CN110507640A - 4-苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter综合征药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了4‑苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter综合征的药物中的应用。本发明能增加NKCC2突变体L463S、L479V的膜蛋白表达，改善突变体蛋白的构象稳定性，从而提高加工和运输成熟蛋白至细胞表面，最终提高转运体的功能，特别适用治疗由SLC12A1基因突变所致的I型Bartter综合征。

Description

4-苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter综合征药物中的应用

技术领域

本发明涉及化学医药领域。具体涉及4-苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter 综合征药物中的应用，特别是制备治疗由SLC12A1基因突变所致的I型Bartter 综合征药物中的应用。

背景技术

Bartter综合征(Bartter Syndrome,BS)是一组临床表现为低钾代谢性碱中 毒、肾素血管紧张素-醛固酮系统激活、血压正常或偏低为特点的遗传性肾小管 性疾病，遗传方式主要为常染色体隐性遗传。随着近代分子生物学技术的发展， 至少有6个突变基因被证实是Bartter综合征的致病基因，根据这些致病基因不 同，Bartter综合征从分子遗传学角度又可分为6个亚型，即Ⅰ-Ⅴ型Bartter综合 征和Gitelman综合征。其中I型Bartter综合征在临床上属于新生儿Bartter综合 征(OMIM,#601678)，一般在婴儿期发病，因在髓袢升支粗段肾小管上皮细胞 管腔膜上表达的K⁺-Na⁺-2Cl共同转运体NKCC2蛋白功能缺失所致。I型Bartter 综合征患儿多早产，出生后可见低钾血症、低氯血症、代谢性碱中毒，若不及 时诊治，新生儿期有可能死于酸碱紊乱和重度脱水。因此，新生儿型Bartter综 合征相关SLC21A1基因突变检测及基因突变功能研究是其早期诊断、早期治疗 的关键，应该得到足够的重视。

SLC12A1基因缺陷属于先天性遗传疾病，目前治疗手段尚无法治愈，只能 采取对症支持治疗，重点在于降低尿钙水平和预防肾结石形成，但患者多在成 年期出现肾脏钙化及肾结石，部分患者出现进行性肾功能衰竭，严重影响患者 的生活质量。如不正确治疗可能会导致严重电解质紊乱、感染、生长发育迟滞、 肾功能不全甚至危及生命。因此开发新的药物治疗新生儿型Bartter综合征，改 善患儿的健康非常必要。

近年来的研究显示对遗传性疾病致病基因突变进行功能研究，通过化学分 子伴侣类药物使滞留于内质网的突变蛋白恢复构象和膜定位是目前遗传病治疗 的新方法。囊性纤维化是由于囊性纤维化跨膜调节基因(CFTR基因)突变引起 的一种严重遗传性疾病，2015年美国FDA批准了Orkambi新药用于治疗囊性 纤维化F508del突变型患者。F508del突变的结果可引起蛋白质错误折叠，造成 细胞的加工和运输缺陷，引起目标蛋白降解，减少细胞表面CFTR的数量。 Orkambi可改善F508del CFTR的构象稳定性，从而提高加工和运输成熟蛋白至 细胞表面。进行性家族性肝内胆汁淤积症2型是一种常染色体隐性遗传病，由编码胆盐输出泵蛋白(BSEP)的ABCB11基因突变引起的，BSEP蛋白表达于 肝细胞的胆管膜上。Gonzales E等发现四例错义突变致病的PFIC2患儿是由于 突变的BSEP蛋白错误定位，肝细胞胆管膜上并没有检测到BSEP蛋白的表达， 给予四名患儿维持原口服药UDCA和利福平剂量不变的同时，采取口服分子伴 侣类药物4-苯基丁酸钠盐(4-PBA)150-250mg/kg/d进行治疗，发现4-PBA可以 增加患儿肝细胞胆管膜上BSEP的表达，部分性地纠正BSEP定位。

4-苯基丁酸钠盐(4-PBA)，化合物分子式：C₁₀H₁₁NaO₂，结构式如下：

Norihiko Yokoi等的体外和体内实验结果显示4-PBA对于由LGI1基因内质 网滞留型突变引起的家族性颞叶外侧癫痫有治疗作用。但是目前对于4-PBA治 疗I型Bartter综合征还未有报导。

发明内容

本发明提供了4-苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter综合征的药物中的应 用。所述的I型Bartter综合征是由SLC12A1基因突变导致的。

本发明表明4-苯基丁酸钠盐可以显著提高I型Bartter综合征患儿所携带的NKCC2蛋白突变体L463S、L479V成熟型NKCC2的膜表达且促进L479V转运 至膜，显著增强L463S、L479VNa⁺转运活性，提供了4-苯基丁酸钠盐在制备治 疗由L463S、L479V突变所致的I型Bartter综合征药物中的新用途。因此，4- 苯基丁酸钠盐适合用于制备增加NKCC2突变体L463S、L479V的膜蛋白表达， 改善突变体蛋白的构象稳定性的药物。

本发明所述的4-PBA化合物(Lumacaftor)是一种囊性纤维化跨膜传导调 节剂(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)。CFTR蛋白是 一种存在于多种器官的上皮细胞表面氯离子通道。2015年，美国FDA批准4- PBA与VX-770(ivacaftor)的复方药物用于≥12岁携带F508del突变的囊性纤 维化(CF)患儿。F508del突变的结果可引起CFTR蛋白质错误折叠，造成细 胞的加工和运输缺陷，引起目标蛋白降解，减少细胞表面CFTR的数量。

本发明涉及生化医药技术领域，主要提供4-PBA在制备治疗新生儿型 Bartter综合征中的应用。该应用通过化合物4-PBA可以显著提高新生儿型 Bartter综合征患儿所携带的NKCC2蛋白突变体L463S、L479V成熟型NKCC2 的表达水平，实现制备治疗由L463S、L479V突变所致的新生儿型Bartter综合 征的药物的新用途。意图为治疗新生儿型Bartter综合征，尤其是治疗新生儿型 Bartter综合征提供一种新的思路，拓展治疗新生儿型Bartter综合征的前景。

因此，4-PBA化合物治疗经典型Bartter综合征作用机制为：增加NKCC2 突变体L463S、L479V的膜蛋白表达，改善突变体蛋白的构象稳定性，从而提 高加工和运输成熟蛋白至细胞表面，最终提高转运体的功能。

附图说明

图1为pcDNA3.1-3xFlag质粒图谱。

图2.为野生型NKCC2^WT及NKCC2^Leu463Ser、NKCC^2Leu479Val突变型NKCC2总蛋白 及膜蛋白的表达图。

图3.为野生型NKCC2^WT及NKCC2^Leu463Ser、NKCC^2Leu479Val突变型NKCC2蛋白 定位图。

图4.为野生型NKCC2^WT及NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val突变型NKCC2摄取 荧光Na⁺的活性图。

图5.为4-PBA处理后野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2蛋白显著上调。

图6. 4-PBA处理后促进NKCC2^Leu479Val转运至膜。

图7. 4-PBA处理后显著上调野生型NKCC2^WT及NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val突变型NKCC2摄取荧光Na⁺的活性。

具体实施方式

为了方便理解本发明的上述技术方案，以下通过具体使用方式上对本发明 的技术方案进行详细说明：

实验试剂及材料

(1)细胞：人胚肾上皮细胞(293T细胞)由上海生命科学研究院提供。

(2)药物：4-PBA购自美国MCE公司。

(3)重组表达载体构建：表达载体pcDNA-3.1-SLC12A1-3xFlag由长沙优宝生 物合成构建。定点突变试剂盒Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2、PCR扩增 试剂盒LAmp DNA Polymerase、化学感受态细胞DH5α均购自南京诺唯赞公司。

(4)细胞培养及转染：DMEM、FBS、0.25％Trypsin-EDTA(1×)、1×PBS、Penicillin-Streptomycin Liquid(Gibco，美国)；DMSO(Sigma，美国)；Polyjet。

(5)蛋白提取及浓度测定：RIPA裂解液(强)、蛋白酶抑制剂(PMSF)、 BCA蛋白定量试剂盒、膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(凯基，南京)；表面生 物素化试剂盒(Thermo)

(6)Western-blot：Tris-base、SDS、甘氨酸(国药集团化学试剂有限公司)； 甲醇、Tween-20(上海九亿化学试剂有限公司，上海)；SDS-PAGE凝胶配置试 剂盒、5×LoadingBuffer(碧云天，上海)；蛋白Maker-PageRuler-Prestained Protein Ladder(Thermo，美国)；鼠源抗Flag单克隆抗体1:3000(Sigma，美 国)；兔源抗Na⁺-K⁺-ATPase单克隆抗体1:3000(Abcam，美国)；辣根过氧化 物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG (中杉金桥，北京)；Western Blot显色液(Millipore，USA)；脱脂牛奶(BD，美国)。

(7)SBFI AM Na⁺活性检测：SBFI-AM(sigma，美国)；Pluronic F(sigma， 美国)；ouabain(MCE，美国)；Triamterene(MCE，美国)；Hydrochlorothiazide (MCE，美国)；Na-gluconate(sigma，美国)；Ca²⁺-gluconate(sigma，美国)； Mg²⁺gluconate(sigma，美国)；HEPES(Gibco，美国)

实施例1

1、构建NKCC2蛋白野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^L463S、 NKCC2^L479V重组表达载体

由长沙优宝公司合成SLC12A1-cDNA模板，同时用XhoI和BamhI将目的 载体pcDNA-3.1-3xFlag进行双酶切(如图1所示，分别为pcDNA3.1-3xFlag质 粒图谱及其多克隆位点)，酶切体系如下：

反应条件为37℃，2h。

(3)琼脂糖凝胶电泳：取0.375g琼脂糖粉加入25ml 0.5×TBE缓冲液中微波炉 加热至琼脂糖完全溶解，冷却至约50℃，加入2μl GelStain缓慢混匀后，倒入 制胶槽中，待30min完全凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中，加入适量0.5× TBE缓冲液，取PCR产物、双酶切后产物加入适量10×loading buffer后加样至 样品孔中，调节电压120V进行电泳，约30min后样品电泳至胶的上2/3位置后， 关掉电源，在紫外透射仪下观察电泳结果。

(4)胶回收：在紫外光下切下4.0kb PCR产物片段和4.7kb大小的pcDNA3.1-3xFlag载体的凝胶条带，用Omega Gel Extraction Kit进行胶回收，按照说明书， 胶回收20μl，回收步骤如下：

a.提前称好1.5ml离心管重量，切胶放入1.5ml离心管中，称重，按胶重量 1g/ml比例加入xp2 buffer；

b.55℃水浴7min，直至胶完全融化，期间颠倒混匀数次，取出涡旋离心管 3min；

c.将柱子套在2ml收集管中，将胶溶液加入到柱中，10000g室温离心1min， 弃液；

d.加入300μl xp2 buffer，10000g室温离心1min，弃液；

e.加入700μl spw wash buffer，10000g室温离心1min，弃液，重复一次；

f.13000g室温空离柱子2min，干燥柱子；

g.柱子放入新的1.5ml离心管中，加入20μl Elution buffer至柱子中央，静置2min，10000g室温离心1min，洗脱出DNA，待检测完浓度及纯度后，保存在- 20℃。

(5)连接：在冰水浴中配制下述反应体系，反应条件为37℃30min，反应结束 后冰水浴中冷却5min。

(6)转化：

a.取上述连接产物20μl加入到200μl感受态细胞DH5α，混匀后冰浴30min， 42℃水浴热激90s，冰浴3min；

b.将混合物全部加入到900μl无抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm摇 菌60min；

c.取50mg/ml的X-gal和25mg/ml的IPTG各50μl混匀后均匀涂布含有 50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃正置60min至液体完全吸收；

d.将摇菌后的菌液12000rpm/s离心1min后，弃上清，用无抗LB液体培养基 100μl重悬后均匀涂布在上述准备好的含有卡那霉素、X-gal、IPTG的LB固体 培养基平板上；

e.37℃正置培养基直至菌液吸收完全后，37℃倒置培养过夜；

(7)重组质粒pcDNA-3.1-SLC12A1-3xFlag的筛选和鉴定

a.从长有单克隆的固体培养基平板上每个样本各随机挑选5个白色菌落，接 种在1ml含有50mg/ml卡那霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌过夜；

b.每份菌液取500μl送华大基因科技公司测序，余下放在4℃保存，等待测序结果；

c.挑选测序正确的菌液转接到5ml新的卡那霉素抗性的LB液体培养基中 37℃，200rpm摇菌过夜，加入灭菌甘油至15％后分装保存在-80℃。

突变质粒构建

(1)Leu463Ser、Leu479Val点突变引物设计如下：

Leu463Ser：F:GTcGGGCTATGACTTCTCAAGATGTCGACATG

R:AGAAGTCATAGCCCgACCCACATGCTGCTGAACCA

Leu479Val：F:AGTACGGGgTGATGAACAATTTCCAGGTCATGA

R:GTTCATCAcCCCGTACTGACATGGTTCATGTC

(2)以新鲜提取野生型质粒DNA为模板，进行目标质粒扩增，体系及反应条 件如下：

PCR反应条件：

(3)扩增产物Dpnl消化，体系如下：

轻轻吹打混匀后，置于37℃恒温2h。

(4)重组反应体系：

吹打混匀(避免产生气泡)，37℃反应30min后立即置于冰水浴中冷却5min，然后进行反应产物转化、涂板、克隆鉴定，步骤同1.1。

2、HEK293细胞培养及转染野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val重组表达载体

复苏HEK293细胞后，接种2×10⁵个细胞至6孔细胞培养板中，37℃，5％ CO₂条件下培养细胞至密度接近60％时，换用无血清DMEM培养基进行质粒转 染。按照转染试剂推荐操作流程，取100μl DMEM与7.5μlPolyjet转染试剂混匀， 再取100μl DMEM培养基与2.5μg空载pcDNA-3.1-3xFlag质粒、野生型 NKCC2^WT及突变型NKCC2^L463S、NKCC2^L479V重组表达载体分别混匀，将上述 两管混合物混匀后室温条件下孵育15分钟。将200μl混合物加入至各培养孔中， 37℃，5％CO₂条件下培养4小时后，更换完全培养基(含10％FBS的 DMEM)。37℃，5％CO₂培养48h后，予收集细胞进行后续的实验。

3、突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val对NKCC2蛋白表达的影响

(1)提取总蛋白

质粒转染48小时后弃去孔内培养基，轻柔地用PBS洗2次细胞，弃去 PBS；将20μl的蛋白酶抑制剂PI加入1ml的细胞裂解液RIPA内，涡旋混匀， 每个孔内加入100μl的混匀液裂解细胞(如为六孔板)；取塑料刮板，用单蒸 水冲洗后甩干，分别刮取每个孔内的细胞，置于冰上裂解30min；将细胞裂解 液吸入小管内，4℃离心机，12000rpm离心20min，吸取上清液于新的1.5ml EP 管。

(2)提取膜蛋白(生物素标记)：

1.准备四个T75 cm²培养瓶，培养瓶中细胞融合率达到90-95％。弃掉培养基， 每个培养瓶用8ml预冷PBS冲洗细胞两次。快速弃掉PBS。

2.将一小瓶硫磺NHS-SS生物素溶于48ml预冷PBS中。每个T75培养瓶中加 入10毫升生物素溶液，培养瓶放到摇床上，在4℃下轻轻摇晃30分钟。

3.向每个T75培养瓶中添加500微升终止溶液终止反应。轻轻地前后倾斜培养 瓶，以确保完全覆盖细胞。轻轻地将细胞刮入溶液中，并将培养瓶中的细胞转 移到单个50ml离心管。每个培养瓶加入10mlTBS冲洗，冲洗液全部转移至 50ml离心管。

4.500×g离心细胞3分钟，丢弃上清液。向细胞沉淀中加入5mlTBS，轻轻吹 打两次。500×g离心3分钟，并丢弃上清液。

5.将500μl(提前添加蛋白酶抑制剂PI)Lysis Buffer。将溶解溶液中的细胞转 移到1.5ml EP管。轻轻吹打悬浮细胞，使用低功率超声在冰上用1秒5次的超 声来破碎细胞。

6.冰上孵育细胞30分钟，每5分钟旋涡5秒。孵育期间也可进行超声增加细 胞破碎程度。10000×g,4℃，细胞裂解液离心2分钟，将上清液转移到新的EP 管中。

7.将离心柱放入收集管，轻轻地摇晃NeutrAvidin Agarose瓶使其均匀悬浮液。加入500μlNeutrAvidin Agarose进离心柱并盖上盖子。

8.1000×g，离心1min，弃收集管中液体。将500μl的Wash Buffer加入凝胶中，1000×g，离心1min。重复此步骤两次。

9.打开管盖，将细胞裂解液加入到凝胶中，合上管盖。在室温下缓慢摇动孵育 60min。

10.移除顶部盖，然后从柱上拆下底部盖。将离心柱放在收集管中，然后更换 顶盖。1000×g，离心1min，并丢弃离心废液。

11.2.5 ml Wash Buffer中加入蛋白酶抑制剂，将离心柱放回收集管，加500μlWash Buffer，1000×g，离心1min。丢弃冲洗液并取下顶盖。重复此步骤三次。

12.50μl超纯水溶解DTT，浓度为1M DTT，将23.7μlDTT溶液加入450μl SDS-PAGE样品缓冲液中，使最终浓度为50mM DTT。

13.将含有DTT的样品缓冲液加入400μl的凝胶中，盖上盖子。室温缓慢摇晃 孵育1小时或者，将离心柱放置在新的收集管中，并在95℃的加热块中加热5 分钟。确保底部盖子盖紧了。加热会导致洗脱液中一些中性粒蛋白单体(15K) 的回收。单体在室温下进行洗脱时不会释放。

14.先拆下柱上盖，然后拆下柱下盖。将离心柱放在新的收集管中并更换顶盖，1000×g，离心2min。

15.在洗脱液中加入微量溴酚蓝，用免疫印迹法进行分析。如果不使用，将样 品立即保存在-20℃

蛋白浓度测定：

使用BCA法测定蛋白浓度：预先在每个1.5ml的EP小管内加入18μl的PBS、 2μl的蛋白样品(上述步骤中的少量上清液)、A液200μl和B液4μl(A液：B 液＝5:1)，吹打混匀后(注意不要有气泡)将不同蛋白分别加入96孔板，放入 37℃烘箱静置30min，取出后酶标仪600nm检测吸光度，依照标准曲线计算得 出蛋白浓度。

(3)Western Blot检测

Western Blot检测NKCC2总蛋白表达，结果发现NKCC2^WT、NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val均为成熟型(～170KD)、非成熟型(～130KD)两条带， NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val突变型NKCC2总蛋白较野生型降低，其中 NKCC2^Leu479Val与野生型相比具有显著性差异，仅有60％的NKCC2蛋白表达 (见图2A)。Western Blot检测NKCC2膜蛋白结果表明NKCC2^Leu463Ser、 NKCC2^Leu479Val突变型显著降低了成熟型NKCC2蛋白的表达，与野生型相比NKCC2^Leu463Ser降低了29％，NKCC2^Leu479Val降低了72％(见图2B)

4、突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val对NKCC2蛋白定位的影响

免疫荧光：

野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val质粒转染HEK239 细胞，转染48小时后，Flag抗体与细胞膜Marker(Na⁺/K⁺ATPase)共孵育，激 光共聚焦显微镜观察NKCC2-Flag蛋白的荧光表达和亚细胞定位情况。免疫荧 光结果表明NKCC2^Leu463Ser不影响蛋白定位在细胞膜上，NKCC2^Leu479Val突变影响 蛋白的膜定位(图3)。

5、突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val对NKCC2 Na⁺离子摄取活性的影响 SBFI AMNa⁺离子摄取实验：

复苏HEK293细胞后，接种至96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂条件下 培养细胞至密度接近60％时，换用无血清DMEM培养基进行质粒转染。按照 转染试剂推荐操作流程，每孔转染0.1μg空载pcDNA-3.1-3xFlag质粒、野生型 NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val重组表达载体分别混匀，将上 述两管混合物混匀后室温条件下孵育15分钟。将200μl混合物加入至各培养孔 中，37℃，5％CO₂条件下培养4小时后，更换完全培养基(含10％FBS的 DMEM)。转染48h后，将HEK293细胞用不含K⁺和Cl^-的培养基孵育3h，以 清除细胞内氯离子，培养液中加入抑制剂(1mM ouabain；100uM Thiazines； 100uM Methotrexate)。将SBFI-AM(终浓度5-10um)与Pluronic F-127(25％ w/v)1:1配成工作液，溶剂使用不含钾离子的培养基，37℃孵育1-2小时；PBS 洗3次，孵育30min，上机，检测激发光比值340nm/380nm，发射波长500nm。 [Na⁺]＝Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Kd：解离常数(当体系内含生理浓度K⁺/Na⁺ (～135mM)Kd为11.3mM；当不存在K⁺体系，对Na⁺的Kd为3.8mM)Fmin 是无钠时的荧光值，Fmax是钠离子饱和时释放出的荧光值。

Na⁺离子摄取实验表明：NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val显著影响转运蛋白对Na⁺摄取的活性，NKCC2^Leu463Ser与野生型相比活性降低了65％，NKCC2^Leu479Val与野 生型相比活性降低了50％(见图4)。

实施例2

1、4-PBA对野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val蛋 白表达的影响

转染24小时后，弃去完全培养基(含10％FBS的DMEM)，换用2ml 无血清DMEM培养基，每孔中加入20μl的100 mM4-PBA，使每孔药物终浓度 为1mM。置于37℃，5％CO₂条件下培养24小时后终止培养，收集细胞进行后 续的Western Blot检测。实验结果显示。4-PBA可显著增加HEK293细胞中野 生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val成熟型NKCC2蛋白的表 达，分别为2.04、2.43、2.35倍(见图5)。

2、4-PBA促进NKCC2^Leu479Val蛋白转运至膜

野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val质粒转染HEK239 细胞，转染48小时后，Flag抗体与细胞膜Marker(Na⁺/K⁺ATPase)共孵育，激光 共聚焦显微镜观察NKCC2-Flag蛋白的荧光表达和亚细胞定位情况。结果表明4- PBA可以促进NKCC2^Leu479Val蛋白定位在细胞膜上(见图6)。

3、4-PBA增强野生型NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val Na⁺离子摄取活性

Na⁺离子摄取活性实验参照实施例1，结果表明1mM 4-PBA处理24小时后 可以显著增强NKCC2^WT及突变型NKCC2^Leu463Ser、NKCC2^Leu479Val对荧光Na⁺离 子摄取的活性(见图7)，分别为4.77、4.5、5.01倍。

Claims (3)

1.4-苯基丁酸钠盐在制备治疗I型Bartter综合征的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的I型Bartter综合征，其特征在于I型Bartter综合征是由SLC12A1基因突变导致。

3.4-苯基丁酸钠盐在制备增加NKCC2突变体L463S、L479V的膜蛋白表达，改善突变体蛋白的构象稳定性的药物中的应用。