CN106190853A - 一种高产藻蓝蛋白的红藻培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效的红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养或混养培养和光自养培养，光自养培养是以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。本发明还涉及一种快速积累藻蓝蛋白的方法。采用本发明的方法可充分发挥红藻在异养或混养阶段藻细胞快速生长的优势，为后续光自养阶段提供大量藻种。红藻在光自养阶段快速生长，并且积累藻蓝蛋白。本申请提供的方法可以解决现有红藻光自养培养过程中细胞生长速率过慢和利用微藻生产藻蓝蛋白时存在的含量及产率低的问题。

Description

一种高产藻蓝蛋白的红藻培养方法
技术领域
本发明涉及一种高效的红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养或混养培养和光自养培养，光自养培养是以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。本发明还涉及一种快速积累藻蓝蛋白的方法。
背景技术
红藻属红藻门(Rhodophyta)，藻体含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，以及大量的藻红蛋白和藻蓝蛋白，常因各类色素的含量不同，使藻体出现鲜红或粉红、紫、紫红等不同的颜色。有些单细胞红藻(unicellular rhodophyte)在生长过程中可积累大量的特殊色素——藻蓝蛋白(Graverholt O和Eriksen N.,Heterotrophic high-cell-densityfed-batch and continuous-flow cultures of Galdieria sulphuraria andproduction of phycocyanin.Applied Microbiology&Biotechnology,77(1):69-75,2007)。
藻蓝蛋白(phycocyanin)是天然存在的色素蛋白，主要存在于红藻、蓝藻和隐藻中。分离出的蓝藻蛋白呈深蓝色粉末状。蓝藻蛋白具有良好的保健功能，例如可以抗癌、抗氧化、促进血细胞再生等。藻蓝蛋白又是一种良好的天然食用色素，可以广泛用作多种食品的添加剂。又由于藻蓝蛋白中含有荧光，所以可以用作实验中的荧光剂。因此，蓝藻蛋白具有极高应用价值。
目前国内外藻蓝蛋白的生产提取主要源于螺旋藻，光自养培养的螺旋藻中藻蓝蛋白含量可达12％(张义明，《螺旋藻混合营养生长与藻蓝蛋白含量》，贵州工业大学学报:自然科学版,(3):64-69,1997)，但光自养培养螺旋藻生产藻蓝蛋白的弊端在于光自养培养的生物量低和藻蓝蛋白的产率低，远远不能满足大规模生产和市场的需求。近年来，利用红藻产藻蓝蛋白的研究逐渐深入，据文献报道，红藻可以大量利用有机碳源进行异养生长，异养培养红藻的藻蓝蛋白产率可达0.5-0.9g/L/d，是螺旋藻(Spirulina platensis)的20-278倍(Graziani G,Schiavo S,Nicolai MA等，Microalgae as human food:chemical andnutritional characteristics of the thermo-acidophilic microalga Galdieriasulphuraria.Food&function,4(1):144-152,2013)，且与螺旋藻的C型藻蓝蛋白不同，红藻的藻蓝蛋白为R型，具有更强的热稳定性，在抑制癌细胞和抗食物过敏有着更强的功效。此外，红藻也可以在光自养条件下积累藻蓝蛋白，光自养培养的红藻的藻蓝蛋白含量可达10％(Graziani G,Schiavo S,Nicolai MA等，Microalgae as human food:chemical andnutritional characteristics of the thermo-acidophilic microalga Galdieriasulphuraria.Food&function,4(1):144-152,2013)，而使用本发明方法的实施例中达到14.50％。因此，利用红藻生产提取藻蓝蛋白具有广阔的应用前景。
温泉红藻(Cyanidiophyceae，简称Cyanidia)是一群生活在高温高酸的极端环境中的单细胞红藻，能够通过光合作用将太阳的能量转化成糖类。温泉红藻主要分布在世界各地的火山活动仍然活跃、并具有硫酸成分高的温泉水体的地区，如美国黄石国家公园、意大利火山区、新西兰火山区、印尼火山区及日本火山区等。
目前国内外对于温泉红藻的研究主要集中在异养培养方面。虽然红藻的异养培养过程可以实现生物量的快速增长，但获得的藻细胞内藻蓝蛋白的含量较低，因此也无法用于以高产藻蓝蛋白为目的红藻规模化培养。此外，异养过程，通常选择的培养基为普通的微藻异养培养基，未添加促进藻蓝蛋白积累的植物生长激素类物质，培养过程通常不加以调控或通过间歇流加未经优化的补料培养基，这一方法未考虑红藻异养与普通光自养在营养需求上存在的差异，造成培养基对藻蓝蛋白的积累效果不佳，藻蓝蛋白产率低下。
另一方面，光自养可以获得较高藻蓝蛋白含量的藻细胞，目前光自养培养红藻所用藻种均采用光自养培养获得；同时，在细胞内积累藻蓝蛋白是一个极其耗能的过程，效率较低，这也就意味着红藻的光自养生长速率和产率要比其他微藻低，倍增时间要比其他微藻长。虽然红藻的光自养培养过程可积累大量的藻蓝蛋白，但大规模生产时需要及时提供大量高活力的细胞作为光自养培养时的种子。综上，本领域亟需一种高效的红藻培养工艺和方法。同时，本领域也亟需一种高效的藻蓝蛋白生产方法。
发明简述
针对上述问题，本申请提供了一种有效的解决方法。本发明涉及一种高效的红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养培养、混养培养(又称兼养培养方式)和光自养培养，光自养培养是以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。本发明还涉及一种快速积累藻蓝蛋白的方法。
采用本申请提供的方法可充分发挥红藻在异养或混养阶段藻细胞快速生长的优势，为红藻在光自养培养时提供大量的藻种，以及微藻在光自养阶段快速生长并积累细胞中的活性物质(例如藻蓝蛋白)。本申请提供的方法可以获得高的细胞产率和代谢物质产率，为解决红藻光自养培养过程中细胞生长速率过慢和活性物质(例如藻蓝蛋白)含量低、产率低的问题提供重要的技术手段。
具体而言，本发明具备如下优点：
(1)本申请提供的方法可以大大提高藻种培养速率。以一般户外大池培养微藻的初始接种密度为0.05～0.1g/l、大池的体积一般为5000L为例，如果需满足这一要求，则需要250～500g的微藻。如果采用现有技术中传统的光自养扩培藻种的方法，红藻种光自养扩培10天的藻细胞密度为0.5g/l，培养体积为500L，那么如果要达到上述的微藻产量，则需要1～2月的时间；而采用本申请提供的异养培养藻种的方法，则只需数天即可完成。
(2)与传统的藻种光自养培养相比，本申请提供的方法可以减少藻种培养过程中的装置及设备数量，并且占地面积小，单位培养面积产率高。以(1)中所述的例子，如果采用现有技术中传统的藻种光自养扩培，需要500L的培养装置，并且占用时间较长，一般1～2个月。而采用本申请提供的藻种进行异养培养，则只需50L的培养装置，并且占用时间较短，一般10～20天。
(3)与传统的藻种光自养培养相比，本申请提供的藻种异养或混养培养方法不受户外天气及环境的影响。使用现有技术中传统的藻种光自养培养时，若遇到短期的阴雨天气而无法继续培养时，则需要搬入室内并添加人工光来继续进行光自养培养藻种，因此增加了藻种异养培养时所不需要的人工光照费用。另外，户外光自养的藻种若受到原生动物、浮游生物等污染，那么本批藻种则会报废，需重新再进行藻种的扩培工作，还会导致下一步光自养培养没有藻种用于培养的问题，严重影响生产。
(4)当使用本申请提供的藻种异养或混养培养方法进行户外大池培养时，接种量越大，越不容易受到其他杂藻或原生动物等污染。因此，藻种的异养或混养培养可及时提供大量光自养培养时所需的种子。
(5)异养或混养细胞作为藻种的活力优于光自养藻种的活力，接入相同藻细胞量分别进行光自养培养时，采收时异养或混养藻种的藻细胞密度和藻蓝蛋白产率均高于光自养藻种的藻细胞密度和藻蓝蛋白产率。因此，在获得相同藻蓝蛋白产率的情况下，利用本申请提供的异养藻种能使得光自养设备占地面积少，面积产率高。另外，由于用异养或混养细胞作为藻种进行光自养培养所获得的藻细胞密度较大。因此，本申请提供的方法可以大大降低了红藻采收的成本。
(6)向温泉红藻异养、混养和光自养培养基中加入少量的植物生长激素时，异养、混养和光自养的细胞生长速率有显著提升，且大规模的应用成本少。因此，本申请提供的添加植物激素方法可以降低红藻生产的成本，加大藻蓝蛋白产出。
综上所述，本发明提供的以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子的光自养培养模式，可以完全解决光自养培养时由于藻种培养效率低且易受污染所造成的诸多问题，以及红藻在光自养阶段生长速率慢且藻蓝蛋白产率低等问题。因此，本发明为解决红藻光自养培养过程中细胞和藻蓝蛋白产率低的问题提供了重要的技术手段。
根据本申请的一个方面，本申请提供了一种红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养或混养培养，以及光自养培养。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养包括：在生物反应器中加入培养基，接入微藻藻种进行培养。
根据本申请的某些实施方式，所述接入微藻藻种是按工作体积的0.1～20％接入。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养的培养基含有氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水。
根据本申请的某些实施方式，所述异养和混养培养的培养基还含有植物生长激素。
根据本申请的某些实施方式，所述有机碳源包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、乙酸、乙酸钠、纤维素半纤维素的水解物、甘油，优选葡萄糖。
根据本申请的某些实施方式，所述植物生长激素包括2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素中的一种或多种。
根据本申请的某些实施方式，所述植物生长激素的浓度是0.001-35毫克/升培养基，优选0.001-20毫克/升，更优选0.001-15毫克/升，0.005-10毫克/升，0.01-10毫克/升，0.1-5毫克/升。
根据本申请的某些实施方式，所述微量元素宜选自H3BO3、ZnSO4·7H2O、MnCl2·H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、NaVO3·4H2O中的一种或多种。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 0.1～5克/升、葡萄糖0.1～50克/升、KH2PO4 0.1～2.0克/升、MgSO4·7H2O0.1～2.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～1克/升、NaCl 0.01～1克/升、Fe-EDTA 0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水。
根据本申请的某些实施方式，所述微量元素的组成为H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O0.001-5毫克/升。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养的培养基pH为1.0～4.0，优选1.5～2.5。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中有机碳源含量控制在0-10g/L的范围内，氮的含量控制在0.5-10mM的范围内，磷的含量控制在0.05-3.5mM的范围内。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养结束时，碳、氮和/或磷等营养成分的浓度基本消耗完毕，例如浓度在0.01mM以下，优选浓度为零。
根据本申请的某些实施方式，当异养或混养培养的培养基中有机碳源消耗完后，结束异养培养。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养可以采用分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、半连续培养或连续培养等方式进行。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养的温度为10～70℃，优选25～50℃。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养中控制溶氧在1％以上。
根据本申请的某些实施方式，所述异养培养时，不需要光照。
根据本申请的某些实施方式，所述混养培养是在异养培养的基础上外加光照，光照强度为1-750μmolm-2s-1。
根据本申请的某些实施方式，所述混养培养的光照条件为自然光或人工光。
根据本申请的某些实施方式，所述混养培养中使用连续光照或间歇光照。
根据本申请的某些实施方式，所述异养培养的生物反应器可以是摇瓶、或者机械搅拌式、气升式或鼓泡式生物反应器；所述混养培养的生物反应器可以是摇瓶、可蒸汽灭菌的封闭式光生物反应器、或者机械搅拌式、气升式或鼓泡式生物反应器等含光照系统的生物反应器。
根据本申请的某些实施方式，所述异养或混养培养的周期为1～80天，优选1～30天，更优选5～20天。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养是以所述异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养是在光生物反应器中加入培养基，接入异养或混养培养的藻种进行光自养培养。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的初始接种密度为0.1～20克/升。
根据本申请的某些实施方式，在所述光自养培养中，可以用培养基对所述异养或混养培养所得的藻细胞稀释，稀释后藻细胞密度为0.1-5g/L。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的培养基含有氮源、无机盐、微量元素和水。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的培养基还含有植物生长激素。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的培养基不含有机碳源。
根据本申请的某些实施方式，所述植物生长激素包括2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素中的一种或多种。
根据本申请的某些实施方式，所述植物生长激素的浓度是0.001-35毫克/升培养基，优选0.001-20毫克/升，更优选0.001-15毫克/升，0.005-10毫克/升，0.01-10毫克/升，0.1-5毫克/升。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的培养基包含(NH4)2SO4 0.1～5克/升、KH2PO4 0.1～2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.1～2.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～1克/升、NaCl0.01～1克/升、Fe-EDTA 0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水。
根据本申请的某些实施方式，所述微量元素包含H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养中培养基的pH为1.0～4.0。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的培养温度为10～70℃，优选25～50℃。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的光照条件为自然光或人工光。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的光照强度为1～750μmolm-2s-1。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养中使用连续光照或间歇光照。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的生物反应器可以是摇瓶、或者敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器、管道式光生物反应器、柱式光生物反应器、薄膜立袋、敞开式与封闭式杂交的光自养培养系统、贴壁培养系统。
根据本申请的某些实施方式，所述光自养培养的周期为1～80天，优选1～50天，优选1～30天，更优选5～20天。
根据本申请的某些实施方式，所述红藻的藻种包括Cyanidioschyzon merolae、Cyanidium caldarium、Galdieria sulphuraria、Galdieria maxima、Galdieria partita和Galdieria daedala。
根据本申请的某些实施方式，所述Galdieria sulphuraria是Galdieriasulphuraria074G。
根据本申请的一个方面，本申请提供了一种生产藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使用如前述任意一项权利要求所述的红藻培养方法来培养红藻；采收藻细胞；以及提取藻蓝蛋白。
根据本申请的某些实施方式，所述采收藻细胞的方法包括离心、絮凝、沉降、气浮或过滤。
根据本申请的某些实施方式，所述提取藻蓝蛋白还包括破壁红藻细胞。
根据本申请的某些实施方式，所述破壁红藻细胞的方法包括反复冻融法、超声破壁法、藻体自溶、高压匀浆、酶水解、水相热解破壁方法。
根据本申请的某些实施方式，所述提取藻蓝蛋白还包括蛋白分级方法，所述方法是在破壁红藻细胞后经离心获得粗提液，从所述粗提液中使用硫酸铵盐析法、结晶法、或等电点沉淀法提取蛋白，所述方法获得的蛋白沉淀采用透析方法收集。
根据本申请的某些实施方式，采收藻细胞后的处理方法包括但不限于喷雾干燥、冷冻干燥等。
附图说明
图1显示红藻细胞在500ml摇瓶中分别进行异养、混养和光自养培养过程中，细胞密度随时间的变化；
图2显示红藻在1L及5L摇瓶中异养培养过程中，细胞密度随时间的变化；
图3显示红藻在5L发酵罐中培养过程中，细胞密度、葡萄糖和NH4随时间的变化；
图4显示红藻异养种子和光自养种子在室内1L光生物反应器中光自养培养过程中，细胞密度随时间的变化；
图5显示红藻异养种子和光自养种子在室内1L光生物反应器中光自养培养过程中，藻蓝蛋白含量随时间的变化。
发明详述
除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。
定义
红藻门藻类(拉丁名Rhodophyta)大部分生长在海洋中，大部分红藻的藻体为多细胞、少数为单细胞，一般呈现暗红色或紫红色。多种红藻具有重要的经济价值，可用于医学、食品等行业。
单细胞红藻在生长过程中可积累大量的特殊色素——藻蓝蛋白，因此单细胞红藻可以用于生产藻蓝蛋白。
温泉红藻是一群生活在高温高酸的极端环境中的单细胞红藻。根据目前的分类系统，温泉红藻已知主要有三属六种(Cyanidioschyzon merolae、Cyanidium caldarium、Galdieria sulphuraria、Galdieria maxima、Galdieria partita和Galdieria daedala)。
藻蓝蛋白(phycocyanin)是天然存在的色素蛋白，主要存在于红藻、蓝藻和隐藻中。分离出的蓝藻蛋白呈深蓝色粉末。蓝藻蛋白具有良好的保健功能，例如可以抗癌、抗氧化、促进血细胞再生等等。藻蓝蛋白又是一种良好的天然食用色素，可以广泛用作多种食品的添加剂。又由于藻蓝蛋白中含有荧光，所以可以用作实验中的荧光剂。因此，蓝藻蛋白具有极高应用价值。
本申请使用术语“基本上由……组成”表示培养基中除了含有主要组分(NH4)2SO4、葡萄糖以及无机盐、微量元素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特性或新的特性(即可维持红藻在较短的培养周期内细胞密度达到较高的水平，同时藻蓝蛋白含量与常规异养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。本申请使用术语“由……组成”表示上述培养基由所指出的具体组分组成，没有其他组分，但是可以带有含量在通常范围内的杂质。
本申请提供的红藻培养方法包括异养培养或混养培养，以及光自养培养，其中光自养培养是以异养培养或者混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。
异养培养或混养培养
本申请所用术语“异养培养”是指细胞利用外源有机碳源合成自身所需物质的培养方法。本申请异养过程中没有光照。“混养培养”是在异养培养的基础上外加光源，光照强度为1-750μmolm-2s-1。本领域中当光照强度低于1μmolm-2s-1时，认为是异养培养。
本申请中可采用本领域熟知的各种培养基来进行红藻种子的异养培养。异养的培养基中都需要添加有机碳源。本申请中用于红藻的异养培养的培养基含有氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水。适用于红藻培养的氮源、有机碳源、无机盐、微量元素等是本领域周知的。例如，作为氮源，可使用的有铵盐或尿素，如(NH4)2SO4等；作为有机碳源，可使任何可以作为微生物培养的碳源，包括但不限于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉。
为了促进细胞快速生长，本发明创造性地在异养或混养培养基中添加了植物生长激素。所述植物生长激素可显著促进细胞生长。用于本申请异养培养的培养基的植物生长激素包括但不限于2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素等。本申请异养培养的培养基中可含有一种或多种植物生长激素。培养基中植物生长激素的总含量可为0.001-35毫克/升培养基，例如0.001-30毫克/升、0.001-25毫克/升、0.005-35毫克/升、0.005-30毫克/升、0.005-30毫克/升、0.005-25毫克/升、0.01-35毫克/升、0.01-30毫克/升、0.01-30毫克/升、0.01-25毫克/升、0.015-35毫克/升、0.015-30毫克/升、0.015-30毫克/升、0.015-25毫克/升、0.02-35毫克/升、0.02-30毫克/升、0.02-30毫克/升、0.02-25毫克/升、0.03-35毫克/升、0.03-30毫克/升、0.03-30毫克/升、0.03-25毫克/升、0.04-35毫克/升、0.04-30毫克/升、0.04-30毫克/升、0.04-25毫克/升、0.05-35毫克/升、0.05-30毫克/升、0.05-30毫克/升、或0.05-25毫克/升。优选植物生长激素的总含量为0.001-20毫克/升，例如0.005-20毫克/升、0.01-20毫克/升、0.02-20毫克/升、0.03-20毫克/升、0.04-20毫克/升、或0.05-20毫克/升。更优选植物生长激素的总含量为0.001-15毫克/升，例如0.001-12毫克/升、0.001-10毫克/升、0.001-8毫克/升、0.001-5毫克/升、0.003-15毫克/升、0.003-12毫克/升、0.003-10毫克/升、0.003-8毫克/升、0.003-5毫克/升、0.005-15毫克/升、或0.005-12毫克/升；更优选为0.005-10毫克/升、0.008-10毫克/升、0.005-8毫克/升、或0.005-5毫克/升；更优选为0.01-10毫克/升，例如0.03-10毫克/升、0.05-10毫克/升、0.08-10毫克/升、0.1-10毫克/升、0.01-8毫克/升、0.01-5毫克/升、0.03-10毫克/升、0.03-8毫克/升、0.03-5毫克/升、0.05-10毫克/升、0.05-8毫克/升、0.05-5毫克/升、0.08-10毫克/升、0.08-8毫克/升、0.08-5毫克/升、0.1-10毫克/升、或0.1-8毫克/升；更优选0.1-5毫克/升，例如0.1-4毫克/升、0.1-3毫克/升、0.1-2毫克/升、0.1-1毫克/升、0.3-5毫克/升、0.3-4毫克/升、0.3-3毫克/升、0.3-2毫克/升、0.3-1毫克/升、0.5-5毫克/升、0.5-4毫克/升、0.5-3毫克/升、0.5-2毫克/升、0.5-1毫克/升、0.8-5毫克/升、0.8-4毫克/升、0.8-3毫克/升、0.8-2毫克/升、0.8-1毫克/升、1-5毫克/升、1-4毫克/升、1-3毫克/升、或1-2毫克/升。
根据本申请的优选实施方式，培养基中的植物生长激素可以是，例如2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升，苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升，脱落酸0.001-5毫克/升，赤霉素0.001-5毫克/升，3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升，萘乙酸0.001-5毫克/升，芸苔素0.001-5毫克/升。根据本申请的优选实施方式，各植物生长激素的浓度各自优选为，例如0.01-4毫克/升、0.1-4毫克/升、0.3-4毫克/升、0.3-3毫克/升、0.5-2.5毫克/升不等。
可从市售途径获得所述植物生长激素，然后直接添加到本发明所公开的异养和混养培养基中。
根据某些实施方式，本发明所用的异养或混养培养基基本上由氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水组成。根据某些实施方式，本发明所用的异养或混养培养基还包含植物生长激素。
在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对微藻细胞密度和品质有很大的实质影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基还包含无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、氯化钠和磷酸盐等。根据本申请的优选实施方式，培养基还包含微量元素，例如Mn、Zn、B、V、Mo、Cu、Co等。根据本申请的优选实施方式，在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自H3BO3、ZnSO4·7H2O、MnCl2·H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、NaVO3·4H2O中的一种或多种。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。
根据本申请的优选实施方式，本发明所采用的异养或混养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 0.1～5克/升、葡萄糖0.1～50克/升、KH2PO4 0.1～2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.1～2.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～1克/升、NaCl 0.01～1克/升、Fe-EDTA 0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水。根据本申请的优选实施方式，所述微量元素的组成为H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
根据本申请的优选实施方式，本发明所采用的异养或混养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 2～4克/升、葡萄糖15～40克/升、KH2PO4 0.1～1.0克/升、MgSO4·7H2O0.1～1.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～0.1克/升、NaCl 0.01～0.1克/升、Fe-EDTA 0.01～0.1克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-10ml和水。根据本申请的优选实施方式，所述微量元素的组成为H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
根据本申请的优选实施方式，本发明的异养和混养培养基组合物宜由以下成分组成：(NH4)2SO4 3克/升、葡萄糖35克/升、KH2PO4 0.3克/升、MgSO4·7H2O 0.3克/升、CaCl2·2H2O 0.01克/升、NaCl 0.01克/升、Fe-EDTA 0.1克/升、脱落酸1毫克/升、赤霉素0.8毫克/升、芸苔素2毫克/升、微量元素2ml和水。根据本申请的优选实施方式，所述微量元素的组成为H3BO3 5毫克/升、MnCl2·4H2O 5毫克/升、ZnSO4·7H2O 1毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 1毫克/升、CuSO4·5H2O 0.5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.1毫克/升、CoCl2·6H2O 0.1毫克/升。
根据本申请的优选实施方式，在根据上述配方配制培养基后，可用本领域已知的常规手段如酸或碱将所述培养基的pH调为1.0～4.0，例如pH 1.0～3.5、1.0～3.0、1.0～2.5、1.0～2.0、1.5～4、1.5～3、1.5～2.5、或3～4；优选pH 1.5～2.0。
根据本申请的优选实施方式，将培养基灭菌后使用。根据本申请的优选实施方式，灭菌可以是115～120℃下高压灭菌15～20分钟。根据本申请的优选实施方式，灭菌可以是本领域已知的用于培养基灭菌的其他条件。
当进行种子异养或混养培养时，将相应配制好的培养基加入到生物反应器中，补加水至工作体积，通常装料系数为0.6～0.8，然后蒸汽灭菌(121℃，维持约20分钟)，当温度降至30～50℃时，按工作体积的5～20％接入红藻开始培养。
本申请所用的术语“工作体积”是指摇瓶、发酵罐或光生物反应器中藻液的实际体积。根据本申请的优选实施方式，所述接入微藻藻种是按工作体积的0.1～20％接入，例如0.1～15％、0.1～10％、0.1～5％、0.1～1％、1～15％、1～10％、1～5％、3～15％、3～10％、3～5％、5～18％、5～15％、5～12％、5～10％、5～8％、8～20％、8～18％、8～15％、8～12％、8～10％、10～20％、10～18％、10～15％、10～12％、12～20％、12～18％、12～15％、15～20％、15～18％、或18～20％。根据本申请的优选实施方式，所述接入微藻藻种约是工作体积的0.1％、1％、3％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养过程中控制培养温度为10-70℃，例如10-65℃、10-60℃、10-55℃、10-50℃、15-70℃、15-65℃、15-60℃、15-55℃、15-50℃、20-70℃、20-65℃、20-60℃、20-55℃、20-50℃、25-70℃、25-65℃、25-60℃、25-55℃、25-50℃、30-70℃、30-65℃、30-60℃、或30-55℃；优选30～50℃，例如30～45℃、或35～50℃；更优选35～45℃。根据本申请的优选实施方式，异养培养过程中控制培养温度可以是约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、或50℃。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养过程中溶氧不低于1％的空气饱和浓度，例如溶氧不低于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养中pH控制在1.0～4.0，例如pH1.0～3.5、1.0～3.0、1.0～2.5、1.0～2.0、1.5～4.0、1.5～3.0、1.5～2.5、1.8～4.0、1.8～3.0、或1.8～2.5；优选pH 1.5～2.0，更优选1.8～2.0。根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养中控制pH小于4.0，例如小于3.5、3、2.5、小于2.0、小于1.8、小于1.5。根据本申请的优选实施方式，异养或混养过程中，通过补料将藻液的pH控制在1.0～4.0的范围内的一个恒定值，例如pH 2.0。通常将藻液的pH控制在1.5～2.0范围内的一个恒定值，更优选控制在1.8～2.0的范围内。
根据本申请的优选实施方式中，温度为40～42℃，溶氧不低于10％的空气饱和浓度，pH控制在1.5～2.0。
根据本申请的优选实施方式，所述异养或混养培养的生物反应器中可以是摇瓶、或者机械搅拌式、气升式或鼓泡式生物反应器，或者是本领域技术人员公知的任何可用于异养培养的生物反应器。
根据本申请的优选实施方式，所述红藻藻种异养培养时，不需要光照。根据本申请的优选实施方式，所述红藻藻种混养培养时，需要进行光照。根据本申请的优选实施方式，所述红藻藻种的混养培养是在异养培养的基础上外加以大于1μmolm-2s-1的光照。
根据本申请的优选实施方式，所述混养培养过程中使用连续光照。根据本申请的优选实施方式，所述混养培养过程中使用间歇光照。根据本申请的优选实施方式，所述混养培养的光照条件为自然光。根据本申请的优选实施方式，所述混养培养的光照条件为人工光。
根据本申请的优选实施方式，混养培养过程中光照强度为1-750μmolm-2s-1，例如1-500μmolm-2s-1、1-250μmolm-2s-1、1-100μmolm-2s-1、1-50μmolm-2s-1、50-750μmolm-2s-1、50-500μmolm-2s-1、50-250μmolm-2s-1、50-100μmolm-2s-1、80-750μmolm-2s-1、580-500μmolm-2s-1、80-250μmolm-2s-1、80-100μmolm-2s-1、100-750μmolm-2s-1、100-500μmolm-2s-1、100-250μmolm-2s-1、250-750μmolm-2s-1、250-500μmolm-2s-1、或500-750μmolm-2s-1。
在本发明的方法中，异养或混养培养红藻过程中，通过补料控制pH恒定以及葡萄糖、氮和/或磷等元素稳定在一定浓度范围内，且异养或混养培养结束时控制葡萄糖、氮和/或磷等营养成分的浓度较低甚至为零。
所述异养或混养培养可以采用分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、半连续培养或连续培养等方式进行。本申请技术人员应理解，无论采用分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、半连续培养或连续培养中的任何一种培养方式，在培养过程中，须控制适合的培养条件使微藻种子正常生长。
本领域的技术人员应理解，在异养培养过程中，pH值的少许变动是允许的。例如，可允许pH有±Y的变动，其中Y≤1.0，例如Y≤0.9、Y≤0.8、Y≤0.7、Y≤0.6、Y≤0.5、Y≤0.4、Y≤0.3、Y≤0.2、或Y≤0.1。根据本申请的优选实施方式，Y＝0。
根据本申请的优选实施方式，通过补料将藻液的pH控制为X±Y，其中，该1.0≤X±Y≤4.0。例如，在本发明的一个实施方式中，通过补料将藻液的pH控制在2.0±1.0，优选2.0±0.8，优选2.0±0.5，更优选2.0±0.3的范围之内。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养结束时控制碳、铵盐和/或磷等营养成分的浓度较低，优选为零。
根据本申请的优选实施方式，当异养或混养培养的培养基中有机碳源消耗完后，结束异养或混养培养。根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养基中的有机碳源是葡萄糖。根据本申请的优选实施方式，当异养或混养培养液中的葡萄糖消耗完后，则异养或混养培养结束。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中葡萄糖的浓度控制在0-10g/L的范围内，例如0-8g/L、0-6g/L、0-5g/L、0-4g/L、0-2g/L、2-10g/L、2-8g/L、2-6g/L、2-4g/L、4-10g/L、4-8g/L、4-6g/L、5-10g/L、5-8g/L、5-6g/L、6-10g/L、6-8g/L或8-10g/L。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中氮的含量控制在0.5-10mM的范围内，例如0.5-8mM、0.5-6mM、0.5-4mM、0.5-2mM、0.5-1mM、1-10mM、1-8mM、1-6mM、1-4mM、1-2mM、2-10mM、2-8mM、2-6mM、2-4mM、4-10mM、4-8mM、4-6mM、6-10mM、6-8mM、或8-10mM。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中磷的含量控制在0.05-3.5mM的范围内，例如0.05-3.0mM、0.05-2.5mM、0.05-2.0mM、0.05-1.5mM、0.05-1.0mM、0.05-0.5mM、0.05-0.1mM、0.1-3.5mM、0.1-3.0mM、0.1-2.5mM、0.1-2.0mM、0.1-1.5mM、0.1-1.0mM、0.1-0.5mM、0.5-3.5mM、0.5-3.0mM、0.5-2.5mM、0.5-2.0mM、0.5-1.5mM、0.5-1.0mM、1.0-3.5mM、1.0-3.0mM、1.0-2.5mM、1.0-2.0mM、1.0-1.5mM、1.5-3.5mM、1.5-3.0mM、1.5-2.5mM、1.5-2.0mM、2.0-3.5mM、2.0-3.0mM、2.0-2.5mM、2.5-3.5mM、2.5-3.0mM、或3.0-3.5mM。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中葡萄糖的含量控制在0-10g/L的范围内，氮的含量控制在0.5-10mM的范围内，磷的含量控制在0.05-3.5mM的范围内。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中葡萄糖的含量控制在0-5g/L的范围内，氮的含量控制在1-6mM的范围内，磷的含量控制在0.1-2.5mM的范围内。
根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养结束时，将碳、氮和/或磷等营养成分的浓度控制为基本消耗完毕，优选甚至为零。本申请所用术语“基本消耗完毕”是指营养成分的浓度在0.01mM以下，例如0.008mM、0.005mM、0.003mM、0.001mM、0.0005mM、或0.0001mM以下。例如，根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养结束时，碳源的浓度为零，氮源和/或磷源/或镁源的浓度控制在0.01mM以下。根据本申请的优选实施方式，异养或混养培养结束时，碳源的浓度为零，氮源和/或磷源/或镁源的浓度控制在0.001mM以下。
根据本申请的优选实施方式，所述异养或混养培养的周期为1～80天，例如1～75天、1～70天、1～65天、1～60天、1～55天、1～50天、1～45天、1～40天、或1～35天；优选1～30天，例如1～25天、1～20天、2～30天、2～25天、2～20天、5～30天、或5～25天；更优选5～20天，例如5～18天、5～15天、5～12天、5～10天、5～8天、8～20天、8～18天、8～15天、8～12天、8～10天、10～20天、10～18天、10～15天、10～12天、12～20天、12～18天、12～15天、15～20天、15～18天、或18～20天。根据本申请的优选实施方式，所述异养或混养培养的时间可以为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、或30天。
光自养培养
本申请所用术语“光自养培养”是将异养培养或混养培养获得的红藻细胞接种到光自养培养装置中进行光自养培养，即不添加有机化合物，在必需无机养分和光能存在的情况下，对作为碳源的CO2进行还原同化，合成细胞内所有的有机代谢物进行的培养模式。
根据本申请的优选实施方式，可直接对所述异养培养或混养培养获得的红藻细胞进行光自养培养，即直接添加光自养培养基进行光自养培养。根据本申请的优选实施方式，也可先向所获得的红藻异养培养或混养培养的培养液中添加光自养培养基，并添加水稀释后进行光自养培养。根据本申请的优选实施方式，稀释后藻细胞密度为0.01-10g/L，例如0.01-8g/L、0.01-5g/L、0.01-3g/L、0.01-1g/L、0.01-0.5g/L、0.01-0.1g/L、0.01-0.05g/L、0.05-10g/L、0.05-5g/L、0.05-1g/L、0.05-0.5g/L、0.05-1g/L、0.05-0.1g/L、0.1-10g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.1-1g/L、0.1-0.5g/L、0.5-10g/L、0.5-5g/L、0.5-4g/L、0.5-3g/L、0.5-2g/L、0.5-1g/L、1-10g/L、1-5g/L、1-4g/L、1-3g/L、1-2g/L、2-10g/L、2-5g/L、2-4g/L、2-3g/L、3-10g/L、3-5g/L、3-4g/L、4-10g/L、4-5g/L、5-10g/L、6-10g/L、或8-10g/L。
本申请中可采用本领域熟知的各种光自养培养基来进行红藻种子的光自养培养。通常，光自养培养基含有氮源、磷源、无机碳源、无机盐、微量元素和水。适用于微藻培养的氮源、磷源、无机碳源、无机盐、微量元素等是本领域公知的。例如，作为氮源，可使用的有尿素或各种铵盐，如硫酸铵等；作为磷源，可使用的有例如KH2PO4；作为无机碳源，可使用的有例如CO2等。在本申请的某些实施方式中，光自养培养基不含有机碳源。
为了促进细胞快速生长，本发明创造性地在光自养培养基中添加了植物生长激素。所述植物生长激素可显著促进细胞生长。用于本申请光自养培养的培养基的植物生长激素包括但不限于2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素等。本申请光自养培养的培养基中可含有一种或多种植物生长激素。培养基中植物生长激素的总含量可为0.001-35毫克/升培养基，例如0.001-30毫克/升、0.001-25毫克/升、0.005-35毫克/升、0.005-30毫克/升、0.005-30毫克/升、0.005-25毫克/升、0.01-35毫克/升、0.01-30毫克/升、0.01-30毫克/升、0.01-25毫克/升、0.015-35毫克/升、0.015-30毫克/升、0.015-30毫克/升、0.015-25毫克/升、0.02-35毫克/升、0.02-30毫克/升、0.02-30毫克/升、0.02-25毫克/升、0.03-35毫克/升、0.03-30毫克/升、0.03-30毫克/升、0.03-25毫克/升、0.04-35毫克/升、0.04-30毫克/升、0.04-30毫克/升、0.04-25毫克/升、0.05-35毫克/升、0.05-30毫克/升、0.05-30毫克/升、或0.05-25毫克/升。优选植物生长激素的总含量为0.001-20毫克/升，例如0.005-20毫克/升、0.01-20毫克/升、0.02-20毫克/升、0.03-20毫克/升、0.04-20毫克/升、或0.05-20毫克/升。更优选植物生长激素的总含量为0.001-15毫克/升，例如0.001-12毫克/升、0.001-10毫克/升、0.001-8毫克/升、0.001-5毫克/升、0.003-15毫克/升、0.003-12毫克/升、0.003-10毫克/升、0.003-8毫克/升、0.003-5毫克/升、0.005-15毫克/升、或0.005-12毫克/升；更优选为0.005-10毫克/升、0.008-10毫克/升、0.005-8毫克/升、或0.005-5毫克/升；更优选为0.01-10毫克/升，例如0.03-10毫克/升、0.05-10毫克/升、0.08-10毫克/升、0.1-10毫克/升、0.01-8毫克/升、0.01-5毫克/升、0.03-10毫克/升、0.03-8毫克/升、0.03-5毫克/升、0.05-10毫克/升、0.05-8毫克/升、0.05-5毫克/升、0.08-10毫克/升、0.08-8毫克/升、0.08-5毫克/升、0.1-10毫克/升、或0.1-8毫克/升；更优选0.1-5毫克/升，例如0.1-4毫克/升、0.1-3毫克/升、0.1-2毫克/升、0.1-1毫克/升、0.3-5毫克/升、0.3-4毫克/升、0.3-3毫克/升、0.3-2毫克/升、0.3-1毫克/升、0.5-5毫克/升、0.5-4毫克/升、0.5-3毫克/升、0.5-2毫克/升、0.5-1毫克/升、0.8-5毫克/升、0.8-4毫克/升、0.8-3毫克/升、0.8-2毫克/升、0.8-1毫克/升、1-5毫克/升、1-4毫克/升、1-3毫克/升、或1-2毫克/升。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养基中的植物生长激素可以是，例如2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升，苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升，脱落酸0.001-5毫克/升，赤霉素0.001-5毫克/升，3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升，萘乙酸0.001-5毫克/升，芸苔素0.001-5毫克/升。根据本申请的优选实施方式，各植物生长激素的浓度各自优选为，例如0.01-4毫克/升、0.1-4毫克/升、0.3-4毫克/升、0.3-3毫克/升、0.5-2.5毫克/升不等。
可从市售途径获得所述植物生长激素，然后直接添加到本发明所公开的光自养培养基中。
本发明所采用的光自养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 0.01～10克/升、KH2PO4 0.1～1.0克/升、MgSO4·7H2O 0.1～1.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～1克/升、NaCl0.01～1克/升、Fe-EDTA0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水，其中微量元素的组成为H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
在一个实施例中，本发明所采用的光自养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 2～8克/升、KH2PO4 0.1～1.0克/升、MgSO4·7H2O 0.1～1.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～0.1克/升、NaCl 0.01～0.1克/升、Fe-EDTA0.01～0.1克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-10ml和水，其中微量元素的组成为H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
在一个较佳的实施方案中，本发明的光自养培养基组合物宜由以下成分组成：(NH4)2SO4 5克/升、KH2PO4 0.2克/升、MgSO4·7H2O 0.3克/升、CaCl2·2H2O 0.01克/升、NaCl0.01克/升、Fe-EDTA0.1克/升、脱落酸0.1毫克/升、赤霉素0.1毫克/升、芸苔素1毫克/升、微量元素2ml和水，其中微量元素的组成为H3BO3 5毫克/升、MnCl2·4H2O 5毫克/升、ZnSO4·7H2O 1毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 1毫克/升、CuSO4·5H2O 0.5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.1毫克/升、CoCl2·6H2O 0.1毫克/升。
根据本申请的优选实施方式，在根据上述配方配制培养基后，可用本领域已知的常规手段如酸或碱将所述培养基的pH调为1.0～4.0，例如pH 1.0～3.5、1.0～3.0、1.0～2.5、1.0～2.0、或1.5～2.5；优选pH 1.5～2.0。
根据本申请的优选实施方式，将培养基灭菌后使用。根据本申请的优选实施方式，灭菌可以是115～120℃下高压灭菌15～20分钟。根据本申请的优选实施方式，采用次氯酸钠消毒灭菌2～20h，然后用硫代硫酸钠进行中和。根据本申请的优选实施方式，灭菌可以是本领域已知的用于培养基灭菌的其他条件。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养的初始接种密度通常为0.1～20克/升，例如0.1～15g/L、0.1～10g/L、0.1～5g/L、0.1～1g/L、0.1～0.5g/L、0.5～20g/L、0.5～15g/L、0.5～10g/L、0.5～5g/L、0.5～1g/L、1～20g/L、1-15g/L、1-10g/L、1-5g/L、5～20g/L、5～15g/L、5～10g/L、10～20g/L、10～15g/L、或15～20g/L。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养过程中控制培养温度为10-70℃，例如10-65℃、10-60℃、10-55℃、10-50℃、15-70℃、15-65℃、15-60℃、15-55℃、15-50℃、20-70℃、20-65℃、20-60℃、20-55℃、20-50℃、25-70℃、25-65℃、25-60℃、25-55℃、30-70℃、30-65℃、30-60℃、或30-55℃；优选25～50℃，例如25～45℃、25～40℃、25～35℃、25～30℃、30～50℃、30～45℃、30～35℃、35～50℃、35～45℃、35～40℃、40～50℃、40～45℃、或45～50℃。根据本申请的优选实施方式，光自养培养过程中控制培养温度可以是约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、或50℃。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养过程中光照强度为1-750μmolm-2s-1，例如1-500μmolm-2s-1、1-250μmolm-2s-1、1-100μmolm-2s-1、1-50μmolm-2s-1、50-750μmolm-2s-1、50-500μmolm-2s-1、50-250μmolm-2s-1、50-100μmolm-2s-1、80-750μmolm-2s-1、580-500μmolm- 2s-1、80-250μmolm-2s-1、80-100μmolm-2s-1、100-750μmolm-2s-1、100-500μmolm-2s-1、100-250μmolm-2s-1、250-750μmolm-2s-1、250-500μmolm-2s-1、或500-750μmolm-2s-1。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养过程中使用连续光照。根据本申请的优选实施方式，光自养培养过程中使用间歇光照。根据本申请的优选实施方式，所述光自养培养的光照条件为自然光。根据本申请的优选实施方式，所述光自养培养的光照条件为人工光。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养中初始培养基的pH控制在1.0～4.0，例如pH 1.0～3.5、1.0～3.0、1.0～2.5、1.0～2.0、1.5～3.0、1.5～2.5、1.8～3.0、或1.8～2.5；优选pH 1.5～2.0，更优选1.8～2.0。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养中通气量为0.05～5vvm，例如0.05～4vvm、0.05～3vvm、0.05～2vvm、0.05～1vvm、0.05～0.5vvm、0.05～0.1vvm、0.1～5vvm、0.1～4vvm、0.1～3vvm、0.1～2vvm、0.1～1vvm、0.1～0.5vvm、0.5～5vvm、0.5～4vvm、0.5～3vvm、0.5～2vvm、0.5～1vvm、1～5vvm、1～4vvm、1～3vvm、1～2vvm、2～5vvm、2～4vvm、2～3vvm、3～5vvm、3～4vvm、或4～5vvm。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养中通入CO2浓度为0.01～10％，例如0.01～8％、0.01～5％、0.01～3％、0.01～1％、0.01～0.5％、0.01～0.1％、0.1～10％、0.1～8％、0.1～5％、0.1～3％、0.1～1％、0.1～0.5％、0.5～10％、0.5～8％、0.5～5％、0.5～3％、0.5～1％、1～10％、1～8％、1～5％、1～3％、3～10％、3～8％、3～5％、5～10％、5～8％、或8～10％。
根据本申请的优选实施方式，所述光自养培养的生物反应器可以是摇瓶、或者敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器、管道式光生物反应器、柱式光生物反应器、薄膜立袋、敞开式与封闭式杂交的光自养培养系统、贴壁培养系统，或者是本领域技术人员公知的任何可用于光自养培养的生物反应器。
根据本申请的优选实施方式，当红藻细胞生长处于稳定期时(即红藻细胞密度不增加或藻蓝蛋白含量不增加或藻蓝蛋白产率不增加时)，结束光自养培养。
根据本申请的优选实施方式，所述异养培养的周期为1～80天，例如1～70天、1～60天、50～80天、50～70天、60～80天；优选1～50天，例如1～40天、30～50天、30～40天、或40～50天；优选1～30天，例如1～25天、1～20天、2～30天、2～25天、2～20天、5～30天、或5～25天；更优选5～20天，例如5～18天、5～15天、5～12天、5～10天、5～8天、8～20天、8～18天、8～15天、8～12天、8～10天、10～20天、10～18天、10～15天、10～12天、12～20天、12～18天、12～15天、15～20天、15～18天、或18～20天。根据本申请的优选实施方式，所述异养培养的时间可以为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、或30天。
根据本申请的优选实施方式，可采用现有技术已知的各种红藻来实施本发明的技术方案，包括但不限于红藻Galdieria sulphuraria。根据本申请的优选实施方式，所用红藻藻种包括Galdieria sulphuraria。根据本申请的优选实施方式，所述Galdieriasulphuraria是Galdieria sulphuraria 074G。
根据本申请的具体实施方式，Galdieria sulphuraria 074G的最适生长温度为40℃，超过了45℃生长速度就变慢。根据本申请的具体的实施方式，Galdieriasulphuraria074G可在胞内积累藻蓝蛋白。
藻细胞的采收及藻蓝蛋白的提取
本申请提供的生产藻蓝蛋白的方法，包括使用异养或混养、以及光自养方法培养红藻细胞，以及采收藻细胞和提取藻蓝蛋白。
根据本申请的优选实施方式，采收藻细胞的方法包括但不限于高速离心、沉降、絮凝、气浮、过滤，或者本领域技术人员已知的任何采收藻细胞的方法。
根据本申请的优选实施方式，所述提取藻蓝蛋白还包括破壁红藻细胞。根据本申请的优选实施方式，藻细胞破壁方法包括但不限于反复冻融法、超声破壁法、藻体自溶、高压匀浆、酶水解、水相热解等湿法破壁方法。
根据本申请的优选实施方式，光自养培养结束后，对红藻进行离心采收，获得湿藻体。
根据本申请的优选实施方式，所述提取藻蓝蛋白方法包括超声破壁法。所述超声破壁法是将藻体置于磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等摩尔混合)中，在超声波粉碎机中冰浴超声5分钟，然后8000rpm离心5分钟，得到的上清液即为藻蓝蛋白粗提液。重复上述步骤直至上清液无色，将粗提液经30000rpm离心10min，所得的上清液即为藻蓝蛋白溶液。
根据本申请的优选实施方式，破壁红藻细胞经离心后获得的粗提液，进一步包括蛋白分级方法。根据本申请的优选实施方式，所述蛋白分级方法包括但不限于硫酸铵盐析法、结晶法、等电点沉淀法等提取方法。所得蛋白沉淀采用透析方法收集。
采收藻细胞的方法包括但不限于自然沉降法、离心法、絮凝法，采收后的藻细胞处理及藻粉生产的方法包括但不限于喷雾干燥、冷冻干燥等。
在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。
除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。除非另有所述，本发明采用的培养基中各组分含量均用克/升(g/L)表示。应理解，本申请中“含有”、“包含”也包括“由……组成”、“由……构成”的含义。
本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。
本申请描述了优选的实施方式和实施例，本领域技术人员在阅读本申请的基础上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请包括法律允许范围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。
实施例
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是为了举例说明的目的，不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例中涉及到藻细胞干重和藻蓝蛋白含量的测定方法如下：
藻细胞干重测定：在红藻培养过程中取培养液V毫升，8000rpm离心10分钟，将离心后的藻体用去离子水洗涤3次，转移至称量瓶(W1(克))中，在80℃烘箱中烘干至恒重W2(克)。藻体干重Cx可根据下式计算：
Cx(克/升)＝(W2-W1)/V/1000。
藻蓝蛋白测定：取体积为V1的诱导藻液，用10ml磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等摩尔混合)溶解，在超声波粉碎机中冰浴超声震荡5min，8000rpm离心5min，取上层清液置于密闭容量瓶中，沉淀重复超声离心直到上清为无色，上清液定容至体积V2后，测定OD620、OD652、OD562，用缓冲液做空白对照。总烃含量(％)按下式计算：
X1＝0.187*A620-0.089*A652
X2＝0.196*A652-0.041*A620
X3＝0.104*A562-0.251*X1-0.088*X2
X 4 = ( X 1 + X 2 + X 3 ) × V 2 V 1
X1：藻蓝素含量，mg/ml；
X2：异藻蓝素含量，mg/ml；
X3：藻红素含量，mg/ml；
V1：取样量，ml；
V2：定容体积，ml；
X4：藻蓝蛋白含量，mg/ml。
实施例1：红藻细胞异养及光自养培养过程中藻细胞生长的研究
本实施例用于比较红藻细胞的异养、混养和光自养的培养结果。本实施例中使用红藻细胞是红藻Galdieria sulphuraria 074G。
异养和混养摇瓶培养基成分：(NH4)2SO4 5克/升、葡萄糖35克/升、KH2PO4 0.2克/升、MgSO4·7H2O 0.3克/升、CaCl2·2H2O 0.01克/升、NaCl 0.01克/升、Fe-EDTA 0.1克/升、脱落酸0.1毫克/升、赤霉素0.1毫克/升、芸苔素1毫克/升、微量元素2ml和水，其中微量元素的组成为H3BO3 5毫克/升、MnCl2·4H2O 5毫克/升、ZnSO4·7H2O 1毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 1毫克/升、CuSO4·5H2O 0.5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.1毫克/升、CoCl2·6H2O 0.1毫克/升。
光自养摇瓶培养基成分：(NH4)2SO4 5克/升、KH2PO4 0.2克/升、MgSO4·7H2O 0.3克/升、CaCl2·2H2O 0.01克/升、NaCl 0.01克/升、Fe-EDTA 0.1克/升、脱落酸0.1毫克/升、赤霉素0.1毫克/升、芸苔素1毫克/升、微量元素2ml和水，其中微量元素的组成为H3BO3 5毫克/升、MnCl2·4H2O 5毫克/升、ZnSO4·7H2O 1毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 1毫克/升、CuSO4·5H2O 0.5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.1毫克/升、CoCl2·6H2O 0.1毫克/升。
本实施例的红藻分别在500ml的摇瓶中进行异养、混养和光自养培养。红藻异养培养的接种密度为0.63g/l，温度为40℃，转速为150rmp，装液量200ml。红藻混养培养的条件与异养培养一致，除外部有光照，光强为80μmolm-2s-1。红藻异养和混养培养到8d，利用葡萄糖试剂盒(上海科欣生物技术研究院，产品号：G221-200)测定方法来确定培养液中的葡萄糖耗完。此时，细胞密度分别为6.65g/l和7.15g/L，可作为用于下一步光自养培养的种子。红藻的异养、混养和光自养结果如图1所示，图中的标准方差是3次独立分开实验的结果。
红藻种子光自养培养时的接种密度为0.63g/l，温度为40℃，光照强度为500μmolm-2s-1，连续光照，培养到8d时，藻细胞密度仅为1.01g/l，可作为用于下一步光自养培养的种子(图1)。
由图1可以看出，与光自养培养相比，异养培养和混养培养的红藻细胞生长速率比光自养培养的细胞生长速率快，分别是光自养培养生长速率的15.8和17.2倍。由此可见，红藻细胞的异养培养和混养培养可以使得红藻细胞快速生长，为后续培养积累大量的红藻细胞数量。
实施例2：红藻在不同级别的生物反应器中异养培养过程比较
本实施例用于比较红藻细胞在不同级别的生物反应器中异养培养的结果。本实施例的生物反应器是1L和5L的摇瓶，本实施例中使用红藻细胞是红藻Galdieriasulphuraria 074G。
红藻1L及5L摇瓶异养培养的接种密度为0.52g/l，温度为40℃，转速为150rmp。红藻异养培养到8d，培养液中的葡萄糖耗完，1L及5L摇瓶的最终藻细胞密度分别为8.23g/l和8.40g/L，可用于下一步光自养培养的种子。结果示于图2，图中的标准方差是3次独立分开实验的结果。
在5L发酵罐中加入所述异养培养基和水至3L后进行蒸汽灭菌，然后当温度降到40℃时接入红藻，开始异养培养。当在线检测溶氧反弹时，补入一定体积的补料培养基使溶氧稳定。溶氧反弹是指培养过程中发酵罐在线控制的溶氧数值突然大幅升高。
补料培养基包括有机碳源(葡萄糖)、氮源(硫酸铵)和无机盐等营养盐，补加的营养盐是经浓缩后的上述相应培养基，促使微藻继续生长，同时及时监测发酵液中碳、氮、磷、镁的含量，适当调整该4类物质在补料培养基含量，以保证发酵液中该4类物质浓度稳定。结果见图3，在异养培养结束时，藻细胞干重达到35.0g/l，是5L摇瓶培养最终细胞密度的4.16倍。
由此可见，红藻可以进行异养培养，摇瓶培养规模可扩大至5L，能够为后期发酵罐异养提供充足的种子。5L发酵罐的结果表明红藻可以利用发酵罐进行大规模的异养培养，为户外的光自养培养提供充足的种子，后期可开展更大规模的发酵罐异养培养。
实施例3：红藻异养种子和光自养种子在室内1L玻璃柱式光生物反应器中进行光 自养培养的研究
本实施例在室内1L圆柱型气升式光生物反应器中开展，分别采用异养和光自养培养条件下获得的藻细胞作为种子，其中异养藻细胞为实施例2中所得的细胞。本实施例分别测定了异养和光自养种子在光自养过程中的干重、藻蓝蛋白含量。
异养和光自养种子的接种密度均为0.5g/l，光自养培养温度均为40℃，均通入5％的CO2，通气量均为0.25vvm。在光自养培养时光照强度为250μmolm-2s-1，连续光照。光自养培养到8d，异养种子的干重为5.83g/l，初始藻蓝蛋白含量为0.75％，最终藻蓝蛋白含量为13.93％；光自养种子的干重为4.45g/l，初始藻蓝蛋白含量为8.63％，最终藻蓝蛋白含量为14.50％。结果如图4、图5所示。图4中的标准方差是3次独立分开实验的结果，图5中的pc指藻蓝蛋白。
由此可见，与光自养种子相比，异养种子进行光自养培养后最终得到的藻细胞中藻蓝蛋白含量也接近14％，但异养种子初始藻蓝蛋白含量更低，实际积累产率更高。因此本申请的方法适用于高效培养红藻细胞，也适用于大规模高效生产藻蓝蛋白。
生产藻蓝蛋白的方法包括使用本申请所述的红藻培养方法来培养红藻，采收藻细胞，以及提取藻蓝蛋白。采收藻细胞的方法包括离心、絮凝、沉降、气浮或过滤。所述提取藻蓝蛋白还包括破壁红藻细胞，破壁红藻细胞可以的方法包括采用反复冻融法、超声破壁法、藻体自溶、高压匀浆、酶水解、水相热解破壁方法。所述提取藻蓝蛋白还包括蛋白分级方法，所述方法是在破壁红藻细胞后经离心后获得的粗提液，从所述粗提液中使用进一步包括蛋白分级方法，优选所述蛋白分级方法包括但不限于硫酸铵盐析法、结晶法、或等电点沉淀法等提取蛋白方法。所述方法获得所得的蛋白沉淀采用透析方法收集。采收后的藻细胞处理及藻粉生产的方法包括但不限于喷雾干燥、冷冻干燥等。
以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。

Claims (15)

1.一种红藻培养方法，其特征在于，所述方法包括红藻的异养或混养培养，以及光自养培养，其中所述异养或混养培养包括：在生物反应器中加入培养基，接入微藻藻种进行培养，优选所述接入微藻藻种是按工作体积的0.1～20％接入。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养的培养基含有氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水，优选所述异养和混养培养的培养基还含有植物生长激素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机碳源包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、乙酸、乙酸钠、纤维素半纤维素的水解物、甘油，优选葡萄糖；优选所述植物生长激素包括2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素中的一种或多种，优选所述植物生长激素的浓度是0.001-35毫克/升培养基，优选0.001-20毫克/升，更优选0.001-15毫克/升，0.005-10毫克/升，0.01-10毫克/升，0.1-5毫克/升；优选所述微量元素宜选自H3BO3、ZnSO4·7H2O、MnCl2·H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、NaVO3·4H2O中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 0.1～5克/升、葡萄糖0.1～50克/升、KH2PO4 0.1～2.0克/升、MgSO4·7H2O0.1～2.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～1克/升、NaCl 0.01～1克/升、Fe-EDTA0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水；优选所述微量元素的组成为H3BO30.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养的培养基pH为1.0～4.0，优选1.5～2.5；优选所述异养或混养培养的温度为10～70℃，优选25～50℃；优选所述异养或混养培养中控制溶氧在1％以上；优选所述异养或混养培养的周期为1～80天，优选1～30天，更优选5～20天。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中有机碳源含量控制在0-10g/L的范围内，氮的含量控制在0.5-10mM的范围内，磷的含量控制在0.05-3.5mM的范围内，优选所述异养或混养培养结束时，碳、氮和/或磷等营养成分的浓度基本消耗完毕，例如浓度在0.01mM以下，优选浓度为零；优选当异养或混养培养的培养基中有机碳源消耗完后，结束异养培养；优选所述异养或混养培养可以采用分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、半连续培养或连续培养等方式进行。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异养培养时，不需要光照；或所述混养培养是在异养培养的基础上外加光照，光照强度为1-750μmolm-2s-1，其中所述混养培养的光照条件为自然光或人工光，优选所述混养培养中使用连续光照或间歇光照。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光自养培养是以所述异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施；其中所述光自养培养是在光生物反应器中加入培养基，接入异养或混养培养的藻种进行光自养培养；优选所述光自养培养的初始接种密度为0.1～20克/升；优选在所述光自养培养中，可以用培养基对所述异养或混养培养所得的藻细胞稀释，稀释后藻细胞密度为0.1-5g/L。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述光自养培养的培养基含有氮源、无机盐、微量元素和水；优选所述光自养培养的培养基还含有植物生长激素；优选所述光自养培养的培养基不含有机碳源。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物生长激素包括2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素中的一种或多种；优选所述植物生长激素的浓度是0.001-35毫克/升培养基，优选0.001-20毫克/升，更优选0.001-15毫克/升，0.005-10毫克/升，0.01-10毫克/升，0.1-5毫克/升。
11.如权利要求7中所述的方法，其特征在于，所述光自养培养的培养基包含(NH4)2SO40.1～5克/升、KH2PO4 0.1～2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.1～2.0克/升、CaCl2·2H2O0.01～1克/升、NaCl 0.01～1克/升、Fe-EDTA 0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水；优选所述微量元素包含H3BO3 0.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述光自养培养中培养基的pH为1.0～4.0；优选所述光自养培养的培养温度为10～70℃，优选25～50℃；所述光自养培养的光照条件为自然光或人工光，优选所述光自养培养的光照强度为1～750μmolm-2s-1；优选所述光自养培养中使用连续光照或间歇光照；优选所述光自养培养的周期为1～80天，优选1～50天，优选1～30天，更优选5～20天。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红藻的藻种包括Cyanidioschyzonmerolae、Cyanidium caldarium、Galdieria sulphuraria、Galdieria maxima、Galdieriapartita和Galdieria daedala；优选所述Galdieria sulphuraria是Galdieriasulphuraria 074G。
14.一种生产藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括
i.使用如前述任意一项权利要求所述的红藻培养方法来培养红藻；
ii.采收藻细胞；以及
iii.提取藻蓝蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述采收藻细胞的方法包括离心、絮凝、沉降、气浮或过滤；所述提取藻蓝蛋白还包括破壁红藻细胞；优选所述破壁红藻细胞的方法包括反复冻融法、超声破壁法、藻体自溶、高压匀浆、酶水解、水相热解破壁方法；优选所述提取藻蓝蛋白还包括蛋白分级方法，所述方法是在破壁红藻细胞后经离心获得粗提液，从所述粗提液中使用硫酸铵盐析法、结晶法、或等电点沉淀法提取蛋白，所述方法获得的蛋白沉淀采用透析方法收集；优选采收藻细胞后的处理方法包括但不限于喷雾干燥、冷冻干燥等。
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