涵体进行变性、溶解；

(2) 对(1)的变性产物进行复性；其中，在复性液中添加核酸酶RNase A，所述的核酸酶RNase A在复性液中的终浓度为10-20 mM；所述的复性液包含：Tris-HCl、无机盐、还原剂；所述Tris-HCl的终浓度为35±15mM，pH为7.5±0.5；所述还原剂为DTT，其终浓度是1±0.5mM；其中，将(1)的变性产物与复性液按照1:(10±5)的体积比例混合；复性时间20±10hr，复性温度4±1℃；和

(3) 对(2)的复性产物进行柱纯化，获得可溶性核糖核酸酶抑制因子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)之前，还包括以下步骤：

重组表达核糖核酸酶抑制因子，获得含有包涵体的表达宿主；

对表达宿主进行破碎，分离出包涵体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，表达宿主破碎、裂解后，进行离心获取沉淀，洗涤。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用裂解缓冲液裂解，所述的裂解缓冲液包含：Tris-HCl、无机盐、甘油。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用洗涤缓冲液洗涤，所述洗涤缓冲液包含：Tris-HCl、无机盐、表面活性剂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用变性液对包涵体进行变性、溶解，其选自尿素、十二烷基肌氨酸钠或SDS的变性剂。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的变性剂是尿素，其终浓度是6±2 M。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的变性剂是十二烷基肌氨酸钠，其终浓度是1±0.5%(w/v)。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的变性剂是SDS，其终浓度是2±1%(w/v)。

10.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述的核酸酶RNase A在复性液中的终浓度为12～18 mM。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将(2)的复性产物上样至纯化柱，利用洗涤缓冲液洗去与核糖核酸酶抑制因子结合的核酸酶RNase A；然后，利用梯度洗脱缓冲液进行梯度洗脱，得到纯化的可溶性核糖核酸酶抑制因子。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的洗涤缓冲液包含：NaAc/HAc、无机盐、还原剂。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的NaAc/HAc的终浓度为35±15mM，pH为5.0±0.5。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的无机盐的终浓度是300±15mM。

15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的还原剂的终浓度是1±0.5mM。

16.权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱缓冲液包含Tris-HCl、无机盐、甘油、还原剂。

17.权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl终浓度为35±15mM，pH为7.5±0.5。

18.权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的无机盐的终浓度是50±15mM。

19.权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的还原剂的终浓度是1±0.5mM。

20.权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱缓冲液中包含咪唑，其浓度范围是10 mM～550mM。

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