JP2005519856A - 骨折を予防または治療するためのl−トレオン酸カルシウム - Google Patents
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Abstract
本発明は、骨折を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウム化合物、同化合物を含む組成物、および同化合物の使用に関する。実験から、L-トレオン酸カルシウムは、骨芽細胞の増殖、分化、および鉱質化を増進させることができるだけでなく、インビトロで培養した骨芽細胞のコラーゲンI mRNAの発現を増進させることもできることが見出された。したがって、L-トレオン酸カルシウムは、骨折を予防または治療するために、骨折治癒を促進し、骨密度および機械的性能を増加させた。
Description
発明の分野
本発明は、骨折を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウム(calcium L-threonate)化合物に関し、特に、外傷性破損もしくは病理学的破損を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウム化合物、同化合物を含む組成物、および同化合物の使用に関する。
本発明は、骨折を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウム(calcium L-threonate)化合物に関し、特に、外傷性破損もしくは病理学的破損を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウム化合物、同化合物を含む組成物、および同化合物の使用に関する。
発明の背景
骨折とは、骨の構造的連続性が崩壊することであり、一般的な外科的疾患である。骨折は、外傷性破損と病理学的破損とに分類することができる。外傷性破損は外力によって引き起こされるものであり、病理学的破損は、骨へのある程度の外力に伴い、老年性骨粗鬆症などの骨自身の病理学的変化によって起こるものである。
骨折とは、骨の構造的連続性が崩壊することであり、一般的な外科的疾患である。骨折は、外傷性破損と病理学的破損とに分類することができる。外傷性破損は外力によって引き起こされるものであり、病理学的破損は、骨へのある程度の外力に伴い、老年性骨粗鬆症などの骨自身の病理学的変化によって起こるものである。
慣例的に、骨折治癒は4つの段階に分類される:1)炎症、2)軟仮骨、3)硬仮骨、および4)再成形。炎症段階は、骨折に続く迅速な応答である。このとき、破損部位および近隣組織に血腫が生じ、血管拡張と血漿および白血球の滲出とにより示される急性炎症応答が即座に起こる。軟仮骨段階は、腫脹および疼痛の消失から破損部位で線維すなわち軟骨組織が連結するまでの期間であり、この間に、血腫は片付けられ、残った壊死骨を破骨細胞が除去し、膜内骨化が始まる。血管が著しく増加し、毛細管が仮骨に入り込み、細胞が非常に豊富になることがその特徴である。硬仮骨段階は、破損部位における軟仮骨の癒合から新しい骨の形成までの期間である。この段階は、臨床またはX線表示において骨折治癒の期間に相当する。これには通常3〜4ヶ月かかり、この間に、仮骨は線維軟骨組織から線維性の骨に変わり、膜性の骨が破損部位間に形成される。再成形段階は、破損部位が新たに生じた骨により連結され、徐々に新たな機能に順応する工程である。
骨折治癒は、非常にユニークな工程の組織修復プログラムである。他の組織の修復は結果として瘢痕化するが、骨修復は瘢痕化ではなく骨の再生によるものであり、他の組織の修復とは異なる。したがって、骨芽細胞の増殖は、骨折治癒において重要な役割を果たす。
また、レーン(Lane)は、生化学的観点から骨折治癒を分類した:1)コラーゲンI、II、およびIIIが合成される間葉段階;2)コラーゲンIIが優勢な軟骨段階;3)コラーゲンIおよびIIが優勢な軟骨・類骨段階;4)コラーゲンIが優勢な骨形成段階。このように、コラーゲンの合成は、骨折治癒において非常に重要な役割を果たしている。
現在、従来のカルシウム製剤は骨折治癒を増進させる有意な効果はないと一般的に考えられている。また、骨折治癒を有意に増進させることができる他の薬剤は未だ見つかっていない。骨折の主な治療は今だなお、以下の3つの慣例的な手段を組み合わせたものである:1)骨折の修復;2)固定;3)機能的運動。
それゆえ、本発明は、骨折に罹患した被験者に有効量のL-トレオン酸カルシウムを投与する工程を含む、骨折を予防または治療するための方法を提供することを目的とする。
本発明のもう1つの目的は、有効量のL-トレオン酸カルシウムを含む、骨折を予防または治療するための薬学的組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、骨折を治療または予防するための薬学的組成物の調製におけるL-トレオン酸カルシウムの使用を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、骨折を予防または治療するために用いることができるL-トレオン酸カルシウムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、骨折を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウムの使用を提供することである。
骨折治癒を促進する上記要素の観点から、本発明者は、骨芽細胞の増殖、分化、および骨形成に対するL-トレオン酸カルシウムの刺激効果、ならびにコラーゲンIの合成増進に対するL-トレオン酸カルシウムの効果について研究した。その結果は、L-トレオン酸カルシウムは骨芽細胞の増殖、分化、および鉱質化を促進することができるだけでなく、インビトロで培養した骨芽細胞においてコラーゲンIのmRNA発現を増強することもできるという驚くべきものである。このように、L-トレオン酸カルシウムは骨折治癒を増進させて骨折を治療することができ、このことにより、本発明者は本発明を完成させた。
一方、上記効果により、L-トレオン酸カルシウムは、骨折、特に老年性骨粗鬆症に起因する破損などの病理学的破損を予防するために、骨密度および機械的特性を増加させることができる。
発明の概要
本発明は、骨折に罹患した被験者に有効量のL-トレオン酸カルシウムを投与する工程を含む、骨折を治療するための方法に関する。
本発明は、骨折に罹患した被験者に有効量のL-トレオン酸カルシウムを投与する工程を含む、骨折を治療するための方法に関する。
本明細書に使用されるように、「骨折」という用語は、これらに限定されないが、外傷性破損および病理学的破損を含む。
本発明はまた、骨折に罹患した被験者に有効量のL-トレオン酸カルシウムを投与する工程を含む、骨折、好ましくは外傷性破損および病理学的破損、より好ましくは外傷性破損を予防するための方法を含む。
本発明はまた、有効量のL-トレオン酸カルシウムを含む、骨折を予防または治療するための薬学的組成物に関する。
本発明はさらに、骨折を治療または予防するための薬学的組成物の調製におけるL-トレオン酸カルシウムの使用を含む。
本発明はなおさらに、骨折を予防または治療するために用いることができるL-トレオン酸カルシウムに関する。
本発明はなおさらに、骨折を予防または治療するためのL-トレオン酸カルシウムの使用を含む。
発明の詳細な説明
本発明のL-トレオン酸カルシウムは、白色粉末でほとんどにおいがなく、水に可溶であるが、アルコール、エーテル、およびクロロホルムには不溶であり、式C8H14O10Caおよび下記式で表される化学構造式を有する:
本発明のL-トレオン酸カルシウムは、白色粉末でほとんどにおいがなく、水に可溶であるが、アルコール、エーテル、およびクロロホルムには不溶であり、式C8H14O10Caおよび下記式で表される化学構造式を有する:
本化合物は以下により調製することができる:一定量のL-アスコルビン酸(Vc)を水に加えて溶解し、炭酸カルシウムをその混合物に攪拌しながらゆっくりと加えた。上記混合物に、過酸化水素を10℃から60℃の間の温度で滴下し、温度を1〜4時間40〜80℃に維持した。活性炭を加えた後、混合物をろ過した。ろ液を30℃から90℃の間の温度で濃縮し、外界温度で結晶化させた。結晶は50℃〜100℃の温度で乾燥させた。
L-トレオン酸カルシウムを調製する上記方法において、炭酸カルシウムの添加は、生じた二酸化炭素ガスがはねることにより容器から内容物があふれでることを避けるために、ごくゆっくりと行わなければならない。
L-トレオン酸カルシウムを調製する上記方法は、活性炭で処理した混合物をろ過して得られるケークを80℃の湯で2回洗浄する操作と、洗浄物およびろ液を合わせたものを濃縮する操作とをさらに含んでもよい。
L-トレオン酸カルシウムを調製する上記方法は、その合理的な手順、簡単な操作、90%程度の高さの良好な収率、および高純度の産物という点で有利である。L-トレオン酸カルシウムの調製方法は、Kai Yuらに対して2000年6月20日に発行された米国特許第6,077,872号(参照として本明細書に組み入れられる)に記載されている。
もちろん、本発明のL-トレオン酸カルシウムは、先行技術において既知の他の方法により調製されてもよい。
本発明のL-トレオン酸カルシウムは、経口的に投与されてもよい。
本発明のL-トレオン酸カルシウムは、薬学的に許容される組成物の錠剤、カプセル、および他の形態などの、様々な形態の製剤において使用されてもよい。
本発明の薬学的組成物は、賦形剤などの先行技術において医薬品に広く用いられている種々の担体でありうる薬学的に許容される担体とともに、一定量のL-トレオン酸カルシウムを有効成分として含む。本発明の薬学的組成物は、混合、ペレット化、および錠剤化などの、当技術分野において既知の方法により調製することができる。
本発明の薬学的組成物は、香料、着色料、および甘味料などの、薬理学において用いることができる他の選択的な成分も含みうる。本発明の好ましい薬学的組成物は、構成成分として、他の賦形剤および選択的な成分とともに、重量で60%、好ましくは80%、より好ましくは90%のL-トレオン酸カルシウムを含む。
L-トレオン酸カルシウムの用量は、患者の年齢により変わりうる。目安としては、成人へのL-トレオン酸カルシウムの用量は、典型的には一日あたり0.5gから12gの間、好ましくは一日あたり3gから7gの間である。小児へは、体重によって用量を減少させることができる。
動物体におけるL-トレオン酸カルシウムの薬物動態学的実験により、ラットにおけるL-トレオン酸カルシウムの吸収代謝はOne-Chamberモデルを満たすことが示された。グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、および炭酸カルシウムなどの他のカルシウム剤のものよりも、L-トレオン酸カルシウムの吸収は比較的ゆっくりとしたものであったが、より完全なものであり、血清カルシウム濃度のピークの到達はより遅く(Tmax=0.79時間)、その半減期はより長かった(T1/2=4.45時間)。L-トレオン酸カルシウムは、より高いレベルで、より長い時間、血清中にとどまることができる。曲線下面積(area under the curve;AUC)は、191.75g/(ml.時間)に等しい。L-トレオン酸カルシウムの薬物動態学試験は、Kai Yuらに対して2000年6月20日に発行された米国特許第6,077,872号(参照として本明細書に組み入れられる)に記載されている。
本発明において、インビトロで培養した骨芽細胞の増殖、分化、および骨形成の刺激に対するL-トレオン酸カルシウムの効果を研究した。本研究の詳細は、下記の実験Iに記載する。
本発明において、OB2のALP活性に対するL-トレオン酸カルシウムの影響も研究した。本研究の詳細は、下記の実験IIに記載する。
以下の実験は、例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
実験I
インビトロで培養した骨芽細胞の増殖、分化、および骨形成の刺激に対するL-トレオン酸カルシウムの効果
骨芽細胞の増殖を促進して骨量を増加させるL-トレオン酸カルシウムの細胞学的基礎を提供するために、本試験により、骨芽細胞をインビトロで培養する方法を用いて、骨芽細胞の骨形成機能の刺激に対するL-トレオン酸カルシウムの効果を研究した。新生児SDラットの頭蓋冠を切除し、骨芽細胞を単離して、細胞濃度1x104/mlで、10wt%のNCS-MEMを含む培養培地に蒔いた。第二世代の二次細胞を薬力学について試験した。結果、濃度10-9〜10-3mol/LのL-トレオン酸カルシウムは骨芽細胞の増殖を増進させる効果を有し;濃度10-3mol/LのL-トレオン酸カルシウムは、細胞活性および鉱質化小結節形成の刺激に対して有意な効果を有し、アルカリホスファターゼ(以下ALPとする)活性および鉱質化小結節形成を増進させる一定の効果を有すことが示された。
インビトロで培養した骨芽細胞の増殖、分化、および骨形成の刺激に対するL-トレオン酸カルシウムの効果
骨芽細胞の増殖を促進して骨量を増加させるL-トレオン酸カルシウムの細胞学的基礎を提供するために、本試験により、骨芽細胞をインビトロで培養する方法を用いて、骨芽細胞の骨形成機能の刺激に対するL-トレオン酸カルシウムの効果を研究した。新生児SDラットの頭蓋冠を切除し、骨芽細胞を単離して、細胞濃度1x104/mlで、10wt%のNCS-MEMを含む培養培地に蒔いた。第二世代の二次細胞を薬力学について試験した。結果、濃度10-9〜10-3mol/LのL-トレオン酸カルシウムは骨芽細胞の増殖を増進させる効果を有し;濃度10-3mol/LのL-トレオン酸カルシウムは、細胞活性および鉱質化小結節形成の刺激に対して有意な効果を有し、アルカリホスファターゼ(以下ALPとする)活性および鉱質化小結節形成を増進させる一定の効果を有すことが示された。
材料および方法
1)サンプリング:新生児(24時間以内)SDラットを殺菌消毒した後、無菌条件下で頭蓋冠を切除した。頭蓋冠をまず0.25%トリプシンで10〜15分間予め消化し、振動させ、そして0.1%コラゲナーゼIIにより37℃で60分間消化した。細胞を1000rpmで遠心分離して回収した。
1)サンプリング:新生児(24時間以内)SDラットを殺菌消毒した後、無菌条件下で頭蓋冠を切除した。頭蓋冠をまず0.25%トリプシンで10〜15分間予め消化し、振動させ、そして0.1%コラゲナーゼIIにより37℃で60分間消化した。細胞を1000rpmで遠心分離して回収した。
2)細胞培養:10%のNCS-MEM培養液が入った培養フラスコに、単離した細胞を濃度1x104/cm2で播種した。細胞を、37℃、5%CO2のインキュベーター中で培養し、半集密(half confluence)まで継続した。第二世代の二次細胞(OB2)を薬力学について試験した。
3)薬品:各試験薬品を濃度0.1mol/Lで調剤し、後の使用のために、高圧で滅菌した。
1.55gのL-トレオン酸カルシウムを50mlの脱イオン水に加熱して溶解した。2.24gのグルコン酸カルシウムを50mlの脱イオン水に室温で溶解した。対照群は脱イオン水であった。
1.55gのL-トレオン酸カルシウムを50mlの脱イオン水に加熱して溶解した。2.24gのグルコン酸カルシウムを50mlの脱イオン水に室温で溶解した。対照群は脱イオン水であった。
4)観察指標
(1)細胞増殖
24ウェルCOSTOR培養プレートに、ウェルあたり密度6x103でOB2を播種した。24時間後、上記培養液を、10-9から10-3mol/Lまでの範囲の様々な濃度の薬品を含む培養液で置換した。薬品添加の72時間後、Labsystems Multiskan MS (Finland))ELISAアナライザーを用いてMTT法により細胞を試験した。570nmにおけるOD値を使用して細胞増殖を表した。結果を対照群のものと比較した。
(1)細胞増殖
24ウェルCOSTOR培養プレートに、ウェルあたり密度6x103でOB2を播種した。24時間後、上記培養液を、10-9から10-3mol/Lまでの範囲の様々な濃度の薬品を含む培養液で置換した。薬品添加の72時間後、Labsystems Multiskan MS (Finland))ELISAアナライザーを用いてMTT法により細胞を試験した。570nmにおけるOD値を使用して細胞増殖を表した。結果を対照群のものと比較した。
(2)ALP活性の決定
24ウェルCOSTOR培養プレートに、ウェルあたり密度2x104でOB2を播種した。24時間後、上記培養液を、薬品を含む培地で置換した。そして、細胞が集密に達するまで、48時間毎に培養液を交換した。細胞ライセートのALP活性を、p-ニトロベンゼンリン酸(para-nitrobenzene phosphate)法により測定した。細胞ライセート中のタンパク質含量をクーマシーブリリアントブルー法により測定した。ALP活性をU/mgタンパク質で表し、結果を対照群のものと比較した。
24ウェルCOSTOR培養プレートに、ウェルあたり密度2x104でOB2を播種した。24時間後、上記培養液を、薬品を含む培地で置換した。そして、細胞が集密に達するまで、48時間毎に培養液を交換した。細胞ライセートのALP活性を、p-ニトロベンゼンリン酸(para-nitrobenzene phosphate)法により測定した。細胞ライセート中のタンパク質含量をクーマシーブリリアントブルー法により測定した。ALP活性をU/mgタンパク質で表し、結果を対照群のものと比較した。
(3)鉱質化機能の決定
6ウェルCOSTOR培養プレートに、ウェルあたり密度5x104でOB2を播種した。24時間後、上記培養液を、薬品を含む培養液で置換した。そして、48時間毎に溶液を交換した。14日後、細胞を固定し、アリザリンレッドで染色した。鉱質化小結節を光学顕微鏡下で計数し、結果を対照群のものと比較した。
6ウェルCOSTOR培養プレートに、ウェルあたり密度5x104でOB2を播種した。24時間後、上記培養液を、薬品を含む培養液で置換した。そして、48時間毎に溶液を交換した。14日後、細胞を固定し、アリザリンレッドで染色した。鉱質化小結節を光学顕微鏡下で計数し、結果を対照群のものと比較した。
結果
1.OB2の増殖に対するL-トレオン酸カルシウムの影響
表1〜3は、薬品が細胞増殖に対して影響を及ぼすことを試験した結果を一覧にしたものである。
1.OB2の増殖に対するL-トレオン酸カルシウムの影響
表1〜3は、薬品が細胞増殖に対して影響を及ぼすことを試験した結果を一覧にしたものである。
(表1)骨芽細胞に対するL-トレオン酸カルシウムおよび他の薬品の影響、試験I(単位濃度:mol/L)
注:n=4、対照群と比較して:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001
同じ濃度のL-トレオン酸カルシウム群と比較して:&P<0.05、#P<0.01
注:n=4、対照群と比較して:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001
同じ濃度のL-トレオン酸カルシウム群と比較して:&P<0.05、#P<0.01
(表2)骨芽細胞に対するL-トレオン酸カルシウムおよび他の薬品の影響、試験II(単位濃度:mol/L)
注:n=4、対照群と比較して:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001
同じ濃度のL-トレオン酸カルシウム群と比較して:&P<0.05、#P<0.01
注:n=4、対照群と比較して:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001
同じ濃度のL-トレオン酸カルシウム群と比較して:&P<0.05、#P<0.01
(表3)骨芽細胞に対するL-トレオン酸カルシウムおよび他の薬品の影響、試験III(単位濃度:mol/L)
注:n=4、対照群と比較して:*P<0.05、**P<0.01
同じ濃度のL-トレオン酸カルシウム群と比較して:&P<0.05、#P<0.01、$P<0.001
注:n=4、対照群と比較して:*P<0.05、**P<0.01
同じ濃度のL-トレオン酸カルシウム群と比較して:&P<0.05、#P<0.01、$P<0.001
表1〜3中のデータにより、これら3つの試験において10-9〜10-3mol/LのL-トレオン酸カルシウム群におけるOB2の増殖率はすべて対照群のものよりも有意に高く、10-3mol/LのL-トレオン酸カルシウム群のOD値が最も高いことが示された。L-トレオン酸カルシウム群におけるOB2のOD値は、グルコン酸カルシウム群のものまたは塩化カルシウム群のものよりも有意に高かった。試験Iおよび試験IIにおけるL-トレオン酸カルシウム群のOB2のOD値は、対照群のものよりも有意に高かった。試験IIIにおいては有意な差は観察されず、ほとんどのL-トレオン酸カルシウム群のOB2のOD値は、グルコン酸カルシウム群および塩化カルシウム群ものと比べて有意な差はなかった。
2.OB2のALP活性に対するL-トレオン酸カルシウムの影響
OB2の増殖結果を参照し、薬品によりOB2のALP活性を刺激する試験を、薬品濃度10-3mol/Lで行った。結果を表4に示す。
OB2の増殖結果を参照し、薬品によりOB2のALP活性を刺激する試験を、薬品濃度10-3mol/Lで行った。結果を表4に示す。
同じ濃度において、L-トレオン酸カルシウム群におけるOB2のALP活性は対照群のものよりも高く、その中でも試験Iおよび試験IIにおける増加は有意であった(P<0.05)。グルコン酸カルシウム群および塩化カルシウム群と比較して、L-トレオン酸カルシウム群におけるOB2のALP活性は増加していたが、その増加は有意ではなかった。
3.OB2の鉱質化機能の刺激に対するL-トレオン酸カルシウムの影響(表5)
表5からわかるように、L-トレオン酸カルシウム群において骨芽細胞により2週間以内に形成された鉱質化小結節の数が最も多く、その増加は有意(P<0.05)であった。
結論:
骨芽細胞は骨形成細胞である。骨再成形工程中、骨芽細胞は増殖および分化し、骨形成に関連するコラーゲンまたは非コラーゲンタンパク質を合成および分泌し、類骨を産生し、類骨の鉱質化を増進させた。新たに形成された骨は破骨細胞の再吸収に起因する骨小腔を修復した。骨芽細胞機能の低下により、新たに形成された骨の量が減少し、骨小腔を修復するその能力が弱まる。結果として、骨小柱が薄く、弱く、穴があいた状態になり、皮質骨が多孔的変化を示す。骨芽細胞に対する骨形成を増進させる薬品の薬力学的評価において、増殖率、ALP活性、および鉱質化小結節は指標として頻繁に用いられた。これら指標はそれぞれ、骨芽細胞の増殖、分化、および鉱質化の能力を示すものであった。したがって、これら指標により、骨芽細胞の骨形成機能に対する薬品の刺激を包括的に評価することができた。
骨芽細胞は骨形成細胞である。骨再成形工程中、骨芽細胞は増殖および分化し、骨形成に関連するコラーゲンまたは非コラーゲンタンパク質を合成および分泌し、類骨を産生し、類骨の鉱質化を増進させた。新たに形成された骨は破骨細胞の再吸収に起因する骨小腔を修復した。骨芽細胞機能の低下により、新たに形成された骨の量が減少し、骨小腔を修復するその能力が弱まる。結果として、骨小柱が薄く、弱く、穴があいた状態になり、皮質骨が多孔的変化を示す。骨芽細胞に対する骨形成を増進させる薬品の薬力学的評価において、増殖率、ALP活性、および鉱質化小結節は指標として頻繁に用いられた。これら指標はそれぞれ、骨芽細胞の増殖、分化、および鉱質化の能力を示すものであった。したがって、これら指標により、骨芽細胞の骨形成機能に対する薬品の刺激を包括的に評価することができた。
上記の結果により以下のことが示された:1)L-トレオン酸カルシウムは、インビトロで培養した骨芽細胞の増殖率、ALP活性、および鉱質化小結節形成に対して有意な刺激効果を有した;2)インビトロで培養した骨芽細胞の増殖率、ALP活性、および鉱質化小結節形成に対するL-トレオン酸カルシウムの刺激効果は、グルコン酸カルシウムまたは塩化カルシウムのものよりも強力であった。
実験II
骨コラーゲンIの合成増進に対するL-トレオン酸カルシウムの効果
本研究により、インビトロで培養した骨芽細胞におけるコラーゲンI(α-COLI)の遺伝子発現に対するL-トレオン酸カルシウムの効果を十分に検討した。
骨コラーゲンIの合成増進に対するL-トレオン酸カルシウムの効果
本研究により、インビトロで培養した骨芽細胞におけるコラーゲンI(α-COLI)の遺伝子発現に対するL-トレオン酸カルシウムの効果を十分に検討した。
材料および方法
1.細胞培養:初代骨芽細胞の培養方法は、前の試験のものと同じであった。OB2を密度1x104細胞/cm2で播種した。継代の次の日に、L-トレオン酸カルシウムおよびグルコン酸カルシウムを同じ濃度(10-3mol/l)でそれぞれ異なる培養フラスコに加え、脱イオン水を同じ容積で対照群に加えた。培養培地を48時間毎に交換し、薬品を加えた。細胞の全RNAを1週間後に抽出した。
1.細胞培養:初代骨芽細胞の培養方法は、前の試験のものと同じであった。OB2を密度1x104細胞/cm2で播種した。継代の次の日に、L-トレオン酸カルシウムおよびグルコン酸カルシウムを同じ濃度(10-3mol/l)でそれぞれ異なる培養フラスコに加え、脱イオン水を同じ容積で対照群に加えた。培養培地を48時間毎に交換し、薬品を加えた。細胞の全RNAを1週間後に抽出した。
2.RNAの抽出:細胞を0.25%トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離して、細胞ペレットを回収した。全RNAをTRIzol試薬(Gibco Co.)法で抽出した。18sおよび28sの2つのバンドを、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動で可視化した。RNAの濃度および純度は、紫外線分光光度計により測定した(A260/A280の値は1.7から2.0の間である)。
3.逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR):Access RT-PCRシステムキット(Promega)を、キットの指示に従って試験に用いた。PCRアナライザー(Bio-Rad Inc.)において、48℃で45分、反応混合物のRT-PCRを行った。酵素を94℃2分で不活性化し、30サイクルのPCR反応を行った:30分94℃の変性、1分54℃のアニーリング、2分72℃の伸長、そして最終サイクルの後、7分72℃のさらなる伸長。9μlのPCR産物を1.5%アガロースゲル電気泳動で解析した。そして、バンドをイメージ解析システム(Image Master VDS)により解析した。光学密度値を内部標準アクチンにより較正し、較正値を統計学的に解析した。
4.薬品:各試験薬品を濃度0.1mol/Lで調剤し、後の使用のために、高圧で滅菌した。
L-トレオン酸カルシウム(Beijing Juneng Asia Pacific Research Center of Life Scienceより入手)1.55gを50mlの脱イオン水に加熱して溶解した。
グルコン酸カルシウム(Shanghai Huanghai Pharmaceutical Factory)2.24gを50mlの脱イオン水に溶解した。
L-トレオン酸カルシウム(Beijing Juneng Asia Pacific Research Center of Life Scienceより入手)1.55gを50mlの脱イオン水に加熱して溶解した。
グルコン酸カルシウム(Shanghai Huanghai Pharmaceutical Factory)2.24gを50mlの脱イオン水に溶解した。
結果
結果を下記表7に示した。定量RT-PCRにより骨芽細胞におけるα-COLIのmRNA発現を試験し、同じ濃度(10-3mol/L)の薬品で、L-トレオン酸カルシウム群におけるmRNAのレベルが、対照群のものと比較して有意に増加する(P<0.05)ことがわかった。この結果により、L-トレオン酸カルシウムが骨芽細胞におけるα-COLIのmRNA発現を増進させうることが示された。グルコン酸カルシウム群と対照群との間のα-COLI mRNAのレベルには、有意な差はなかった。
結果を下記表7に示した。定量RT-PCRにより骨芽細胞におけるα-COLIのmRNA発現を試験し、同じ濃度(10-3mol/L)の薬品で、L-トレオン酸カルシウム群におけるmRNAのレベルが、対照群のものと比較して有意に増加する(P<0.05)ことがわかった。この結果により、L-トレオン酸カルシウムが骨芽細胞におけるα-COLIのmRNA発現を増進させうることが示された。グルコン酸カルシウム群と対照群との間のα-COLI mRNAのレベルには、有意な差はなかった。
結論:
骨折の際の、その増殖、分化、および成熟の工程において、骨芽細胞は、多量のプロコラーゲンIを細胞質中に合成し、それは基質に分泌され、骨コラーゲンの主成分を構成して、骨折の治癒を増進させた。加えて、骨量の内容もまた、骨強度を決定する重要な要素であった。コラーゲンIの分解断片の測定は、骨形成機能を反映する指標の1つとして通常使用されるものであった。したがって、骨折を予防または治療する際に、L-トレオン酸カルシウムが非常に重要であることが示された。α-COLI mRNAのレベルを検出するために本研究において用いた定量RT-PCR法により、α-COLIタンパク質分子の検出よりも正確にOBにおける遺伝子発現を表すことができた。
骨折の際の、その増殖、分化、および成熟の工程において、骨芽細胞は、多量のプロコラーゲンIを細胞質中に合成し、それは基質に分泌され、骨コラーゲンの主成分を構成して、骨折の治癒を増進させた。加えて、骨量の内容もまた、骨強度を決定する重要な要素であった。コラーゲンIの分解断片の測定は、骨形成機能を反映する指標の1つとして通常使用されるものであった。したがって、骨折を予防または治療する際に、L-トレオン酸カルシウムが非常に重要であることが示された。α-COLI mRNAのレベルを検出するために本研究において用いた定量RT-PCR法により、α-COLIタンパク質分子の検出よりも正確にOBにおける遺伝子発現を表すことができた。
過去の薬力学的アッセイ法において、L-トレオン酸カルシウムが、去勢したラットの骨密度、骨カルシウムの含有量、および生体力学的パラメーターを有意に増加させうることが見出されていた。細胞薬力学的試験により、L-トレオン酸カルシウムが、OBの増殖、分化、および鉱質化機能を促進しうることが示された。本研究により、L-トレオン酸カルシウムは、インビトロで培養したOBにおいてα-COLI mRNAのレベルをアップレギュレートすることが見出され、このことは、骨芽細胞の骨形成機能を増強するという細胞薬力学により表される効果に相関する。このことにより、L-トレオン酸カルシウムは、OB中のいくつかの遺伝子の発現を増強して、OBの骨形成機能を増強する可能性があることが示唆された。これは、コラーゲンレベルの検出により、さらに確認できた。
上記試験により、L-トレオン酸カルシウムが、骨芽細胞の増殖、分化、および鉱質化機能を増進できるだけでなく、インビトロで培養した骨芽細胞におけるmRNAプロコラーゲンIの発現を増進させることもできることが示された。これら機能により、L-トレオン酸カルシウムは、骨折治癒を促進することができ、さらに、骨折、特に病理学的破損(老年性骨粗鬆症によって引き起こされるものなど)を予防するために、骨密度および機械的性能を増加させることができた。
Claims (9)
- 骨折を予防または治療するための、L-トレオン酸カルシウム化合物。
- 骨折が外傷性破損または病理学的破損である、請求項1記載の化合物。
- 骨折が外傷性破損である、請求項1記載の化合物。
- 請求項1記載の有効量のL-トレオン酸カルシウムおよび薬学的に許容される担体を含む、骨折を予防または治療するための薬学的組成物。
- 骨折が外傷性破損または病理学的破損である、請求項4記載の組成物。
- 骨折が外傷性破損である、請求項5記載の組成物。
- 骨折を予防または治療するための薬学的組成物の製造における、請求項1記載の化合物の使用。
- 骨折が外傷性破損または病理学的破損である、請求項7記載の使用。
- 骨折が外傷性破損である、請求項8記載の使用。
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