CN111500475B - 一株海洋胶红酵母zor1及生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法 - Google Patents

一株海洋胶红酵母zor1及生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了海洋胶红酵母ZOR1以及生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，该菌株的名称为胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa，保藏编号为CGMCC No.18634，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年9月29日。该方法包括收集海洋胶红酵母ZOR1菌体，并向细胞中加入蜗牛酶和蛋白酶进行酵母细胞破壁，分别从水相和细胞碎片中提取甘露聚糖和类胡萝卜素，酶破壁提取的甘露聚糖和类胡萝卜素的提取率最高可提高7‑10倍。

Description

一株海洋胶红酵母ZOR1及生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法
技术领域
本发明属于生物工程和生化分离工程领域，尤其是一种海洋胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa ZOR1以及从海洋胶红酵母中酶法联合提取甘露聚糖和类胡萝卜素的生产方法。
背景技术
胶红酵母属担子菌，细胞呈粉红色至红色，其细胞壁富含多糖、蛋白及包括虾青素在内的类胡萝卜素等多种功能性物质。酵母多糖主要有甘露聚糖和葡聚糖，并均具有丰富的生物学功能。甘露聚糖在酵母细胞外壁上与蛋白共价结合形成甘露聚糖蛋白，约占细胞壁干重的40-45％，其中5-10％为蛋白质，80-90％为甘露聚糖；甘露聚糖具有抗肿瘤、抗辐射和抗氧化等功能，具有显著地提高机体免疫力并能够刺激肠道益生菌的生长的功效，目前甘露聚糖主要从酵母中提取。类胡萝卜素是一类广泛存在于自然界中但人体不能自行合成的多烯类化合物，主要包括胡萝卜素、虾青素、番茄红素和叶黄素等，具有很强的抗氧化活性，在人体内可淬灭单线态氧并清除自由基从而避免机体细胞受到氧化损伤。目前类胡萝卜素已被FAO和WHO定为A类营养色素，在全球50多个国家获准作为营养和着色双重功用的食品添加剂，同时类胡萝卜素还被广泛应用于医药、保健品和化妆品行业；类胡萝卜素主要从高等植物和微生物中提取，而微生物不存在季节和地域限制，且比植物原料更节约成本，因此微生物成为类胡萝卜素的重要资源来源。海洋胶红酵母细胞壁富含甘露聚糖和类胡萝卜素，同时海洋源胶红酵母具有耐盐特性在发酵过程中可添加盐分避免杂菌污染，因此海洋红酵母具有重要的研究意义和开发前景。目前，对甘露聚糖和类胡萝卜素可分别从酵母中提取，但是从富含两种物质的酵母资源中通过酶解破壁并联合提取甘露聚糖和类胡萝卜素无相关的研究报道。本发明利用蜗牛酶和蛋白酶的双酶作用酶解海洋胶红酵母细胞壁，充分释放甘露聚糖和类胡萝卜素，可提高甘露聚糖和类胡萝卜素的提取率并可充分利用酵母细胞资源。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种海洋胶红酵母ZOR1及生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，提高了甘露聚糖和类胡萝卜素的提取率。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一株海洋胶红酵母ZOR1菌株，该菌株的名称为胶红酵母Rhodotorulamucilaginosa，保藏编号为CGMCC No.18634，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年9月29日。
生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，使用上述菌株通过酶法破壁联合提取甘露聚糖和类胡萝卜素。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述酶法破壁所用的酶包括蜗牛酶和蛋白酶。
本发明技术方案的进一步改进在于：具体包括以下步骤：
1)挑取海洋源胶红酵母ZOR1单菌落放入改良LB液体培养基中培养，180rpm 30℃培养48h，10000g离心2min收集海洋胶红酵母菌体，向菌体中加入蜗牛酶和蛋白酶，37℃水浴中处理1h；
2)将水浴处理后的菌体10000g离心3min，弃去上清收集得到细胞碎片；
3)向步骤2)中离心得到的细胞碎片中加入等质量的蒸馏水，30℃下溶解30min，10000g离心3min取上清并收集细胞碎片，上清即为富含甘露聚糖的溶液液，向上清溶液中按照1:5的比例加入无水乙醇(v/v)，在4℃环境下醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍蒸馏水，再加入三氯乙酸至终浓度10％(m/v)，置于冰上30min，然后于4℃、10000g离心3min取上清，获得含有甘露聚糖的溶液；
4)将步骤3中离心得到的细胞碎片加入0～0.6％蛋白酶，37℃水浴处理30min后，按照1:20(v/v)比例加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述LB液体培养基选用酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2。
本发明技术方案的进一步改进在于：海洋胶红酵母ZOR1菌体中加入蛋白酶量为0.2-0.6％。
本发明技术方案的进一步改进在于：海洋胶红酵母ZOR1菌体中加入蜗牛酶量为3％。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明提供了一种海洋胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa，R.mucilaginosa)ZOR1菌株；同时利用蜗牛酶和蛋白酶促进细胞壁裂解，能够有效地促进酵母细胞壁甘露聚糖和类胡萝卜素的释放，甘露聚糖和类胡萝卜素提取率最高可提高7-10倍。
附图说明
图1Rhodotorula mucilaginosa ZOR1菌落形态；
图2Rhodotorula mucilaginosa ZOR1显微形态(10×100)；
图3Rhodotorula mucilaginosa ZOR1系统发育进化树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
实施例1
胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa，保藏编号为CGMCC No.18634，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年9月29日。在本发明中，所述R.mucilaginosa ZOR1的菌落特征如图1所示，菌落呈现橘红色，圆形、光滑；菌株的光学显微镜如图2所示，细胞为卵形，直径约4-5um；提取本发明所述R.mucilaginosaZOR1总DNA，并设计IST引物primer:1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和primer 2 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行IST序列的扩增，IST扩增体系为：
Figure GDA0003571082640000042
扩增条件为：
Figure GDA0003571082640000041
扩增产物送至三博远志进行测序拼接，得到的IST序列如附录1，基于该序列建立其系统发育进化树(图3)，发现ZOR1菌株与R.mucilaginosa DMic 144831同源性100％。
实施例2
1、挑取海洋源R.mucilaginosa ZOR1单菌落与改良LB液体培养基中(酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2)，180rpm 30℃培养48h，10000g离心3min收集R.mucilaginosa；
2、加入等质量的蒸馏水，30℃下处理30min，10000g离心2min取上清并收获细胞，上清即为富含甘露聚糖的溶液，向上清溶液中加入无水乙醇(1:5,v/v)4℃醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍体积蒸馏水溶解，加入三氯乙酸溶液至终浓度为10％并混匀，置于冰上30min，4℃、10000g离心3min，取上清为含有甘露聚糖的溶液。取1ml该溶液，加入57μl硫酸100℃水解7h并定容至100ml，在A试管中加入0.2ml样品，0.2ml NaCl-H3BO3溶液(12g NaCl+2g H3BO3定容至100ml)和0.1ml蒸馏水；在B试管中加0.2ml甘露糖溶液(样品)和0.3ml蒸馏水。然后各加入浓H2SO4 4.5ml轻轻摇匀，立刻置入70℃水浴中，准确计时25min，取出用自来水冷却至室温。以蒸馏水为空白，在280nm处测得吸光值ODA、ODB，二者之差为△OD(计算公式中的x)，查甘露糖曲线获得甘露糖含量，根据下列公式：
Figure GDA0003571082640000051
计算得到测定得到甘露聚糖的量为7μg/g(cdw)。
其中细胞干重(cdw)的测定：取5ml R.mucilaginosa ZOR1培养液，10000g离心3min，弃去上清后用去离子水洗两次，在105℃烘箱中烘干2-3h至恒重，称重，则1gR.mucilaginosa ZOR1湿重细胞换算成干重为：0.486±0.171g。
3、将步骤2中离心得到的细胞按照1:20(m/v)加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液，在475nm下测定类胡萝卜素的吸光值x，根据下列公式计算得到并通过公式计算类胡萝卜素的量为70μg/g(cdw)。
Figure GDA0003571082640000052
实施例3
1、挑取海洋源R.mucilaginosa ZOR1单菌落与改良LB液体培养基中(酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2)，180rpm 30℃培养48h，10000g离心2min收集R.mucilaginosa；在R.mucilaginosa细胞沉淀中加入3％的蜗牛酶，37℃水浴中作用60min；
2、将水浴处理后的菌体10000g离心3min，弃去上清收集得到细胞碎片
3、加入等质量的蒸馏水，30℃下处理30min，10000g离心3min取上清并收集细胞碎片，上清即为富含甘露聚糖的溶液，在上清溶液中加入无水乙醇(1:5,v/v)，4℃醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍体积蒸馏水溶解，加入三氯乙酸溶液至终浓度为10％并混匀，置于冰上30min，4℃、10000g离心3min，取上清为含有甘露聚糖的溶液，将沉淀冷冻干燥得到甘露聚糖，测定得到甘露聚糖的量为80μg/g(cdw)；
4、将步骤3中离心得到的细胞碎片按照1:20(m/v)加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液，在475nm下测定类胡萝卜素的吸光值，并通过公式计算类胡萝卜素的量为355μg/g(cdw)。
实施例4
1、挑取海洋源R.mucilaginosa ZOR1单菌落与改良LB液体培养基中(酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2)，180rpm 30℃培养48h，10000g离心2min收集R.mucilaginosa；在R.mucilaginosa细胞沉淀中加入3％的蜗牛酶和0.2％的胰蛋白酶，37℃作用60min；
2、将水浴处理后的菌体10000g离心3min，弃去上清收集得到细胞碎片；
3、加入等质量的蒸馏水，30℃下处理30min，10000g离心3min取上清并收集细胞碎片，上清即为富含甘露聚糖的溶液，向上清溶液中加入无水乙醇(1:5,v/v)4℃醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍体积蒸馏水溶解，加入三氯乙酸溶液至终浓度为10％并混匀，置于冰上30min，4℃、10000g离心3min，取上清为含有甘露聚糖的溶液，将沉淀冷冻干燥得到甘露聚糖，测定得到甘露聚糖的量为183μg/g(cdw)；
4、将步骤3中离心得到的细胞碎片按照1:20(m/v)加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液，在475nm下测定类胡萝卜素的提取量，并通过公式计算类胡萝卜素的量为195μg/g(cdw)。
实施例5
1、挑取海洋源R.mucilaginosa ZOR1单菌落与改良LB液体培养基中(酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2)，180rpm 30℃培养48h，10000g离心2min收集R.mucilaginosa；在R.mucilaginosa细胞沉淀中加入3％的蜗牛酶和0.6％的胰蛋白酶，37℃作用60min；
2、将水浴处理后的菌体10000g离心3min，弃去上清收集得到细胞碎片；
3、加入等质量的蒸馏水，30℃下处理30min，10000g离心3min取上清并收集细胞碎片，上清即为富含甘露聚糖的溶液，在上清溶液中加入无水乙醇(1:5,v/v)4℃醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍体积蒸馏水溶解，加入三氯乙酸溶液至终浓度为10％并混匀，置于冰上30min，4℃、10000g离心3min，取上清为含有甘露聚糖的溶液，将沉淀冷冻干燥得到甘露聚糖，测定得到甘露聚糖的量为88μg/g(cdw)；
4、将步骤3中离心得到的细胞碎片按照1:20(m/v)加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液，在475nm下测定类胡萝卜素的吸光值，并通过公式计算类胡萝卜素的量为527μg/g(cdw)。
实施例6
1、挑取海洋源R.mucilaginosa ZOR1单菌落与改良LB液体培养基中(酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2)，180rpm 30℃培养48h，10000g离心2min收集R.mucilaginosa；在R.mucilaginosa细胞沉淀中加入3％的蜗牛酶和0.2％的胰蛋白酶，37℃作用30min；
2、将水浴处理后的菌体10000g离心3min，弃去上清收集得到细胞碎片；
3、加入等质量的蒸馏水，30℃下处理30min，10000g离心3min取上清收获细胞碎片，上清即甘露聚糖的溶液，向上清溶液中加入无水乙醇(1:5,v/v)4℃醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍体积蒸馏水溶解，加入三氯乙酸溶液至终浓度为10％并混匀，置于冰上30min，4℃、10000g离心3min，取上清为含有甘露聚糖的溶液，将沉淀冷冻干燥得到甘露聚糖，测定得到甘露聚糖的量为108μg/g(cdw)；
4、将步骤3中离心得到的细胞碎片中加入0.6％胰蛋白酶，37℃作用30min，然后按照1:20(m/v)加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液，在475nm下测定类胡萝卜素的提取量，并通过公式计算类胡萝卜素的量为1019μg/g(cdw)。
Rhodotorula mucilaginosa ZOR1 IST序列
CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAGAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTAGTCTTCGGATTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA

Claims (7)

1.一株海洋胶红酵母ZOR1菌株，其特征在于：该菌株的名称为胶红酵母Rhodotorulamucilaginosa，保藏编号为CGMCC No.18634，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年9月29日。
2.生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，其特征在于：使用权利要求1所述菌株通过酶法破壁联合提取甘露聚糖和类胡萝卜素。
3.根据权利要求2所述的生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，其特征在于：所述酶法破壁所用的酶包括蜗牛酶和蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1)挑取海洋源胶红酵母ZOR1单菌落放入改良LB液体培养基中培养，180rpm 30℃培养48h，10000g离心2min收集海洋胶红酵母ZOR1菌体，向菌体中加入蜗牛酶和蛋白酶，37℃水浴中处理1h；
2)将水浴处理后的菌体10000g离心3min，弃去上清收集得到细胞碎片；
3)向步骤2中离心得到的细胞碎片中加入等质量的蒸馏水，30℃下溶解30min，10000g离心3min取上清并收集细胞碎片，上清即为富含甘露聚糖的溶液，向上清溶液中按照1:5的比例加入无水乙醇(v/v)，在4℃环境下醇沉25h，10000g离心3min获得甘露聚糖沉淀粗品；向甘露聚糖沉淀中加入5倍蒸馏水，再加入三氯乙酸至终浓度10％(m/v)，置于冰上30min，然后于4℃、10000g离心3min取上清，获得含有甘露聚糖的溶液；
4)将步骤3中离心得到的细胞碎片加入0～0.6％蛋白酶，37℃水浴处理30min后，按照1:20(v/v)比例加入丙酮，35℃下浸提30min，重复三次，10000g离心10min获得提取液并将三次提取液合并得到类胡萝卜素提取液。
5.根据权利要求4所述生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，其特征在于：所述LB液体培养基选用酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 30g/L，pH7.2。
6.根据权利要求3所述生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，其特征在于：海洋胶红酵母ZOR1菌体中加入蛋白酶量为0.2-0.6％。
7.根据权利要求3所述生产甘露聚糖和类胡萝卜素的方法，其特征在于：海洋胶红酵母ZOR1菌体中加入蜗牛酶量为3％。
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