RU2810761C2 - Способ очистки фикоцианинов - Google Patents
Способ очистки фикоцианинов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810761C2 RU2810761C2 RU2021122287A RU2021122287A RU2810761C2 RU 2810761 C2 RU2810761 C2 RU 2810761C2 RU 2021122287 A RU2021122287 A RU 2021122287A RU 2021122287 A RU2021122287 A RU 2021122287A RU 2810761 C2 RU2810761 C2 RU 2810761C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phycocyanin
- glycogen
- activity
- glucosidase
- enzyme
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 claims abstract description 128
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims abstract description 90
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims abstract description 90
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000883968 Galdieria sulphuraria Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 22
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 9
- 241000206585 Cyanidium Species 0.000 claims description 7
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 claims description 5
- 241000084008 Cyanidiales Species 0.000 claims description 3
- 241000190108 Cyanidioschyzon Species 0.000 claims description 3
- 241001646653 Galdieria Species 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 6
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 50
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 10
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 7
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108050008938 Glucoamylases Proteins 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 3
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 241001495180 Arthrospira Species 0.000 description 2
- 241000190106 Cyanidioschyzon merolae Species 0.000 description 2
- 241000206584 Cyanidium caldarium Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193798 Aerococcus Species 0.000 description 1
- 241000186033 Alloiococcus Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000193818 Atopobium Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001134780 Bacillus acidopullulyticus Species 0.000 description 1
- 241000680658 Bacillus deramificans Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000206594 Carnobacterium Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000084003 Cyanidiaceae Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000778176 Galdieria daedala Species 0.000 description 1
- 241000778174 Galdieria maxima Species 0.000 description 1
- 241001646655 Galdieria partita Species 0.000 description 1
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 241001468189 Melissococcus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000202223 Oenococcus Species 0.000 description 1
- 102000001746 Pancreatic alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010029785 Pancreatic alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 244000206963 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 1
- 241000500334 Tetragenococcus Species 0.000 description 1
- 241000207194 Vagococcus Species 0.000 description 1
- 241000202221 Weissella Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000002864 food coloring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- -1 glycogen Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000015096 spirit Nutrition 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности. Предложен способ очистки фикоцианинов, получаемых путем ферментации микроводорослей, в частности продуцируемых Galdieria sulphuraria. Способ включает (i) стадию ферментативного разложения гликогена с помощью фермента, обладающего активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, или ферментативной смеси, содержащей фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, и фермент, обладающий активностью α1-6-глюкозидазы, или фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы и активностью α1-6-глюкозидазы, при рН ниже 6 и температуре реакции ниже 40°С и (ii) стадию отделения фикоцианинов от продуктов разложения гликогена. Предложен способ получения фикоцианина микробного происхождения; предложен выделенный фикоцианин, полученный заявленным способом, включающий следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы, и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена. Предложен экстракт фикоцианина, включающий фикоцианин и гликоген, где отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 6, и он включает следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена; применение выделенного фикоцианина или экстракта фикоцианина в качестве пищевого красителя, а также пищевой продукт, включающий выделенный фикоцианин или экстракт фикоцианина. Изобретение позволяет улучшить способы очистки фикоцианинов, экстрагированных из биомассы с качественной точки зрения путем снижения остаточного содержания сахаров в конечном продукте, в частности остаточного содержания гликогена, при сохранении свойств фикоцианина. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к новому способу очистки фикоцианинов, продуцируемых ферментацией микроводорослей, в частности, продуцируемых Galdieria sulphuraria, который включает ферментативное разложение гликогена.
Уровень техники
Очистка фикобилипротеинов, выделенных из Galdieria sulphuraria и Spirulina путем осаждения сульфатом аммония уже описана в литературе (Moon et al., 2015; Cruz de Jesus et al., 2006, CN106190853), но ее очень трудно применять в промышленном масштабе, потому что для этого требуется большое количество сульфата аммония, что создает значительные проблемы при переработке сульфата аммония и надосадочной жидкости.
Другие способы очистки, описанные для получения высокой степени чистоты, такие как методы хроматографии, очень дороги в реализации.
Способы выделения фикоцианина (PC) обычно заключаются в осаждении органических веществ, отличных от фикоцианинов, присутствующих в водном неочищенном экстракте от ферментации микроводорослей, для сохранения фикоцианинов в надосадочной жидкости, которую отфильтровывают перед осаждением фикоцианинов. Однако некоторые органические соединения, в частности сложные полисахариды, такие как гликоген, остаются не подверженными этому осаждению.
В промышленном способе очистки фикоцианинов для удаления воды можно использовать стадию фильтрации (ультрафильтрации), чтобы сконцентрировать фикоцианин и удалить небольшие молекулы (белки, ионы, органическую кислоту и т.д.), размер которых меньше порога отсечки фильтра, используемого для получения насколько возможно чистого фикоцианина. Однако если порог отсечки фильтра ниже, чем размер гликогена, он не удаляется и увеличивает вязкость ретентата, ограничивая осуществление фильтрации и поддержание ее оптимальных параметров. Зависящий от концентрации эффект вязкости гликогена был продемонстрирован с использованием очищенного гликогена из Galdieria sulphuraria (Martinez-Garcia et al., 2017).
Более того, полученные очищенные фикоцианины сохраняют высокое содержание этих Сахаров, что может изменять свойства очищенных продуктов, в частности их красящую способность, требуя большего количества фикоцианинов для достижения того же визуального эффекта. Эти остаточные полисахариды действуют как наполнитель, что добавляет затраты на производство фикоцианина и может ограничивать промышленное применение полученного фикоцианина, например, при приготовлении пищевых продуктов с низким содержанием сахара. Присутствие остаточных полисахаридов может ограничивать применение продукта при приготовлении пищевых продуктов с низким содержанием сахара, таким образом приводя к дополнительным расходам для удаления этих сахаров.
Гликоген представляет собой сложный сахар, который трудно удалить, если цель состоит в том, чтобы уберечь фикоцианин от обычных условий разложения сахара. Гликоген представляет собой разветвленный полиглюкозид, состоящий из α1-6-глюкозидных цепей, разветвленных α1-6-связями.
Использование ферментов для лизиса клеток известно в способе выделения фикоцианина из культуры микроорганизмов (CN 106749633, CN102433015 и CN1117973). Эта стадия лизиса клеток, разрушения клеточной стенки для высвобождения фикоцианинов с последующим выделением фикоцианина, высвобождаемого в среду, не оказывает значительного воздействия на гликоген, высвобождаемый с фикоцианином и выделяемым с последним.
Возможно осуществление ферментативного разложения гликогена. Однако этот полисахарид представляет собой полимер, частично устойчивый к ферментам, которые могут его разлагать. Из-за особенно большого количества разветвленных связей αl-6-глюкозидов использование ферментов, таких как β-амилаза (αl-4-глюкозидаза), нецелесообразно, как показано Martinez-Garcia et al. Эти авторы показывают относительно ограниченную активность панкреатической α-амилазы (αl-4-глюкозидазы) на гликоген. Измеренное снижение сахара, отражающее уровень расщепления, остается низким и быстро прекращается. Использование фермента с активностью αl-6-глюкозидазы (изоамилаза, пуллуланаза) для расщепления разветвленной структуры гликогена возможно, как показано в работе Martinez-Garcia et al. или Shimonaga et al. Но опять же, расщепление является неполным из-за высвобождения полимеров глюкозы после длительного времени расщепления (от 24 до 48 часов).
Эти эксперименты по расщеплению гликогена, о которых сообщалось в предшествующем уровне техники, не объединяли с проблемой сохранения фикоцианина, даже несмотря на то, что используемые ферменты могут влиять на целостность фикоцианина, тем самым изменяя его окраску и антиоксидантные свойства.
Цель состоит в том, чтобы улучшить способы очистки фикоцианинов, экстрагированных из биомассы, как с качественной точки зрения, так и с промышленной и экономической точки зрения, путем снижения остаточного содержания сахаров в конечном продукте, в частности остаточного содержания гликогена, при сохранении свойств фикоцианина.
Краткое описание изобретения
Способ в соответствии с изобретением состоит в выполнении ферментативной обработки раствора фикоцианинов для уменьшения содержания гликогена с помощью фермента, подходящего для разложения гликогена в условиях температуры и рН, которые существенно не разлагают присутствующие фикоцианины, т.е. с помощью ферментов, активных при рН ниже 6 и температуре реакции ниже 40°С, таких как глюкоамилазы, пектиназы и пуллуланазы, и их смеси.
Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для очистки кислотоустойчивых фикобилипротеинов, продуцируемых Galdieria sulphuraria, причем ферментативную реакцию проводят при рН ниже 6, предпочтительно примерно 4.
Изобретение также относится к экстракту фикоцианина с отношением гликоген/фикоцианин (по сухой массе) менее 6, преимущественно менее 4, предпочтительно менее 3, более предпочтительно менее 2,5, даже более предпочтительно менее 1.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены кривые потери фикоцианина (%) с течением времени для расщепления при рН=4 при различных концентрациях фермента.
На фиг. 2 представлены кривые потери фикоцианина (%) с течением времени для расщепления при рН=7 при различных концентрациях фермента.
На фиг. 3 представлены кривые высвобождения глюкозы после расщепления гликогена с течением времени для расщепления при рН=4 при различных концентрациях фермента.
На фиг. 4 представлены кривые высвобождения глюкозы после расщепления гликогена с течением времени для расщепления при рН=7 при различных концентрациях фермента.
На фиг. 5 представлено изменение потока пермеата в зависимости от времени для фильтрации экстракта фикоцианина (С-РС) с ферментативным расщеплением и без него.
На фиг. 6 представлена кривая после расщепления гликогена при рН=4 для различных ферментов.
На фиг. 7 представлена кривая после расщепления гликогена при рН=7 для различных ферментов.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к способу очистки фикоцианинов из раствора, содержащего фикоцианин(ы) и гликоген, который включает стадию ферментативного разложения гликогена с помощью фермента, подходящего для разложения гликогена в условиях температуры и рН, которые не приводят к существенному разложению присутствующих фикоцианинов, и стадию отделения фикоцианинов от продуктов разложения гликогена.
Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для очистки раствора фикоцианинов, экстрагированного из культуры микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, которые также продуцируют гликоген, в частности, в контексте промышленного способа производства фикоцианина, который включает культивирование микроорганизмов с последующим извлечением произведенной биомассы для выделения фикоцианина, и извлечение фикоцианина из этой биомассы.
Способ особенно подходит для фикоцианинов, продуцируемых микроорганизмами, которые продуцируют гликоген на высоком уровне, в частности для выделения и очистки фикоцианинов из биомассы, которая содержит более 10% гликогена в пересчете на общее количество сухого вещества.
Микроорганизмы, продуцирующие фикоцианин, хорошо известны, в частности, водоросли (или микроводоросли) отряда Cyanidiales. Отряд Cyanidiales включает семейства Cyanidiaceae или Galdieriaceae, которые подразделяются на роды Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria, к которым среди других видов принадлежат Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita и Galdieria sulphuraria. Особо следует отметить штамм Galdieria sulphuraria (также известный как Cyanidium caldarium) UTEX2919.
Можно также отметить известные продуценты фикоцианина, такие как нитчатые цианобактерии из рода Arthrospira, которые промышленно культивируют под общим названием спирулина.
Микроорганизмы, которые продуцируют фикоцианин с высоким содержанием гликогена, особенно идентифицированы среди микроорганизмов, указанных выше, особенно видов родов Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium и Galdieria, в частности Galdieria sulphuraria.
Гликоген представляет собой полисахарид, широко присутствующий в природе в различных организмах (бактериях, дрожжах, клетках животных и т.д.). Если структура полимера глюкозы с αl-4-связью, разветвленного αl-6-связью, является распространенной, разница возникает из-за процентного содержания и распределения ответвлений. В частности, под «гликогеном» в контексте изобретения понимают полимер глюкозы, присутствующий в ранее указанных организмах, продуцирующих фикоцианин, отличительным признаком которого является размер большинства ответвлений менее 10 звеньев глюкозы, как показано в работе Martinez-Garcia et al.
Промышленные способы культивирования микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, хорошо известны специалистам в данной области техники. Особо следует отметить патентные заявки WO 2017/093345, WO 2017/050917 и WO 2018/178334.
Извлечение фикоцианина из биомассы также известно специалисту. Особо следует отметить заявку WO 2018/178334. Обычно требуется стадия либо механического, либо ферментативного лизиса клеток для высвобождения фикоцианина, продуцируемого в клеточных компартментах микроорганизмов. В результате лизиса клеток обычно образуется раствор фикоцианина, который содержит органическую массу в суспензии (называемой неочищенной суспензией), которую можно разделить обычными методами разделения, в частности фильтрацией, особенно микрофильтрацией, или центрифугированием с последующей фильтрацией, более конкретно микрофильтрацией. Затем получают неочищенный раствор фикоцианина, который может быть дополнительно очищен для удаления низкомолекулярных органических остатков обычными способами ультрафильтрации для получения очищенного раствора, из которого фикоцианин может быть получен обычными способами осаждения и сушки. Особо следует отметить тангенциальную фильтрацию на керамических мембранах или органических мембранах, таких как полые волокна из полиэфирсульфона или полисульфона, в частности, предлагаемые компанией Repligen. Пороги этих фильтров могут быть выбраны для отделения молекул с молекулярной массой выше или ниже целевых фикоцианинов.
Затем полученные фикоцианины могут быть очищены, в частности, с помощью стадии диафильтрации для максимального удаления низкомолекулярных органических остатков.
Ферментативную обработку в соответствии с изобретением можно проводить как с неочищенной суспензией, так и с неочищенным раствором.
Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для очистки растворов кислотоустойчивых фикоцианинов, в частности фикоцианинов, описанных в заявке WO 2017/050918.
В частности, способ в соответствии с изобретением используют для очистки кислотоустойчивых фикоцианинов, продуцируемых Galdieria sulphuraria, в частности, в промышленном способе получения этих фикоцианинов с помощью ферментерной культуры Galdieria sulphuraria.
Предпочтительными условиями для проведения ферментативной реакции являются рН ниже 7 и температура реакции ниже 60°С, предпочтительно ниже 50°С, еще более предпочтительно ниже 30°С.
Преимущественно ферментативный лизис гликогена проводят при рН меньше или равном 5, предпочтительно примерно 4,5.
Предпочтительно ферментативную реакцию проводят при комнатной температуре. Эта комнатная температура соответствует определению использования в температурной зоне с умеренным климатом или в комнате с температурой, соответствующей температурной зоне, то есть в диапазоне от 18 до 28°С, в более общем случае от 20°С до 25°С.
Эти условия температуры и рН особенно подходят для сохранения фикоцианина во время ферментативной реакции.
Ферменты, активные в условиях кислого рН и при комнатной температуре, известны специалисту в данной области техники. Однако условия расщепления гликогена с целью сохранения фикоцианина и облегчения его производства неизвестны.
Неожиданно было обнаружено, что ферменты, обладающие активностью αl-4-галактозидазы, также обладают активностью αl-4-глюкозидазы (или альфа-глюкозидазы) в условиях рН и температуры, совместимых с очисткой фикоцианина.
Это, в частности, касается пектиназ, расщепляющих пектин, и, в частности, пектиназ, экстрагированных из нитчатых грибов, таких как Aspergillus, в частности пектиназ, экстрагированных из Aspergillus aculeatus, таких как ферменты, продаваемые под названием Pectinex® компанией Novozymes.
Действие этих ферментов уменьшает размер гликозидных цепей, которые затем могут быть удалены ультрафильтрацией в условиях, позволяющих удерживать фикоцианины, позволяя проходить фрагментам гликогена.
Было обнаружено, что эти условия ферментативного лизиса высвобождают полиглюкозидные цепи и небольшое количество мономеров глюкозы и поэтому особенно подходят для предотвращения загрязнения другими микроорганизмами, в частности, организмами, патогенными для людей или животных, что важно, когда полученный фикоцианин используют в качестве красителя для пищевых продуктов.
Согласно конкретному воплощению ферментативного лизиса гликогена также можно достигнуть с активностью αl-6-глюкозидазы в дополнение к активности α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы.
Фермент, используемый в способе, может быть смесью ферментов, первого фермента, обладающего активностью α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы, и второго фермента, обладающего активностью α1-6-глюкозидазы.
α1-6-глюкозидазы, активные в указанных выше условиях рН и температуры, также известны специалисту в данной области техники. В частности, это пуллуланазы, которые, как известно, гидролизуют α1-6-гликозидные связи пуллулана, в частности, удаляют ответвления крахмала.
Обычно это ферменты, извлеченные из бактерий, особенно из рода Bacillus. В US 6074854, US 5817498 и WO 2009/075682 описаны такие пуллуланазы, экстрагированные из Bacillus deramificans или Bacillus acidopullulyticus. Промышленно выпускаемые пуллуланазы также известны под названиями «Promozyme D2» (Novozymes), «Novozym 26062» (Novozymes) и «Optimax L 1000» (DuPont-Genencor). Следует отметить, что смеси пуллуланазы/альфа-амилазы описаны в предшествующем уровне техники, но, в частности, для получения сиропа глюкозы из крахмала (US 2017/159090).
Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения фермент обладает как активностью αl-4-глюкозидазы, так и активностью αl-6-глюкозидазы.
Это, в частности, относится к глюкоамилазам. Это также ферменты, экстрагированные из микроорганизмов, в частности из дрожжей или грибов, таких как S. diastaticus или A. niger. Многочисленные глюкоамилазы известны из уровня техники, описаны в литературе и, в частности, в патентных заявках, таких как WO 2019/036721. Обычно их используют в процессах ферментации либо для производства спиртов для потребления (пиво, крепкие спиртные напитки), либо для ферментации биомассы для производства биоэтанола. Их также используют в качестве добавок для выпечки или пищевых добавок. Известно, что глюкоамилазы выпускаются в промышленности, в частности, под названиями «Amylase AG XXL» (Novozymes) или «Panzym® AG XXL» (Eaton).
Преимущественно ферменты, используемые в способе в соответствии с изобретением, являются ферментами, разрешенными для использования в пищевой промышленности.
Оптимальное содержание ферментов, используемых на этой стадии лизиса гликогена, может определить специалист в данной области в соответствии с активностью ферментов, используемых в условиях температуры и рН, описанных выше.
Концентрации фермента обычно составляют от 0,0001% до 5%, предпочтительно от 0,0025% до 1%, более предпочтительно от 0,005% до 0,5%, еще более предпочтительно от 0,01% до 0,25%, процентное содержание выражено в виде объема раствора фермента по отношению к общему объему неочищенной суспензии или неочищенной суспензии.
Растворы ферментов имеют концентрацию ферментов обычно от 100 до 20000 единиц/мл, причем активность ферментов обычно приписывают этим ферментам в соответствии с указаниями производителя.
Использование α1-6-глюкозидаз снижает количество задействованных αl-4-глюкозидазы или полигалактуроназы. Общие концентрации ферментов (α-1-4-глюкуронидаза + α1-6-глюкозидазы) обычно составляют от 0,0001% до 5%, предпочтительно от 0,0025% до 1%, более предпочтительно от 0,005% до 0,5%, еще более предпочтительно от 0,01% до 0,25%, при этом процентное содержание выражено в виде отношения объема раствора фермента к общему объему неочищенной суспензии или неочищенной суспензии.
С αl-4-глюкозидазой или полигалактуроназой по отдельности или в смеси с αl-6-глюкозидазой, или с ферментом с активностью α1-4-глюкозидазы и α1-6-глюкозидаз, реакцию преимущественно проводят в течение менее 48 часов, предпочтительно менее 24 часов, более предпочтительно от 5 до 12 часов.
Для способа в соответствии с изобретением и, в частности, для стадии выделения путем тангенциальной фильтрации для выделения фикоцианина нет необходимости в достижении полного расщепления гликогена до мономера глюкозы. Частичного расщепления полисахарида и его восстановления до олигомеров с размерами ниже порога отсечки фильтрации достаточно для удаления гликогена из суспензии или раствора фикоцианина.
Квалифицированный специалист знает, как определить подходящее время для наилучшего снижения количества гликогена в зависимости от исходного содержания гликогена, количества используемых ферментов и требуемой чистоты произведенного фикоцианина.
Осуществление снижения количества гликогена путем ферментативного расщепления может быть связано или заменено использованием микроорганизмов, способных разрушать этот полисахарид. Специалисту в данной области техники известно, как использовать способности этих микроорганизмов продуцировать и секретировать в неочищенном экстракте ферменты, способные расщеплять гликоген, в частности ферменты, указанные ранее. Специалисту известно, как выбрать и использовать способности этих микроорганизмов метаболизировать гликоген или продукты, возникающие в результате разложения полисахарида. Преимущественно специалисту известно, как использовать способности этих микроорганизмов для ограничения роста нежелательных или патогенных микроорганизмов, в частности, путем синтеза веществ, обладающих противомикробной активностью.
Предпочтительными условиями для проведения расщепления гликогена ex vivo или in vivo являются рН ниже 7 и температура реакции ниже 50°С, предпочтительно ниже 40°С, еще более предпочтительно ниже 37°С.
Преимущественно разложение гликогена ex vivo или in vivo проводят при рН, меньшем или равном 5, предпочтительно примерно 4,5 или 4.
Из-за их отличительной особенности роста и разложения полисахарида молочнокислые бактерии кажутся особенно подходящими. Среди них можно упомянуть бактерии, принадлежащие к родам Lactobacillus, Pediococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Atopobium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Melissococcus или Bifidobacterium.
Изобретение также относится к экстракту фикоцианина с отношением гликоген/фикоцианин (по сухой массе) менее 6, преимущественно менее 4, предпочтительно менее 3, более предпочтительно менее 2,5, еще более предпочтительно менее 1.
Согласно первому воплощению, этот экстракт фикоцианина представляет собой неочищенную суспензию фикоцианина, полученную после ферментативного лизиса.
Эта обработанная неочищенная суспензия, также называемая «ферментативно обработанной неочищенной суспензией», включает, в частности, фикоцианин, высвобожденный после лизиса клеток, олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена и остаточный гликоген с нерастворимыми веществами, получаемыми в результате лизиса клеток в суспензии.
Согласно второму воплощению изобретения, экстракт фикоцианина представляет собой неочищенный раствор фикоцианина, полученный после разделения неочищенной суспензии и ферментативного лизиса гликогена, причем этот лизис проводят до или после разделения неочищенной суспензии или до и после разделения (разделение ферментивно обработанной неочищенной суспензии и/или проведение ферментативной реакции с неочищенным раствором).
Этот неочищенный раствор содержит, в частности, фикоцианин, высвобожденный после лизиса клеток, олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена и остаточный гликоген. Этот обработанный неочищенный раствор, также называемый «ферментативно обработанным неочищенным раствором фикоцианина», обычно содержит от 0,1 до 10 г/л фикоцианина, более предпочтительно от 1 до 5 г/л.
Отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе преимущественно составляет менее 3, предпочтительно менее 2,5.
Ферментативно обработанный неочищенный раствор в соответствии с изобретением можно опционально концентрировать путем удаления части воды обычными способами в данной области техники, проводимыми в условиях, которые по существу не нарушают целостность фикоцианина. В этом случае содержание фикоцианина в концентрированном ферментативно обработанном неочищенном растворе предпочтительно составляет от 10 до 50 г/л.
Согласно другому воплощению, экстракт фикоцианина представляет собой фикоцианин, выделенный после экстракции из ферментативно обработанного неочищенного раствора в соответствии со способами, описанными выше.
Для выделенного фикоцианина отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе преимущественно составляет менее 2, предпочтительно менее 1.
Согласно другому воплощению, экстракт фикоцианина представляет собой очищенный фикоцианин, полученный после очистки выделенного экстракта в соответствии со способами, описанными выше, в частности, путем диафильтрации.
Для очищенного фикоцианина отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе предпочтительно составляет менее 1, предпочтительно менее 0,1.
И выделенный фикоцианин, и очищенный фикоцианин могут все еще содержать следы олигомеров глюкозы, продуктов ферментативного лизиса гликогена.
Полученный фикоцианин имеет красящую способность Е10 от 90 до 400, предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 150.
Для ферментативно обработанного неочищенного раствора красящая способность Е10 предпочтительно составляет от 90 до 110.
Для выделенного фикоцианина окрашивающая способность Е10 предпочтительно составляет от 150 до 210.
Для очищенного фикоцианина красящая способность преимущественно составляет от 210 до 400.
Изобретение также относится к способу получения фикоцианина микробного происхождения, который включает стадии:
(a) культивирования микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, как описано выше, в условиях культивирования для получения ферментационного сусла, содержащего более 30 г/л сухого вещества и не менее 4% фикоцианина в пересчете на сухое вещество;
(b) лизиса клеток для высвобождения продуцируемого фикоцианина и гликогена с получением неочищенной суспензии, как определено выше;
(c) разделения неочищенной суспензии для извлечения неочищенного раствора, содержащего фикоцианин и гликоген, а затем, возможно,
(d) выделения фикоцианина из неочищенного раствора, затем, возможно,
(e) очистки выделенного фикоцианина,
отличающийся тем, что проводят стадию ферментативного лизиса гликогена с ферментами и в условиях, определенных выше, или при разложении с помощью микроорганизмов, причем указанный ферментативный лизис проводят с неочищенной суспензией и/или с неочищенным раствором.
Преимущественно полученный фикоцианин представляет собой фикоцианин, который содержит менее 50% гликогена.
Способы культивирования хорошо известны специалистам, в частности, они описаны в заявках на патент WO 2017/050917, WO 2017/093345 и WO 2018/178334.
Они позволяют получать сусло после ферментации с содержанием сухого вещества более 30 г/л, которое может составлять более 100 г/л.
Содержание фикоцианина не менее 4% может достигать более 10% в зависимости от условий ферментации и культивируемых штаммов.
Специалист в данной области техники знает, как определить условия культивирования в соответствии с промышленной целью производства фикоцианина.
Стадия разделения (с) также известна и описана в предшествующем уровне техники, в частности, ее осуществляют обычными способами фильтрации, такими как микрофильтрация или центрифугирование с последующей фильтрацией, в частности, микрофильтрацией.
Изобретение также относится к применению полученных фикоцианинов в качестве красителей, в частности, в качестве пищевых красителей. Оно также относится к пищевым продуктам, твердым или жидким, в частности к напиткам, которые содержат фикоцианин с низким содержанием гликогена в соответствии с изобретением.
Фикоцианин, используемый в качестве красителя, может быть в форме ферментативно обработанного неочищенного раствора, выделенного фикоцианина или очищенного фикоцианина, как определено выше.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Отслеживание концентрации С-PC до и после ферментативного лизиса Отслеживание концентрации фикоцианина в неочищенном экстракте проводили при рН, составляющем 4, и рН, составляющем 7, с различным количеством фермента «Pectinex». Неочищенный экстракт фикоцианина из Galdieria sulphuraria получали в соответствии со способом, описанным в заявке WO 2018/178334. Для этого отслеживания фермент и неочищенный экстракт фикоцианина фильтровали на фильтре 0,22 мкм. Расщепление проводили при комнатной температуре. Для каждой кинетической точки измеряли оптическую плотность, пригодную для определения концентрации фикоцианина, параллельно с измерением глюкозы после денатурации фермента (95°С, 5 минут) с помощью биохимического анализатора YSI 2700. Результаты показаны на фиг. 1-4.
Эти результаты показывают, что количество расщепленного гликогена варьируется в зависимости от рН и концентрации фермента. Избыток фермента может привести к разложению фикоцианина.
Однако можно видеть, что спустя менее чем 24 ч расщепления при рН=4 и 0,05% «Pectinex» достигается значительный лизис гликогена, при существенном ограничении разложения фикоцианина.
Пример. 2. Отслеживание скорости расщепления гликогена в неочищенном растворе фикоцианина
Отслеживание скорости расщепления гликогена в неочищенном растворе осуществляли при рН, составляющем 4, и рН, составляющем 7, с помощью различных ферментов: альфа-амилазы (Ban 480L от Novozymes), полигалактуроназы (Pectinex Ultra SP-L от Novozymes) и глюкоамилазы (Amylase AG XXL от Novozymes).
Неочищенный раствор фикоцианина из Galdieria sulphuraria получали в соответствии со способом, описанным в заявке WO 2018/178334. Для этого отслеживания фермент и неочищенный раствор фикоцианина фильтровали на фильтре 0,22 мкм. Расщепление проводили при комнатной температуре. Для каждой кинетической точки измерение глюкозы выполняли после денатурации фермента (95°С, 5 минут) с помощью биохимического анализатора YSI2700. Процент расщепления гликогена представляет собой отношение концентрации глюкозы к концентрации глюкозы после полного гидролиза полисахарида.
Результаты показаны на фиг. 6 (рН=4) и 7 (рН=7).
Пример 3. Содержание гликогена в очищенном продукте с ферментативным лизисом или без него
Неочищенный раствор фикоцианина, необработанный или подвергнутый расщеплению в течение 12 часов с 0,25 об.% α1-6-глюкозидаз, затем в течение 2 часов с 0,1 об.% α1-4-полигалактуроназы фильтровали на половолоконной мембране с пористостью 70 кДа с заключительной стадией диафильтрации.
Различные измерения, проводимые в конце каждой стадии фильтрации и/или фильтрации, показывают, что концентрация гликогена в ретентате значительно увеличивается, пока не достигает заметной концентрации по сравнению с PC. Следовательно, необходимо удалить весь или часть этого гликогена, чтобы избежать снижения красящей способности конечного продукта, а красящая способность Е10 составляет от 90 до 400.
Цветность Е10 (10% Е618 нм) указывает на интенсивность окрашивания, которую измеряют при 618 нм после растворения порошка в водном растворе.
Протокол:
Отмеряют 0,25 грамма образца и растворяют его в 100 мл буферного раствора лимонной кислоты, доведенного до рН, составляющего 6,0. Затем раствор разбавляют в 10 раз буфером лимонной кислоты и измеряют оптическую плотность при 618 нм, используя кювету толщиной 1 см. Цветность Е10 (10% Е618 нм) = поглощение (при 618 нм) × 100 / 0,25 грамма.
Пример 4. Перепад давления на мембране с ферментативным лизисом или без него Неочищенный экстракт фикоцианина из Galdieria sulphuraria, полученный в соответствии со способом, описанным в заявке на патент WO 2018/178334, осветляли на половолоконной мембране PES 0,05 мкм. Приведенные ниже результаты представляют отслеживание параметров фильтрации с расщеплением с «Pectinex» (0,05%, 5,5 ч, при комнатной температуре и рН=4) или без него того же объема 250 мл неочищенного экстракта.
Результаты показаны на фиг. 5. Они демонстрируют влияние расщепления гликогена на микрофильтрацию неочищенного экстракта. Можно видеть, что для фильтрации данного объема время, необходимое для подвергнутого расщеплению образца, примерно в два раза меньше, чем для образца, не подвергнутого расщеплению, из-за увеличения потока через мембрану.
Список литературы
- Cruz deet al., Int J Food Nutr Sci (2016) 3(3): 1-0.
- Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. (2016) 89:12-8.
- Martinez-Garcia et al., Carbohydrate Polymers (2017) 169: 75-82.
- Moon et al, Korean Journal of Chemical Engineering (2014) 31, 490-495.
- Shimonaga et al., Marine Biotechnology (2007) 9, 192-202.
- Shimonaga et al., Plant and Cell Physiology (2008) 49, 103-116.
- CN 106749633, CN102433015 и CN1117973.
- US 6074854, US 5817498, US 2017/159090.
- WO 2009/075682, WO 2017/050917, WO 2017/050918, WO 2017/093345, WO 2018/178334, WO 2019/036721.
Claims (24)
1. Способ очистки фикоцианинов из раствора, содержащего фикоцианин(ы) и гликоген, причем указанные фикоцианины продуцированы микроорганизмами, принадлежащими к отряду Cyanidiales, отличающийся тем, что он включает (i) стадию ферментативного разложения гликогена с помощью фермента, обладающего активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, или ферментативной смеси, содержащей фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, и фермент, обладающий активностью α1-6-глюкозидазы, или фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы и активностью α1-6-глюкозидазы, при рН ниже 6 и температуре реакции ниже 40°С и (ii) стадию отделения фикоцианинов от продуктов разложения гликогена.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температура составляет ниже 30°С и/или рН на стадии (i) меньше или равен 5.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, представляет собой пектиназу.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что фермент, обладающий активностью α1-6-глюкозидазы, представляет собой пуллуланазу.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что фермент, обладающий и активностью α1-4-глюкозидазы и активностью α1-6-глюкозидазы, представляет собой глюкоамилазу.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что раствор, содержащий фикоцианин(ы) и гликоген, представляет собой неочищенную суспензию, полученную после лизиса клеток биомассы микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, или неочищенный раствор, полученный после фильтрации неочищенной суспензии как таковой, полученной после лизиса клеток биомассы микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин.
7. Способ получения фикоцианина микробного происхождения, который включает стадии:
(a) культивирования микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, как описано выше, в условиях культивирования для получения ферментационного сусла, содержащего более 30 г/л сухого вещества и по меньшей мере 4% фикоцианина в пересчете на сухое вещество;
(b) лизиса клеток для высвобождения продуцируемого фикоцианина и гликогена с получением неочищенной суспензии, как определено выше;
(c) разделения неочищенной суспензии для извлечения неочищенного раствора, содержащего фикоцианин и гликоген, а затем, возможно,
(d) выделения фикоцианина из неочищенного раствора, затем, возможно,
(e) очистки выделенного фикоцианина,
отличающийся тем, что указанный способ дополнительно содержит стадию очистки, как определено в любом из пп. 1-6, причем указанную стадию очистки проводят с неочищенной суспензией, полученной на стадии (b), и/или с неочищенным раствором, полученным на стадии (с).
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что раствор, содержащий фикоцианин(ы) и гликоген, представляет собой неочищенную суспензию, полученную на стадии (b).
9. Способ п. 7 или 8, отличающийся тем, что ферментативный лизис проводят с неочищенным раствором, полученным на стадии (с).
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что фикоцианин представляет собой фикоцианин микробного происхождения, продуцируемый микроорганизмом, выбранным из видов родов Cyanidioschyzon, Cyanidium и Galdieria, в частности Galdieria sulphuraria.
11. Выделенный фикоцианин, полученный способом по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что он включает следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы, и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена.
12. Экстракт фикоцианина, включающий фикоцианин и гликоген, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 6, и отличающийся тем, что он включает следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена.
13. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 4.
14. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 3.
15. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 2,5.
16. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 1.
17. Применение выделенного фикоцианина по п. 11 или экстракта по любому из пп. 12-16 в качестве пищевого красителя.
18. Пищевой продукт, отличающийся тем, что он включает выделенный фикоцианин по п. 11 или экстракт по любому из пп. 12-16.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1900277 | 2019-01-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021122287A RU2021122287A (ru) | 2023-02-13 |
| RU2810761C2 true RU2810761C2 (ru) | 2023-12-28 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320195C1 (ru) * | 2006-05-31 | 2008-03-27 | Владимир Кимович Мазо | Способ получения белкового препарата из цианобактерий |
| CN106749633A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-31 | 厦门大学 | 一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法 |
| CN108165600A (zh) * | 2018-03-28 | 2018-06-15 | 全家百（苏州）生物科技有限公司 | 从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320195C1 (ru) * | 2006-05-31 | 2008-03-27 | Владимир Кимович Мазо | Способ получения белкового препарата из цианобактерий |
| CN106749633A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-31 | 厦门大学 | 一种利用氯化氨溶液从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法 |
| CN108165600A (zh) * | 2018-03-28 | 2018-06-15 | 全家百（苏州）生物科技有限公司 | 从螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CN 102 433 015 A, 2 May 2012. CN 1 117 973 A, 6 March 1996. ЕФИМОВ А.А., Обоснование технологии получения фикоцианина из синезеленых водорослей как пищевой добавки, материалы конференции, фундаментальные исследования N11, 2007, с.80-82, https://s.fundamental-research.ru/pdf/2007/11/44.pdf. * |
| ЕФИМОВ А.А. и др., ПРОЦЕССЫ ОЧИСТКИ В ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВОГО КРАСИТЕЛЯ ФИКОЦИАНИНА ИЗ СИНЕЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ, с.16 https://cyberleninka.ru/article/n/protsessy-ochistki-v-tehnologii-pischevogo-krasitelya-fikotsianina-iz-sinezelenyh-vodorosley,. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2015337881B2 (en) | Method for producing sugar solution and xylooligosaccharide | |
| RU2748948C2 (ru) | Способ получения ксилоолигосахарида | |
| Merín et al. | Characterization of pectinase activity for enology from yeasts occurring in Argentine Bonarda grape | |
| US9909158B2 (en) | Method of producing sugar solution including washing with aqueous alkaline and inorganic salt solutions | |
| JP6458498B2 (ja) | 糖液の製造方法 | |
| US20220112235A1 (en) | Process for purifying phycocyanins | |
| Guilloux-Benatier et al. | Lysis of yeast cells by Oenococcus oeni enzymes | |
| Sahay | Wine enzymes: Potential and practices | |
| US9708580B2 (en) | Bacterial culture media and methods for their preparation and use | |
| Germec et al. | Partial purification and characterization of Aspergillus niger inulinase produced from sugar-beet molasses in the shaking incubator and stirred-tank bioreactors | |
| RU2810761C2 (ru) | Способ очистки фикоцианинов | |
| US20170283764A1 (en) | Processing of plant material into bacterial feedstock | |
| US20220073572A1 (en) | Process for extracting phycocyanins | |
| EP2376621B1 (fr) | Souche bacterienne et melange bacterien a activite fucanolytique | |
| WO2019189650A1 (ja) | グルコース糖液の製造方法および化学品の製造方法 | |
| CN116555094B (zh) | 一株溶藻弧菌属多糖降解菌及其培养方法和应用 | |
| Kaur et al. | Optimization of cultural conditions for pectinase produced by fruit spoilage fungi | |
| UTAMI et al. | Production and immobilization pectinase from Bacillus sp. 2P11 using alginate beads | |
| Setyaji et al. | Effect of Penicillium chrysogenum concentration on the production and characteristic of pectinase enzyme from pineapple (Ananas comosus) peel waste. | |
| CA2924387C (en) | Process for the hydrolysis of biomass | |
| ORYZAE | Taminur Islam Chowdhury, Fahad Jubayer, Burhan Uddin, Gulzarul Aziz | |
| JP2006149374A (ja) | 耐熱性ペクチンリアーゼおよびそれを用いたペクチンの製造方法 | |
| Kumar et al. | Immobilization of xylanase produced by new isolate Bacillus pumilus MTCC 8964 | |
| Eyini et al. | Effect of cell wall degrading enzymes on starch recovery from cassava bagasse | |
| Meshram | PRODUCTION AND PARTIAL PURIFICATION OF PECTINASE BY FUNGAL STRAINS GROWN ON ORANGE PEEL |