CN107812003A

CN107812003A - Vx‑809在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用

Info

Publication number: CN107812003A
Application number: CN201711181792.7A
Authority: CN
Inventors: 郑必霞; 刘志峰; 金玉; 王春莉; 贾占军; 朱梦姝; 黄艳; 尹瀚俊
Original assignee: Nanjing Childrens Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Childrens Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN107812003B

Abstract

本发明涉及生化医药技术领域，主要提供VX‑809在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用。该应用通过化合物VX‑809可以显著提高PFIC2患儿所携带的BSEP蛋白突变体Y472C、I669V和D1131V的表达水平，实现制备治疗由Y472C、I669V和D1131V突变所致的进行性家族性肝内胆汁淤积症的药物的新用途。意图为治疗PFIC，尤其是治疗PFIC2提供一种新的思路，拓展治疗PFIC的前景。

Description

VX-809在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用

技术领域

本发明属于生化医药技术领域，具体涉及VX-809在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，尤其是VX-809在制备由ABCB11基因Y472C、I669V和D1131V突变类型所致的进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用。

背景技术

进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)是一组罕见的异质性常染色体隐性遗传性疾病，发病率约为1/50000～1/100000。胆汁形成是一种渗透性分泌过程，肝细胞对各种胆汁成份的摄入与排泄依赖于以极性形式分布于基底外膜(窦状隙)或顶膜(毛细胆管)的肝胆膜分泌至毛细胆管的过程出现缺陷导致的。编码肝细胞毛细胆管面的肝细胞膜转运蛋白基因突变常常是导致PFIC的主要机制。依据编码肝细胞膜转运蛋白基因的不同，可将PFIC分为三型，即PFIC1、PFIC2和PFIC3。PFIC1是ATP8B1基因突变所致。PFIC2是ABCB11基因突变所致。PFIC3是ABCB4基因突变所致。PFIC1和PFIC2血清GGT活性正常，而PFIC3血清GGT活性升高。PFIC以严重肝内胆汁淤积为主要特征，在婴儿或儿童期发病，进展迅速，通常在儿童或青春期进展为终末期肝病。诊断主要靠临床症状、生化学检测、肝脏影像学、肝脏病理学及基因检测等。法国Jacquemin报道，10％～15％的儿童胆汁淤积性疾病归因于PFIC，10～15％的儿童肝移植适应证患者也归因于PFIC。国内王建设教授在24例表现为低血清GGT水平的胆汁淤积症患儿中分别确诊了9例PFIC1和7例PFIC2，而192例暂时性的黄疸患儿中，至少有3％的黄疸要归因于ABCB11基因突变。

进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(progressive familial intrahepaticcholestasis 2，PFIC2)是一种常染色体隐性遗传病，是婴儿期常见的胆汁淤积病因之一，其主要临床特征为婴儿期发生的严重的胆汁淤积及肝硬化，目前尚缺乏有效的治疗方法，可很快进展为肝衰竭而需要肝移植，Davit-Spraul A等在2010年曾报道的36例PFIC患儿中有19例(53％)需要进行肝移植。研究还显示PFIC2患儿还可伴发胆道结石，是肝胆恶性病变的高危人群(约15％发生肝癌或胆管癌)。PFIC2是由ABCB11单基因突变引起的，ABCB11基因编码产生一种跨膜糖蛋白，即胆盐输出泵蛋白(bile salt export pump，BSEP)，BSEP几乎均特异性的表达于毛细胆管面的肝细胞膜上，属于跨膜蛋白，主要功能是与单价胆汁酸盐结合，通过水解ATP将胆盐逆浓度梯度泵入毛细胆管内。PFIC2患儿ABCB11基因突变导致肝细胞膜上BSEP减少或缺乏，直接影响了胆汁酸的转运与分泌，从而导致胆汁淤积性肝病的发生。

到目前为止，熊去氧胆酸(UDCA)是PFIC2患儿主要临床治疗药物，但由于PFIC2患儿为原发性的肝细胞膜上BSEP缺陷，UDCA仅能一定程度上减轻PFIC2患儿胆汁淤积表现，患儿仍很快进展为肝衰竭而需要肝移植。近年来，仅有相关研究显示分子伴侣类药物4-PBA对于特定ABCB11突变类型的PFIC2患儿有一定的治疗效果。因此开发新的药物治疗PFIC，甚至PFIC2迫在眉睫。

VX-809化合物(Lumacaftor)是一种囊性纤维化跨膜传导调节剂(cysticfibrosis transmemebrane conductance regulator，CFTR)，其分子式为C₂₄H₁₈F₂N₂O₅，结构式如下：

CFTR蛋白是一种存在于多种器官的上皮细胞表面氯离子通道。2015年，美国FDA批准VX-809与VX-770(ivacaftor)的复方药物用于≥12岁携带F508del突变的囊性纤维化(CF)患儿。F508del突变的结果可引起CFTR蛋白质错误折叠，造成细胞的加工和运输缺陷，引起目标蛋白降解，减少细胞表面CFTR的数量。目前未见VX-809用于PFIC治疗的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供VX-809在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，意图为治疗PFIC、尤其是治疗PFIC2提供一种新的思路，拓展治疗PFIC的前景。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供一种化合物VX-809或其药学上可接受的盐在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，所述化合物VX-809的结构式如下：

进一步地，所述进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)包括PFIC1、PFIC2和PFIC3。

进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高进行性家族性肝内胆汁淤积症相关基因的转录水平。

进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高进行性家族性肝内胆汁淤积症相关基因的蛋白表达水平。

进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2相关基因的转录水平。

进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2相关基因的蛋白表达水平。

进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2患儿中ABCB11基因的转录水平。

更进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2患儿所携带的BSEP的蛋白表达水平。

更进一步地，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2患儿所携带的BSEP蛋白突变体Y472C、I669V和D1131V的表达水平。

一方面，本发明提供一种组合物在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，所述组合物包括化合物VX-809或其药学上可接受的盐，以及其药学上可接受的载体；所述化合物VX-809的结构式如下：

进一步地，所述组合物进一步包含粘液溶解剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂或营养剂等。

进一步地，所述组合物还包含顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白抑制剂、齐墩果酸、熊去氧胆酸等。

进一步地，所述组合物提高进行性家族性肝内胆汁淤积症相关基因的转录水平。

进一步地，所述组合物提高进行性家族性肝内胆汁淤积症相关基因的蛋白表达水平。

进一步地，所述组合物提高PFIC2相关基因的转录水平。

进一步地，所述组合物提高PFIC2相关基因的蛋白表达水平。

进一步地，所述组合物提高PFIC2患儿中ABCB11基因的转录水平。

更进一步地，所述组合物提高PFIC2患儿所携带的BSEP的蛋白表达水平。

更进一步地，所述组合物提高PFIC2患儿所携带的BSEP蛋白突变体Y472C、I669V和D1131V的表达水平。

本发明所用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐，在合理的医学判断范围内，它们适合用于与人体和低等动物组织接触，没有不适当的毒性、刺激性、变态反应等，与合理的利益/风险比相称。“药学上可接受的盐”表示本发明化合物VX-809的任意无毒性盐或酯盐，一旦对接受者给药，即能够直接或间接提供本发明化合物或者其抑制活性代谢产物或残余物。

药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等在J.PharmaceuticalSciences，1977，66，1-19中详细描述了药学上可接受的盐，引用在此作为参考。本发明化合物的药学上可接受的盐包括从适合的无机与有机酸与碱衍生的那些。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是与无机酸或有机酸生成的氨基的盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，有机酸例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者利用本领域所用的其他方法，例如离子交换形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。从适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N+(C_1-4烷基)₄盐。本发明也涵盖如本发明所公开的化合物的任意碱性含氮基团的季铵化作用。借助这类季铵化作用可以得到可溶于水或油或可分散在水或油中的产物。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。当适当的时候，其他药学上可接受的盐包括无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子盐，利用抗衡离子生成，例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。

组合物另外包含药学上可接受的载体，正如本发明中所述，它包括适合于所需的特定剂型的任意和所有溶剂、稀释剂或其他液体赋形剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington：The Science andPractice of Pharmacy，21stedition，2005，ed.D.B.Troy，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，eds，J.Swarbrick and J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York，公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除了任何常规载体介质与本发明化合物不相容以外，例如产生任何不可取的生物学效应或者以有害方式相互作用于药学上可接受的组合物的任何其他组分，它的使用涵盖在本发明的范围内。能够充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于离子交换剂氧化铝硬脂酸铝卵磷脂血清蛋白质，例如血清白蛋白缓冲物质，例如磷酸盐甘氨酸山梨酸或山梨酸钾饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物水盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐胶体二氧化硅三硅酸镁聚乙烯吡咯烷酮聚丙烯酸酯蜡类聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物羊毛脂糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素粉碎的黄蓍胶麦芽明胶滑石赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油二醇，例如丙二醇或聚乙二醇酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯琼脂缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝藻酸无热原的水等渗盐水林格氏溶液乙醇磷酸盐缓冲溶液以及其他无毒的可相容的润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁根据制剂人员的判断，在组合物中也可以存在着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香料、防腐剂和抗氧化剂。

本发明提及的药学上可接受的组合物可以对人和其他动物口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(以粉剂、软膏剂或滴剂)、颊、以口用或鼻用喷雾剂等方式给药，这依赖于所治疗感染的严重性。在某些实施方式中，本发明化合物可以被口服或肠胃外给药，剂量水平为每天约0.01mg/kg至约50mg/kg、优选约1mg/kg至约25mg/kg受治疗者体重，一天一次或多次，以获得所需的治疗效果。

可用于本发明的示例性抗生素包括妥布霉素(包括妥布霉素吸入粉末(TIP))、阿奇霉素、氨曲南(包括雾化形式的氨曲南)、阿米卡星(包括其脂质体制剂)、环丙沙星(包括其适于吸入给药的制剂)、左氧氟沙星(包括其雾化制剂)以及两种抗生素的组合(例如磷霉素和妥布霉素)等。

抗炎剂，即，可减少肺部炎症的药剂。可用于本发明的示例性的此类药剂包括：布洛芬、二十二碳六烯酸(DHA)、西地那非、吸入的谷胱甘肽、吡格列酮、羟基氯喹或辛伐他汀等。

示例性营养剂包括胰脂肪酶(胰腺酶替代物)或谷胱甘肽吸入剂等。

本发明的有益效果：

本发明提供VX-809的一种新用途，VX-809在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，意图为治疗PFIC，尤其是治疗PFIC2提供一种新的思路，拓展治疗PFIC的前景。也为PFIC患者尤其是PFIC2患者提供一种新的药物选择。本发明表明VX-809化合物可以显著提高PFIC2患儿所携带的BSEP蛋白突变体Y472C、I669V和D1131V的表达水平，提供了VX-809化合物在制备治疗由Y472C、I669V和D1131V突变所致的进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的新用途。本发明实验表明：VX-809能够增加BSEP突变体Y472C、I669V和D1131V的膜表达，改善突变体蛋白的构象稳定性，从而提高加工和运输成熟蛋白至细胞表面，实现对进行性家族性肝内胆汁淤积症的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1HEK293细胞瞬时转染BSEP ^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V重组表达质粒后，野生型及突变型BSEP表达水平比较。

图2用VX-809处理过表达野生型BSEP质粒的HEK293细胞中BSEP表达的检测结果；

A.不同浓度VX-809处理过表达野生型BSEP质粒的HEK293细胞中BSEP检测结果；B.用15umol VX-809处理过表达野生型BSEP质粒的HEK293细胞不同时间点BSEP表达的检测结果。

图3用15umol VX-809处理过表达野生型BSEP ^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V的HEK293细胞BSEP表达的检测结果；

图4pEYFP-N1质粒图谱；

图5pEYFP-N1质粒的多克隆位点；

图中，GAPDH内参。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验试剂及材料：

(1)细胞：人胚肾上皮细胞(293T细胞)由上海生命科学研究院提供。

药物：VX-809购自美国MCE公司。

(2)重组表达载体构建：表达载体pEYFP-N1购自长沙优宝生物。克隆重组试剂盒ClonExpress Entry One Step Cloning Kit、定点突变试剂盒Mut Express II FastMutagenesis Kit V2、PCR扩增试剂盒LAmp DNA Polymerase、化学感受态细胞DH5α均购自南京诺唯赞公司。

(3)细胞培养及转染：DMEM、FBS、0.25％Trypsin-EDTA(1×)、1×PBS、Penicillin-Streptomycin Liquid(Gibco，美国)；DMSO(Sigma，美国)；POLYjet。

(4)Western-blot：Tris-base、SDS、甘氨酸(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇、Tween-20(上海九亿化学试剂有限公司，上海)；RIPA裂解液(强)、蛋白酶抑制剂(PMSF)、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、5×Loading Buffer(碧云天，上海)；膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(凯基，南京)；蛋白Maker-PageRuler-Prestained Protein Ladder(Thermo，美国)；鼠源抗BSEP单克隆抗体1:1000(Santa，美国)；兔源抗Na/K ATPase单克隆抗体1:3000(Abcam，美国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥，北京)；Western blot显色液(Millipore，USA)；脱脂牛奶(BD，美国)。

为了方便理解本发明的上述技术方案，以下通过具体使用方式上对本发明的技术方案进行详细说明。

ABCB11基因突变Y472C，I669V和D1131V的生物信息学分析

ABCB11基因错义突变c.1415A>G(p.Y472C)，导致BSEP编码氨基酸序列第472位由亲水性酪氨酸(Tyr)突变为疏水性半胱氨酸(Cys)，运用Pymol软件模拟BSEP蛋白的三维结构，第472位酪氨酸(Y)氢键与第191位天冬氨酸(Asp，D)相连，但突变后的半胱氨酸(C)与天冬氨酸之间无氢键连接。蛋白质保守性分析(http://consurf.tau.ac.il/)显示第191位天冬氨酸为高度保守氨基酸。提示该突变可能导致BSEP蛋白三维构像改变，从而影响BSEP蛋白的稳定性以及蛋白的细胞定位。

错义突变c.2005A>G(I669V)，导致BSEP编码氨基酸序列第669位异亮氨酸突变为缬氨酸。异亮氨酸和缬氨酸同为疏水性氨基酸，运用Pymol软件模拟BSEP蛋白的三维结构，结果显示I669V突变对三维结构氢键连接没有影响。蛋白质保守性分析(http://consurf.tau.ac.il/)显示第669位异亮氨酸为高度保守氨基酸。

错义突变c.3392A>T(p.D1131V)，突变后第1131位由不带电荷天冬氨酸(Asp)突变为带负电荷缬氨酸(Val)。采用Pymol软件模拟BSEP蛋白的三维结构发现第1131位天冬氨酸氢键与第1128位精氨酸(Arg，R)相连，突变后的缬氨酸与精氨酸之间无氢键连接，第1128位精氨酸同样为高度保守氨基酸。提示D1131V同样可能导致BSEP蛋白空间构像改变，影响蛋白稳定性。

实施例1

1、构建BSEP蛋白野生型BSEP^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V重组表达载体

1.1野生型质粒构建

(1)以ABCB11-cDNA为模板，PCR扩增ABCB11片段。

(2)载体双酶切：用XhoI和HindIII将目的载体pEYFP-N1进行双酶切(如图4～5所示，分别为pEYFP-N1质粒图谱及其多克隆位点)，酶切体系如下，

反应条件为37℃，2h。

(3)琼脂糖凝胶电泳：取0.375g琼脂糖粉加入25ml 0.5×TBE缓冲液中微波炉加热至琼脂糖完全溶解，冷却至约50℃，加入2μl GelStain缓慢混匀后，倒入制胶槽中，待30min完全凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中，加入适量0.5×TBE缓冲液，取PCR产物、双酶切后产物加入适量10×loading buffer后加样至样品孔中，调节电压120V进行电泳，约30min后样品电泳至胶的上2/3位置后，关掉电源，在紫外透射仪下观察电泳结果。

(4)胶回收：在紫外光下切下4.0kb PCR产物片段和4.7kb大小的pEYFP-N1载体的凝胶条带，用Omega Gel Extraction Kit进行胶回收，按照说明书，胶回收20μl，回收步骤如下：

a.提前称好1.5ml离心管重量，切胶放入1.5ml离心管中，称重，按胶重量1g/ml比例加入xp2buffer；

b.55℃水浴7min，直至胶完全融化，期间颠倒混匀数次，取出涡旋离心管3min；

c.将柱子套在2ml收集管中，将胶溶液加入到柱中，10000g室温离心1min，弃液；

d.加入300μl xp2buffer，10000g室温离心1min，弃液；

e.加入700μl spw wash buffer，10000g室温离心1min，弃液，重复一次；

f.>13000g室温空离柱子2min，干燥柱子；

g.柱子放入新的1.5ml离心管中，加入20μl Elution buffer至柱子中央，静置2min，10000g室温离心1min，洗脱出DNA，待检测完浓度及纯度后，保存在-20℃。

(5)连接：在冰水浴中配制下述反应体系，反应条件为37℃30min，反应结束后冰水浴中冷却5min。

(6)转化：

a.取上述连接产物20μl加入到200μl感受态细胞DH5α，混匀后冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰浴3min；

b.将混合物全部加入到900μl无抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌60min；

c.取50mg/ml的X-gal和25mg/ml的IPTG各50μl混匀后均匀涂布含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃正置60min至液体完全吸收；

d.将摇菌后的菌液12000rpm/s离心1min后，弃上清，用无抗LB液体培养基100μl重悬后均匀涂布在上述准备好的含有卡那霉素、X-gal、IPTG的LB固体培养基平板上；

e.37℃正置培养基直至菌液吸收完全后，37℃倒置培养过夜；

(7)重组质粒pEYFP-N1-ABCB11的筛选和鉴定

a.从长有单克隆的固体培养基平板上每个样本各随机挑选5个白色菌落，接种在1ml含有50mg/ml卡那霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌过夜；

b.每份菌液取500μl送华大基因科技公司测序，余下放在4℃保存，等待测序结果；

c.挑选测序正确的菌液转接到5ml新的卡那霉素抗性的LB液体培养基中37℃，200rpm摇菌过夜，加入灭菌甘油至15％后分装保存在-80℃。

1.2突变质粒构建

(1)点突变引物设计见下表。

(2)以新鲜提质粒野生型DNA为模板，进行目标质粒扩增，体系及反应条件如下：

PCR反应条件

(3)扩增产物Dpnl消化，体系如下：

轻轻吹打混匀后，置于37℃恒温2h。

(4)重组反应体系：

吹打混匀(避免产生气泡)，37℃反应30min后立即置于冰水浴中冷却5min，然后进行反应产物转化、涂板、克隆鉴定，步骤同1.1。

2、体外HEK293细胞过表达野生型BSEP^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V重组表达载体

复苏HEK293细胞后，接种2×10⁵个细胞至6孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂条件下培养细胞至密度接近60％时，换用无血清Opti-MEM培养基进行质粒转染。按照转染试剂推荐操作流程，取125μl Opti-MEM与7.5μl Lipo3000混匀，再取125μl Opti-MEM培养基与2.5μg空载pEYFP-N1质粒、野生型BSEP ^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V重组表达载体及5μl P3000混匀，将上述两管混合物混匀后室温条件下孵育20分钟。将250μl复合物加入至各孔中，37℃，5％CO₂条件下培养4小时后，更换完全培养基(含10％FBS的DMEM)。37℃，5％CO₂培养48h后，予收集细胞进行后续的western blot、免疫荧光检测。收集各孔细胞，提取细胞膜总蛋白后，通过western blot检测BSEP的蛋白表达，结果发现BSEP^Y472C、BSEP^I669V和BSEP^D1131V突变型BSEP蛋白表达较野生型明显下降(如图1所示)。

实施例2VX-809对体外HEK293细胞过表达的野生型BSEP ^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V的影响

设置药物浓度梯度：转染24小时后，弃去完全培养基(含10％FBS的DMEM)，换用2ml无血清DMEM培养基，每孔中分别加入0,1μl,2μl,3μl,4μl,8μl的10umol VX-809母液，使每孔药物工作液浓度分别为0，5umol，10umol,15umol,20umol,40umol。置于37℃，5％CO₂条件下培养24小时后终止培养，收集细胞进行后续的Western Blot检测。实验结果显示VX-809可显著增加HEK293细胞中野生型BSEP的膜表达，呈浓度梯度依赖性(见图2A)。

设置药物时间梯度：每孔分别在转染0,12h,24h,36h后，弃去完全培养基(含10％FBS的DMEM)，换用2ml无血清DMEM培养基，加入4μl VX-809母液，药物工作液浓度为15umol，每孔药物作用时间分别为0,12h,24h,36h,48h，并在转染48小时后一起终止培养，收集细胞进行后续的Western Blot检测。实验结果显示VX-809可显著增加HEK293细胞中野生型BSEP的表达，呈时间梯度依赖性(见图2B)。

根据上述浓度梯度和时间梯度结果，选择最佳药物浓度和处理时间为1515umol和24小时。BSEP蛋白野生型BSEP ^WT及突变型BSEP^Y472C、BSEP^I669V、BSEP^D1131V重组表达质粒，按照上述实施例1方法转染HEK293细胞后，给予15umol浓度VX-809刺激24小时，提取细胞膜总蛋白后，通过western blot检测BSEP的蛋白表达，结果发现给药组野生型、Y472C、I669V和D1131V突变型BSEP蛋白表达较未处理组明显上调(如图3所示)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.化合物VX-809或其药学上可接受的盐在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，其特征在于，所述化合物VX-809的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述进行性家族性肝内胆汁淤积症包括PFIC1、PFIC2或PFIC3。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高进行性家族性肝内胆汁淤积症相关基因的表达水平；

或提高进行性家族性肝内胆汁淤积症相关基因的蛋白表达水平。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2相关基因的转录水平。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2相关基因的蛋白表达水平。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2患儿中ABCB11基因的转录水平。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2患儿所携带的BSEP的蛋白表达水平。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述VX-809或其药学上可接受的盐提高PFIC2患儿所携带的BSEP蛋白突变体Y472C、I669V和D1131V的表达水平。

9.组合物在制备治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括化合物VX-809或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述组合物进一步包含粘液溶解剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂或营养剂；

所述组合物还包含顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白抑制剂、齐墩果酸或熊去氧胆酸。