CN108165600A - 从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，其包括：(1)取新鲜或干燥的螺旋藻的藻体于液氮中研磨形成螺旋藻粉，形成螺旋藻粉悬浊液；(2)向螺旋粉悬浊液中加入木瓜蛋白酶和糖化酶组成的复合酶，弃上清液，获得沉淀物；(3)将步骤(2)中获得的沉淀物分级沉淀，透析除盐，获得盐析剩余物；(4)将盐析剩余物清洗之后加入含三氯乙酸和疏基乙醇的丙酮溶液超声混合后静置，之后经两次离心处理，冷冻干燥沉淀。本发明提供的从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，流程工艺简单，易于规模化生产；相较于传统提取方法，本发明提供的方法藻蓝蛋白的获取率高，所获得的藻蓝蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成条带数目多，质量高。

Description

从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法
技术领域
本发明特别涉及一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
螺旋藻中包含多种生物活性物质，其中藻胆蛋白在螺旋藻干粉中含量丰富(占15-25,w/w％)，并具有重要的医药、保健、生物工程等方面应用价值。对于我国螺旋藻产业中普遍养殖的钝顶螺旋藻品系而言，其藻胆蛋白成分主要包含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，二者在藻胆蛋白中的含量比例约为3：1，其中藻蓝蛋白由于含量上的绝对优势(约占螺旋藻干粉的10-20,w/w％)致使其研究应用更为普遍。藻蓝蛋白不但在保健食品及医药领域具有抗辐射、抗癌、免疫调节、促进造血和延缓衰老等功能，据其纯度的不同更广泛地被应用于荧光探针和天然色素等生物工程、食品科学和精细化工等领域。然而由于螺旋藻藻胆蛋白中的藻蓝蛋白分子和别藻蓝蛋白分子的亚基之间氨基酸序列同源性很高，造成藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白难以分离的技术瓶颈。
目前螺旋藻藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化通常采用羟基磷灰石介质进行层析分离，但存在吸附性弱、洗脱时间长、上样量少等问题，并且还需结合其它多步层析操作如体积排阻层析和离子交换层析等进一步提高藻蓝蛋白纯度。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，包括：
(1)取新鲜或干燥的螺旋藻的藻体于液氮中研磨形成螺旋藻粉，并加入螺旋藻粉2-3倍质量的磷酸盐缓冲液形成螺旋藻粉悬浊液；
(2)向所述螺旋粉悬浊液中加入木瓜蛋白酶和糖化酶组成的复合酶，先于pH为4-6、30-45℃水浴超声溶解0.5-1.5h，再95-105℃水浴灭酶0.5-0.8h，然后60-80℃水浴浸提，弃上清液，获得沉淀物；
(3)将步骤(2)中获得的沉淀物采用30-50％的硫酸盐和磷酸盐形成的混合溶液分级沉淀，透析除盐，获得盐析剩余物；
(4)将所述盐析剩余物加-3-0℃去离子水反复清洗2-3次，之后加入含三氯乙酸和疏基乙醇的丙酮溶液超声混合后于-20--10℃静置1-2h，之后以1200-1500r/min的转速进行第一次离心处理20-40min；弃上清液、加入疏基乙醇的丙酮溶液于-20--10℃静置1-2h，之后以1200-1500r/min的转速进行第二次离心处理20-40min，弃上清液、冷冻干燥沉淀；所述沉淀即藻蓝蛋白。
与现有技术相比，本发明的优点包括：本发明提供的从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，流程工艺简单，易于规模化生产；相较于传统提取方法，本发明提供的方法藻蓝蛋白的获取率高，所获得的藻蓝蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成条带数目多，质量高。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例提供了一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，包括：
(1)取新鲜或干燥的螺旋藻的藻体于液氮中研磨形成螺旋藻粉，并加入螺旋藻粉2-3倍质量的磷酸盐缓冲液形成螺旋藻粉悬浊液；
(2)向所述螺旋粉悬浊液中加入木瓜蛋白酶和糖化酶组成的复合酶，先于pH为4-6、30-45℃水浴超声溶解0.5-1.5h，再95-105℃水浴灭酶0.5-0.8h，然后60-80℃水浴浸提，弃上清液，获得沉淀物；
(3)将步骤(2)中获得的沉淀物采用30-50％的硫酸盐和磷酸盐形成的混合溶液分级沉淀，透析除盐，获得盐析剩余物；
(4)将所述盐析剩余物加-3-0℃去离子水反复清洗2-3次，之后加入含三氯乙酸和疏基乙醇的丙酮溶液超声混合后于-20--10℃静置1-2h，之后以1200-1500r/min的转速进行第一次离心处理20-40min；弃上清液、加入疏基乙醇的丙酮溶液于-20--10℃静置1-2h，之后以1200-1500r/min的转速进行第二次离心处理20-40min，弃上清液、冷冻干燥沉淀；所述沉淀即藻蓝蛋白。
进一步的，所述复合酶的体积浓度为0.5％～1％。
更进一步的，所述复合酶中木瓜蛋白酶和糖化酶的质量比为1:1-1.5。
优选的，所述硫酸盐包括硫酸铵和硫酸钠；所述磷酸盐包括磷酸铵和磷酸钠。
进一步的，步骤(4)中所述盐析剩余物与含三氯乙酸和疏基乙醇的丙酮溶液的用量比为0.3-0.5g：1-1.3mL。
优选的，所述三氯乙酸的质量体积比浓度为8-12％；所述疏基乙醇的体积分数为0.05-0.1％。
如下将结合具体实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
实施例
一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，包括：
(1)取新鲜或干燥的螺旋藻的藻体于液氮中研磨形成螺旋藻粉，并加入螺旋藻粉2-3倍质量的磷酸盐缓冲液形成螺旋藻粉悬浊液；
(2)向所述螺旋粉悬浊液中加入木瓜蛋白酶和糖化酶组成的复合酶，复合酶于螺旋粉悬浊液中的体积浓度为1％，先于pH为4-6、30-45℃水浴超声溶解0.5-1.5h，再95-105℃水浴灭酶0.5-0.8h，然后60-80℃水浴浸提，弃上清液，获得沉淀物；
(3)将步骤(2)中获得的沉淀物采用30％的硫酸盐和磷酸盐形成的混合溶液分级沉淀，透析除盐，获得盐析剩余物；
(4)将所述盐析剩余物加-3-0℃去离子水反复清洗2-3次，之后加入含10％(W/V)三氯乙酸和0.07％(V/V)疏基乙醇的丙酮溶液(每0.3g盐析剩余物加入1mL)，漩涡震荡后于-20℃静置1h，之后以1200r/min的转速进行第一次离心处理20；弃上清液、加入疏基乙醇的丙酮溶液于-20--10℃静置1-2h，之后以1200r/min的转速进行第二次离心处理20-40min，弃上清液、冷冻干燥沉淀；所述沉淀即藻蓝蛋白，标记为实施例蛋白。
对比例1
一种藻蓝蛋白的提取方法，该方法包括以下步骤：
A、破壁：将含有藻蓝蛋白的鲜藻或经过预浸泡的藻粉加入-50℃～-10℃的冰粉中，将搅拌速度控制在1000r/min～3000r/min的条件下进行破壁处理，得到含有藻蓝蛋白的破壁液；
B、将得到的含有藻蓝蛋白的破壁液进行分离、纯化和干燥，得到成品藻蓝蛋白。标记为对比例1蛋白。
对比例2
一种提取高纯度藻蓝蛋白的方法，经过下列各步骤：
(1)将新鲜或干燥的钝顶螺旋藻的藻体制成螺旋藻粉；
(2)按螺旋藻粉:缓冲溶液＝1:0.8～1:1.2的质量比，在步骤(1)的螺旋藻粉中加入缓冲溶液，搅匀，于-10～-20℃下冻藏12～24h，再在20～25℃下解冻完全后，在压力为40～70MPa下进行高压匀质破壁2～5次，得到螺旋藻破壁液；
(3)将步骤(2)所得螺旋藻破壁液经离心分离，取上清液，依次用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜过滤上清液，得藻蓝蛋白粗提液；
(4)将步骤(3)的藻蓝蛋白粗提液以5～30mL/min的流速，通过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，组合型树脂的用量是螺旋藻粉体积的0.8～2.0倍；
(5)用羟基磷灰石体积的6～8倍量、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，清洗羟基磷灰石色谱柱，再将步骤(4)所得藻蓝蛋白提取液加到羟基磷灰石色谱柱中，静置吸附20～30min后，用羟基磷灰石体积的5～6倍量、浓度为0.03mol/L、流速为2～5mL/min的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，弃去洗脱液，再用羟基磷灰石体积的4～5倍量、浓度为0.03～0.045mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱羟基磷灰石色谱柱，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白精提液；
(6)将步骤(5)所得藻蓝蛋白精提液用通透量为30～50KDa的膜进行脱盐及浓缩，得到藻蓝蛋白精提液浓缩物，然后将该浓缩物进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到高纯度藻蓝蛋白。标记为对比例2蛋白。
分别称取三组10mg实施例蛋白、对比例1蛋白和对比例2蛋白，以1:15(mg：μmL)加入蛋白溶解液复溶，旋涡混匀后，置冰上超声5s后静置55s，连续15次；之后置于摇床室震荡1h，1300r/min、4℃离心30min，取上清液，测试蛋白含量测定，三组蛋白含量取平均值，测试结果如表1所示；其中蛋白溶解液为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、2％CHAPS、2％SB3-10。
表1为实施例蛋白、对比例1蛋白和对比例2蛋白中的蛋白含量
样品 实施例蛋白 对比例1蛋白 对比例2蛋白
蛋白含量(mg) 8.83±1.05 5.65±0.77 7.14±0.92
经测定，实施例蛋白中的蛋白含量最高，杂质较少，品质最高。
本发明提供的从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，流程工艺简单，易于规模化生产；相较于传统提取方法，本发明提供的方法藻蓝蛋白的获取率高，所获得的藻蓝蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成条带数目多，质量高。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括：
(1)取新鲜或干燥的螺旋藻的藻体于液氮中研磨形成螺旋藻粉，并加入螺旋藻粉2-3倍质量的磷酸盐缓冲液形成螺旋藻粉悬浊液；
(2)向所述螺旋粉悬浊液中加入木瓜蛋白酶和糖化酶组成的复合酶，先于pH为4-6、30-45℃水浴超声溶解0.5-1.5h，再95-105℃水浴灭酶0.5-0.8h，然后60-80℃水浴浸提，弃上清液，获得沉淀物；
(3)将步骤(2)中获得的沉淀物采用30-50％的硫酸盐和磷酸盐形成的混合溶液分级沉淀，透析除盐，获得盐析剩余物；
(4)将所述盐析剩余物加-3-0℃去离子水反复清洗2-3次，之后加入含三氯乙酸和疏基乙醇的丙酮溶液超声混合后于-20--10℃静置1-2h，之后以1200-1500r/min的转速进行第一次离心处理20-40min；弃上清液、加入疏基乙醇的丙酮溶液于-20--10℃静置1-2h，之后以1200-1500r/min的转速进行第二次离心处理20-40min，弃上清液、冷冻干燥沉淀；所述沉淀即藻蓝蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合酶的体积浓度为0.5％～1％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述复合酶中木瓜蛋白酶和糖化酶的质量比为1:1-1.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述硫酸盐包括硫酸铵和硫酸钠；所述磷酸盐包括磷酸铵和磷酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述盐析剩余物与含三氯乙酸和疏基乙醇的丙酮溶液的用量比为0.3-0.5g：1-1.3mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述三氯乙酸的质量体积比浓度为8-12％；所述疏基乙醇的体积分数为0.05-0.1％。
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