CN106749633A - 一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法，属于天然产物提取技术领域。本发明提供的方法包括以下步骤：1)将螺旋藻进行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；2)将所述破壁螺旋藻与氯化铵溶液混合，将藻蓝蛋白萃取到氯化铵溶液中，超滤得到藻蓝蛋白上清液；3)采用磷酸铵溶液对所述藻蓝蛋白上清液进行盐析，将得到的盐析产物脱盐后干燥，得到藻蓝蛋白。本发明提供的方法无需低温处理，工艺简单，通过氯化氨溶液快速萃取分离提取藻蓝蛋白工艺，提取收率高，藻蓝蛋白纯度(A620/A280)可达3.8以上。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域，尤其涉及一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法。
背景技术
藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素，能高效捕获光能。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点，藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。藻蓝蛋白带有荧光，可用作荧光标记物。藻蓝蛋白在抗肿瘤和提高机体免疫力方面有明显疗效。
现有涉及藻蓝蛋白提取纯化方法中，藻蓝蛋白分离纯化过程主要包括使用低温(-20℃～-10℃)反复冻融方法或冰粉(-50℃～-10℃)破除螺旋藻的细胞壁，加入磷酸盐缓冲液分离提取藻蓝蛋白粗提物，使用冷冻高速离心方法进行固液分离，获得上清液加入硫酸铵溶液盐析沉淀，脱盐过大孔树脂柱或色谱柱进一步纯化，洗脱液脱盐处理后经过冻干或者喷雾干燥获得高纯度的藻蓝蛋白粉。上述工艺主要的问题在于工艺路线长，大部分过程需要在低温处理能耗高，提取周期长，造成生产效率太低，成本过高，生产应用价值不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法。本发明提供的方法无需低温处理，工艺简单，通过氯化氨溶液快速分离提取藻蓝蛋白工艺，提取收率高，藻蓝蛋白纯度(A620/A280)可达3.8以上。
本发明提供了一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻进行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；
2)将所述破壁螺旋藻与氯化铵溶液混合，将藻蓝蛋白萃取到氯化铵溶液中，超滤得到藻蓝蛋白上清液；
3)采用磷酸铵溶液对所述藻蓝蛋白上清液进行盐析，将得到的盐析产物脱盐后干燥，得到藻蓝蛋白。
优选的是，所述螺旋藻在光反应器培养得到，所述酶解破壁前将培养得到的螺旋藻进行陶瓷膜过滤；
所述陶瓷膜过滤的温度为20～30℃，切向流速为3～5m/s，过膜压力为0.6～0.9bar。
优选的是，所述步骤1)酶解破壁用酶为复合酶，所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶和溶菌酶；所述酶解时间为3～5h，所述酶解温度为30～40℃。
优选的是，所述步骤2)破壁螺旋藻与氯化铵溶液的体积比为1∶(2～3)；所述氯化铵溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，pH值为7～8。
优选的是，所述步骤2)萃取包括搅拌过程，所述搅拌的时间为4～6h，转速为50～80rpm。
优选的是，所述步骤2)的超滤采用直径为0.4～0.1μm的超滤膜进行。
优选的是，所述步骤3)盐析过程中藻蓝蛋白上清液与磷酸铵溶液的体积比为1∶(2～3)；所述磷酸氨溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，pH值为4.0～4.5；所述盐析的温度为15～20℃。
优选的是，所述步骤3)的盐析反应进行搅拌，所述搅拌的反应时间为1～2h，转速为20～30rpm。
优选的是，所述步骤3)脱盐方法包括：将盐析后的藻蓝蛋白沉淀加入氯化铵溶液中溶解沉淀，过分子量为1×105～5×105的超滤膜浓缩除去磷酸盐和铵盐离子。
优选的是，所述步骤3)中的干燥为喷雾干燥。
本发明提供了一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法。复合酶进行酶解破壁处理在不破坏藻蓝蛋白稳定性情况下可常温快速实现螺旋藻的破壁，破壁率可达98％以上；氯化铵溶液经过一步萃取，结合超滤过程即可获得高纯度藻蓝蛋白，纯度可达2.0以上；采用磷酸铵溶液对所述藻蓝蛋白上清液进行盐析，将得到的盐析产物脱盐后干燥得到的藻蓝蛋白纯度达3.8以上，回收率可达95％以上。本发明提供的方法无需低温处理，工艺简单，通过氯化氨溶液快速分离提取藻蓝蛋白工艺，提取收率高。
具体实施方式
本发明提供了一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻进行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；
2)将所述破壁螺旋藻与氯化铵溶液混合，将藻蓝蛋白萃取到氯化铵溶液中，超滤得到藻蓝蛋白上清液；
3)采用磷酸铵溶液对所述藻蓝蛋白上清液进行盐析，将得到的盐析产物脱盐后干燥，得到藻蓝蛋白。
本发明将螺旋藻进行酶解破壁，得到破壁螺旋藻。在本发明中，所述螺旋藻优选为钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)。在本发明中，所述螺旋藻由螺旋藻藻种在光反应器培养得到，所述酶解前将培养得到的螺旋藻进行陶瓷膜过滤；本发明对所述螺旋藻藻种的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的螺旋藻藻种市售产品即可。本发明对所述螺旋藻培养的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的由螺旋藻藻种培养得到螺旋藻的常规方法即可。在本发明中，所述陶瓷膜过滤的温度为25～35℃，所述温度包括过滤过程中液体和膜的温度，所述过滤的切向流速为3～5m/s，过膜压力为0.6～0.9bar。在本发明中，所述陶瓷膜过滤的条件更优选温度为28℃，切向流速为4m/s，过膜压力为0.8bar。本发明所述浓缩优选将螺旋藻浓缩至质量浓度为50～60％，更优选为55％。在本发明中，所述陶瓷膜的孔径优选为0.1～2μm，更优选为1μm。
本发明酶解的目的为破除螺旋藻的细胞壁，在本发明中，酶解破壁用酶为复合酶，所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶和溶菌酶。在本发明中，所述纤维素酶酶活优选为1200～1800U/g，更优选为1500U/g；果胶酶酶活优选为800～1200U/g，更优选为1000U/g；溶菌酶酶活优选为1200～1800U/g，更优选为1500U/g；在本发明中，所述纤维素酶、果胶酶和溶菌酶的质量比优选为1∶2∶1，所述复合酶总添加量优选为0.01～0.05％，更优选为0.03％；所述酶解时间为3～5h，更优选为4h，所述破壁温度30～40℃，更优选为35℃；所述酶解过程进行搅拌，所述搅拌的转速为50～80rpm，更优选为60～70rpm。在本发明中，所述酶解过程优选反应至螺旋藻破壁率达到95％以上，更优选为98％以上。
得到破壁螺旋藻后，本发明将所述破壁螺旋藻与氯化铵溶液混合，将藻蓝蛋白萃取到氯化铵溶液中，超滤得到藻蓝蛋白上清液。在本发明中，所述破壁螺旋藻与氯化铵溶液的体积比为1∶(2～3)，更优选为1∶2.5；所述氯化铵溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，优选为0.08mol/L，pH值为7～8，优选为7.5。
在本发明中，所述萃取包括搅拌过程，所述搅拌的时间为4～6h，优选为5h，转速为50～80rpm，优选为60～70rpm。
在本发明中，所述步骤2)的超滤采用直径为0.4～0.1μm，更优选为0.6μm的超滤膜进行。
得到藻蓝蛋白上清液后，本发明采用磷酸铵溶液对所述藻蓝蛋白上清液盐析，将得到的盐析产物脱盐后干燥，得到藻蓝蛋白。
在本发明中，所述盐析过程中藻蓝蛋白上清液与磷酸铵溶液的体积比为1∶(2～3)，更优选为1∶2.2；所述磷酸氨溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，更优选为0.2mol/L，pH值为4.0～4.5，更优选为4.2；所述盐析的温度为15～20℃，更优选为18℃。
在本发明中，所述步骤3)的盐析反应进行搅拌，所述搅拌的反应时间为1～2h，转速为20～30rpm，更优选为1.5h，转速25rpm。
在本发明中，所述步骤3)脱盐方法包括：将盐析后的藻蓝蛋白沉淀加入氯化铵溶液中溶解沉淀，过分子量为1×105～5×105，更优选为3×105的超滤膜浓缩除去磷酸盐和铵盐离子。在本发明中，所述氯化铵溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，优选为0.08mol/L，pH值为7～8，优选为7.5。
在本发明中，所述步骤3)中的干燥为喷雾干燥。本发明在进行喷雾干燥过程时，优选加入保护剂，所述保护剂的加入能够提高藻蓝蛋白的回收率和喷雾干燥的效率，所述保护剂优选为海藻糖、β-环糊精和多孔淀粉中的一种或多种，所述保护剂的添加质量百分比优选为0.1～1％，更优选为0.3～0.8％。在本发明中，所述喷雾干燥的条件具体优选为入塔风温为80～120℃，更优选为100℃，通气量为：800～1200L/h，更优选为1100L/h。
下面结合实施例，对本发明提供的一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法进行详细的描述，但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。
实施例1
螺旋藻的培养和收集：
1)制备用于螺旋藻培养的人工海水培养基，培养基的组成：12.0g/L NaHCO3，4.03g/L Na2CO3，0.4g/L K2HPO4，2.5g/L NaNO3，1.25g/L K2SO4，1.25g/L NaCl，0.25g/LMgSO4·2H2O，0.05g/L CaCl2·2H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.08g/L EDTA。将螺旋藻接种培养在100L鼓泡管式光照反应器中，培养基pH值维持在9.0，培养温度控制在30℃，持续通入浓度2.0％CO2，采用LED光源光照强度控制在100lux，光照和暗培养时间分别为12小时交替培养8天，螺旋藻密度可达20g/L。收获菌体。
2)高密度培养的螺旋藻培养液通过连续分离的管式陶瓷膜(膜孔径为0.1μm)将菌体和培养液分离，除去菌体的培养液继续回流到光照反应器中，添加1/4新鲜培养基同时接种螺旋藻藻种，按照步骤1)的培养条件进行重复培养。收集浓缩含螺旋藻的菌液待进行破壁处理。
螺旋藻的酶解破壁：
1)向收集合55％的螺旋藻的菌液中加入0.03％的1500U/g纤维素酶，1000U/g果胶酶和1500U/g溶菌酶的混合物(质量比为1∶2∶1)。在35℃温度下搅拌处理4hr，转速控制在65rpm，待螺旋藻破壁率达到98％以上，得到破壁螺旋藻，备用。
氯化铵溶液萃取藻蓝蛋白：
在破壁的螺旋藻中加入2倍体积0.08M氯化氨溶液(pH7.2)，在提取罐中常温下搅拌处理5hr，转速控制在55rpm，藻蓝蛋白萃取到含有氯化氨溶液的上清液中，然后通过0.1um超滤膜分离，得到藻蓝蛋白上清液，提取收率可达98％以上，藻蓝蛋白的纯度可达(A620/A280)可达2.0以上；
藻蓝蛋白盐析沉淀纯化：
提取液加入2倍体积的0.2M的磷酸铵(pH＝4)溶液缓慢搅拌处理1.5h，转速控制在20-30rpm之间，温度控制在25℃，获得藻蓝蛋白的盐析沉淀，4500rpm离心收集藻蓝蛋白的沉淀，使用0.1M氯化铵溶液(pH＝7)重新溶解沉淀，再经过100,000-300,000分子量的超滤膜除去磷酸盐和铵盐离子。
藻蓝蛋白的浓缩和干燥
将所得脱盐溶液进一步经过300,000分子量的超滤膜浓缩后，得到高浓度的藻蓝蛋白液态产品，藻蓝蛋白纯度可达3.8以上。为了得到固态粉末藻蓝蛋白，在液态藻蓝蛋白中加入0.3％的β-环糊精和多孔淀粉(质量比为1.5∶1)作为保护剂经过喷雾干燥处理获得藻蓝蛋白的粉剂产品。获得高纯度的药用级藻蓝蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将螺旋藻进行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；
2)将所述破壁螺旋藻与氯化铵溶液混合，将藻蓝蛋白萃取到氯化铵溶液中，超滤得到藻蓝蛋白上清液；
3)采用磷酸铵溶液对所述藻蓝蛋白上清液进行盐析，将得到的盐析产物脱盐后干燥，得到藻蓝蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述螺旋藻在光反应器培养得到，所述酶解破壁前将培养得到的螺旋藻进行陶瓷膜过滤；
所述陶瓷膜过滤的温度为20～30℃，切向流速为3～5m/s，过膜压力为0.6～0.9bar。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)酶解破壁用酶为复合酶，所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶和溶菌酶；所述酶解时间为3～5h，所述酶解温度为30～40℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)破壁螺旋藻与氯化铵溶液的体积比为1∶(2～3)；所述氯化铵溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，pH值为7～8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)萃取包括搅拌过程，所述搅拌的时间为4～6h，转速为50～80rpm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的超滤采用直径为0.4～0.1μm的超滤膜进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)盐析过程中藻蓝蛋白上清液与磷酸铵溶液的体积比为1∶(2～3)；所述磷酸氨溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，pH值为4.0～4.5；所述盐析的温度为15～20℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的盐析反应进行搅拌，所述搅拌的反应时间为1～2h，转速为20～30rpm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)脱盐方法包括：将盐析后的藻蓝蛋白沉淀加入氯化铵溶液中溶解沉淀，过分子量为1×105～5×105的超滤膜浓缩除去磷酸盐和铵盐离子。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的干燥为喷雾干燥。
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