CN107974447A - 虾青素与甘露聚糖联产发酵方法及其应用 - Google Patents

虾青素与甘露聚糖联产发酵方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了虾青素与甘露聚糖联产发酵方法及其应用，虾青素与甘露聚糖联产发酵方法包括：诱变、制备原生质体、基因组重排、虾青素的获取、甘露聚糖的提取；虾青素作为抗氧化添加剂应用于饲料、食品、化妆品中；甘露聚糖可以应用于粘着剂、保香剂、饲料添加剂、化妆品添加剂、废水处理中的包埋材料、防尘剂、色谱填料、食品保鲜。有益效果为：以双诱导法获取高产红法夫酵母菌株，通过基因组重排细胞融合的方法筛选出高产虾青素的菌株，获得遗传稳定的红法夫酵母菌株，通过联产发酵获取虾青素与甘露聚糖；虾青素、甘露聚糖的应用范围较为广泛，具有很高的经济价值。

Description

虾青素与甘露聚糖联产发酵方法及其应用
技术领域
本发明涉及虾青素与甘露聚糖的制备领域，尤其是涉及虾青素与甘露聚糖联产发酵方法及其应用。
技术背景
虾青素即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，为萜烯类不饱和化合物，分子式为C40H52O4，分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键。虾青素广泛存在于自然界，如大多数甲壳类动物和鲑科鱼类体内，植物的叶、花、果，以及火烈鸟的羽毛中等，是一种高附加值的酮式类胡萝卜素，具有艳丽颜色，充当饲料可以改善鱼类、家禽肌肉色泽，促进生长。在生物体内虾青素具有极强的猝灭单线态氧和清除氧自由基的能力，因此在抗辐射、抗氧化、抗肿瘤、养殖业、化妆品、保健品和医药工业方面有着广泛的应用。甘露聚糖是高度分支的多聚体，广泛存在与多种生命形式中。研究表明，在酵母细胞壁中，甘露聚糖多以α-1,6-甘露糖为骨架链，大部分甚至全部的残基具有α-1,2或α-1,3连接的含有2-5个甘露糖残基的侧链。甘露聚糖能增加动物体液免疫和细胞免疫能力，调节肠道菌群平衡，结合吸附外源性病原菌，并具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等活性功能，是免疫功能最强的酵母细胞壁多糖。红法夫酵母耐受性强，生长不受剧烈搅拌和CO2抑制，是目前生产虾青素的主要商业菌种之一，但是其虾青素产量较低，难以同化学合成抗衡。
现有技术如授权公众号为CN 104844492 B的中国发明专利，公开了一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，该发明方法首先采用酶法对所述胶红酵母菌体进行破壁，得到胶红酵母破壁菌体，经无水乙醇浸提、超声提取、去除极性杂质获得产品。现有技术如授权公众号为CN 101886108 B的中国发明专利，公开了一种虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，该发明方法经由菌种的培养→虾青素的高产发酵→补加高浓度的蔗糖及果葡萄糖浆→控制条件转化生产甘露聚糖→虾青素和甘露聚糖的提取，完成虾青素与甘露聚糖联产发酵。目前没有相关虾青素与甘露聚糖的联产发酵制备的相关研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，本发明方法中的微生物菌体遗传性能稳定，虾青素与甘露聚糖产率较高，提取方法简单易行，提取率较高。
本发明的目的之二在于提供一种虾青素与甘露聚糖的应用，虾青素、甘露聚糖的应用范围较为广泛，具有很高的经济价值。
本发明中所使用的高产虾青素菌种为红法夫酵母CZ-10,已由中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.6325。中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，包括：诱变、制备原生质体、基因组重排、虾青素的获取、甘露聚糖的提取，具体包括以下步骤：
诱变：将经活化并培养后的红法夫酵母菌体菌悬液用无菌生理盐水稀释至1-1.2×106个/mL，取5-10mL菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入300-350μL10-12％LiCl水溶液，混匀后开盖进行紫外线照射，诱变条件为：28-30cm、15-16W、5-7分钟，处理后适当稀释涂板，在20-22℃恒温培养箱中培养4-6天；在LiCl-紫外复合诱变的同时，将制备好的菌悬液浓度调整为1-1.2×106个/mL，取菌悬液于无菌试管中，送浙江省农科院钴室进行60Co-γ射线诱变；氯化锂是一种碱金属卤化剂，本身并无诱变作用，但与紫外线复合，在一定浓度范围内，有利于菌体正突变的发生；选取菌体致死率在60-95％区间范围的诱变剂量进行诱变；
制备原生质体：选取5-8株虾青素体积产率较高的突变株作为亲本菌株混合培养，从培养成熟的新鲜液体培养基中取细胞悬液5-10mL，5000-7000r/min离心8-10分钟，弃上清液；细胞沉淀物用无菌生理盐水洗涤两次，离心后即得菌体；将亲本细胞悬浮于l0-20mL体积比为25-35:1的0.05-0.06mo1/LEDTA和0.5-0.6mo1/Lβ-疏基乙醇的混合液中，20-22℃振荡处理10-25分钟，离心收集菌体，用KT缓冲液洗涤2-3次，离心后再次得菌体；在菌体中加入8-10mL溶壁酶混合液之后放于20-22℃下90-100r/min的摇床中轻微振荡，以使菌体充分悬浮在酶液中；使用1mL枪头反复吸取酶解液促使原生质体的释放，同时用显微镜观察细胞形成原生质体的情况，8-10小时酶解结束后灭活，以5000-6000r/min离心8-10分钟，用KT缓冲液洗涤2-3次收集菌体，用KT缓冲液配置成1×107个/mL原生质体悬液；2-巯基乙醇可以打开酵母细胞壁蛋白质中存在的二硫键，二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏，从而可以利用复合酶更加高效的进行破壁处理制备原生质体，为红法夫酵母细胞的基因组重排做好准备；
基因组重排：各取1-2mL原生质体悬液，混匀后，3000-3500r/min离心8-10分钟，弃上清；在原生质体沉淀中加入4-6mLPTC溶液，用移液枪吸吹混匀，20-22℃保温15-20分钟，3000-3500rpm离心8-10分钟，弃上清；之后以KT缓冲液洗涤2-3次，最后重悬于2-3mLKT缓冲液中，适当稀释后涂布于40-42μmol/L浓度的二苯胺再生选择平板上，20-22℃在恒温培养箱中培养5-7天；挑取颜色较红、菌落较大的菌株于斜面保藏，选出虾青素体积产量较高的菌株进行第二轮融合，第二轮融合二苯胺的浓度为55-56μmol/L，筛选菌株后进行第三轮融合，第三轮融合二苯胺的浓度为65-66μmol/L，将经原生质体融合后筛选出的高产菌株进行种子液培养待用；采用PEG诱导融合，以二苯胺作为筛选剂筛选出虾青素体积产品较高的菌株进行多轮融合，可以获得遗传稳定的高产菌株；
虾青素的提取：将经基因组重排融合后的高产菌株经培养发酵后取发酵液于5000-6000r/min下离心8-10分钟，去离子水洗涤3-5次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入50-55℃预热的二甲亚砜，振荡悬浮，加入丙酮，漩涡振荡20-30秒，0-4℃、7000-8000r/min离心10-15分钟，去离子水洗涤抽提，取抽提液提取即得虾青素，收集残渣，如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止；虾青素的提取过程简单易行，有机溶剂的残留较少；
甘露聚糖的提取：取红法夫酵母残渣按料液比1:1-1.2(g/mL)用6-8％KOH溶液在75-81℃处理90-100分钟，在9000-10000r/min离心8-10分钟，转移上清液至干净容器，以6-8％KOH溶液洗涤沉淀一次，合并上清液；按1:0.5-0.8体积比加入费林试剂1-0℃反应10-15分钟，沉淀用0.5-0.6MNaCl清洗后溶解于10-15倍重量的4-5MHCl，浸提3-4小时后加入2-2.5倍体积的乙醇，并在0-4℃过夜，9000-10000r/min离心8-10分钟后得甘露聚糖粗拼；取适量粗多糖在温度52-55℃、pH8.8-9.0、碱性蛋白酶浓度1.0-1.3％的条件下酶解5-5.5小时，酶解结束后调pH为中性，透析48-72小时经低温浓缩后冷冻干燥；费林试剂络合过程需重复3-4次；提取过程简单易行，而且经过络合粗提与酶解纯化后，甘露聚糖的得率较高，提取过程中有机物含量较少，适合规模化应用。
作为优选，培养步骤为：培养液组成及其重量份为：葡萄糖10-12g、浓缩酵母浸出粉5.0-6.0g、蛋白胨5.0-6.0g、MnCl20.5-0.055g、(R)-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛0.038-0.040g、蒸馏水950-1000g，固体培养基需加入20-22g的琼脂粉，pH为4.8-5.0，121-123℃灭菌10-15分钟；挑取菌种于装有50-60mL种子培养基的培养皿中，20-22℃、150-180r/min培养36-48小时；经过扩大培养，红发夫酵母能够迅速地恢复到活力旺盛的状态，得到纯而壮的培养物，有利于发酵培养中代谢产物的生成；培养液中特定占比的(R)-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛可以提高MnCl2对细胞中β-D-葡糖苷酶的活化能力，提高红法夫酵母细胞中β-D-葡糖苷酶的活力，β-D-葡糖苷酶可以有效降解红法夫酵母细胞壁中的主要物质——几丁质，从而可以有效薄化红法夫酵母细胞的细胞壁。
作为优选，发酵步骤为：发酵培养液的组成及其重量份为：葡萄糖10-12g、浓缩酵母浸出粉5.0-6.0g、蛋白胨5.0-6.0g、CaCl2·2H2O 0.2-0.3g、MgSO4·7H2O2.75-3.0g、KH2PO4 1.5-2.0g、(NH4)2SO43.0-3.5g、蒸馏水950-1000g，pH为4.8-5.0，121-123℃灭菌10-15分钟；将种子液按10-12％接种量接入已灭菌的发酵罐中，在20-22℃、200-220r/min、通气量为2.5-3.0vvm的条件下培养36-48小时；发酵培养液可以为红法夫酵母提供足量的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，促使酵母细胞进行生长繁殖与新陈代谢，有利于代谢产物的生成。
作为优选，溶壁酶为重量比为2-3:1-2:1的纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶的混合物；分别将纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶溶于KT缓冲液中，制成20-35％的酶溶液，分别用0.2μm的无机微孔膜过滤灭菌，0-4℃保存，使用时按比例混合；溶壁酶能够较为高效将红法夫酵母进行破壁，方便制作成原生质体并进行基因组重排。
作为优选，KT缓冲液：0.8mol/LKCl、0.01mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4。
作为优选，原生质体的灭活分别采用LiCl(0.566％)紫外灭活25分钟和热灭活55℃2小时；紫外线能够作用于DNA，热灭活作用于蛋白质，双重灭活效率较高。
作为优选，PTC溶液为：准确称取70gPEG-4000、0.22g无水CaCl2溶解于KT缓冲液并定容至200mL。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：虾青素与甘露聚糖的应用，虾青素作为添加剂应用于饲料、食品、化妆品中；甘露聚糖可以应用于粘着剂、保香剂、化妆品添加剂、废水处理中的包埋材料、防尘剂、色谱填料、食品保鲜；精确称量虾青素0.2-0.3份、甘露聚糖0.02-0.03份、茶多酚1.0-1.5份、大蒜素1.0-1.5份、壳聚糖1.8-2.5份、乳酸链球菌素2-5份、蒸馏水50-60份，混合均匀后即得食品保鲜剂；将蔬、果、蛋、鱼、虾等食品在食品保鲜剂中浸泡后取出置于冷冻环境中，保鲜剂具有超强的抑菌性、抗氧化性，可以大大延长食品的保鲜期限，延长食品的货架期。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明实现了虾青素与甘露聚糖的联产发酵，可以通过红法夫酵母发酵同时高产的获取虾青素与甘露聚糖；2)以双诱导法获取高产菌株，通过基因组重排细胞融合的方法筛选出高产虾青素的菌株，获得遗传稳定的红法夫酵母菌株；3)通过配制培养液，可以有效的薄化红法夫酵母的细胞壁，更加利于破壁、原生质体的制备以及基因组的融合重排；4)虾青素、甘露聚糖的应用范围较为广泛，具有较高的经济价值。
附图说明
图1是红发夫酵母原生质体的制备过程示意图；
图2是第一轮融合后红法夫酵母虾青素产率复筛结果示意图；
图3是第二轮融合后红法夫酵母虾青素产率复筛结果示意图；
图4是第三轮融合后红法夫酵母虾青素产率复筛结果示意图；
图5是红法夫酵母F3-22发酵曲线图；
图6是红法夫酵母提取虾青素前后的成分(％)示意图；
图7是甘露聚糖提取液一般成分的含量示意图；
图8是多糖样品的红外色谱图；
图9是甘露聚糖HPLC色谱图；
图10是甘露糖糖腈气相色谱图；
图11是葡萄糖气相色谱图；
图12是甘露聚糖样品水解液气相色谱图；
图13是虾青素和甘露聚糖含量的关系图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，包括：诱变、制备原生质体、基因组重排、虾青素的获取、甘露聚糖的提取，具体包括以下步骤：
诱变：将经活化并培养后的红法夫酵母菌体菌悬液用无菌生理盐水稀释至1×106个/mL，取5mL菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入300μL10％LiCl水溶液，混匀后开盖进行紫外线照射，诱变条件为：28cm、15W、5分钟，处理后适当稀释涂板，在20℃恒温培养箱中培养4天；在LiCl-紫外复合诱变的同时，将制备好的菌悬液浓度调整为1×106个/mL，取菌悬液于无菌试管中，送浙江省农科院钴室进行60Co-γ射线诱变；氯化锂是一种碱金属卤化剂，本身并无诱变作用，但与紫外线复合，在一定浓度范围内，有利于菌体正突变的发生；选取菌体致死率在60-95％区间范围的诱变剂量进行诱变；
制备原生质体：选取8株虾青素体积产率较高的突变株作为亲本菌株混合培养，从培养成熟的新鲜液体培养基中取细胞悬液5mL，5000r/min离心8分钟，弃上清液；细胞沉淀物用无菌生理盐水洗涤两次，离心后即得菌体；将亲本细胞悬浮于l0mL体积比为25:1的0.05mo1/LEDTA和0.5mo1/Lβ-疏基乙醇的混合液中，20℃振荡处理10分钟，离心收集菌体，用KT缓冲液(KT缓冲液：0.8mol/LKCl、0.01mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4)洗涤2次，离心后再次得菌体；在菌体中加入8mL溶壁酶混合液之后放于20℃下90r/min的摇床中轻微振荡，溶壁酶混合液中纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶的重量比为2:2:1，以使菌体充分悬浮在酶液中；使用1mL枪头反复吸取酶解液促使原生质体的释放，同时用显微镜观察细胞形成原生质体的情况，8小时酶解结束后灭活，灭活采用LiCl(0.566％)紫外灭活25分钟和热灭活55℃2小时，灭活后以5000r/min离心8分钟，用KT缓冲液洗涤2次收集菌体，用KT缓冲液配置成1×107个/mL原生质体悬液；2-巯基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键，二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏，从而可以利用复合酶更加高效的进行破壁处理制备原生质体，为红法夫酵母细胞的基因组重排做好准备；
基因组重排：各取1mL原生质体悬液，混匀后，3000r/min离心8分钟，弃上清；在原生质体沉淀中加入4mLPTC溶液(准确称取70gPEG-4000、0.22g无水CaCl2溶解于KT缓冲液并定容至200mL)，用移液枪吸吹混匀，20℃保温15分钟，3000rpm离心8分钟，弃上清；之后以KT缓冲液洗涤2次，最后重悬于2mLKT缓冲液中，适当稀释后涂布于40μmol/L浓度的二苯胺再生选择平板上，20℃在恒温培养箱中培养5天；挑取颜色较红、菌落较大的菌株于斜面保藏，选出虾青素体积产量较高的菌株进行第二轮融合，第二轮融合二苯胺的浓度为55μmol/L，筛选菌株后进行第三轮融合，第三轮融合二苯胺的浓度为65μmol/L，将经原生质体融合后筛选出的高产菌株进行种子液培养待用；采用PEG诱导融合，以二苯胺作为筛选剂筛选出虾青素体积产品较高的菌株进行多轮融合，可以获得遗传稳定的高产虾青素菌株,虾青素产量60-100mg/g；
虾青素的提取：将经基因组重排融合后的高产菌株经培养发酵后取发酵液于5000r/min下离心8分钟，去离子水洗涤3次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入50℃预热的二甲亚砜，振荡悬浮，加入丙酮，漩涡振荡20秒，0℃、7000r/min离心10分钟，去离子水洗涤抽提，取抽提液提取即得虾青素，收集残渣，如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，本提取方法提取率可达85.6％；
甘露聚糖的提取：取红法夫酵母残渣按料液比1:1(g/mL)用6％KOH溶液在75℃处理90分钟，在9000r/min离心8分钟，转移上清液至干净容器，以6％KOH溶液洗涤沉淀一次，合并上清液；按1:0.5体积比加入费林试剂1℃反应10分钟，沉淀用0.5MNaCl清洗后溶解于10倍重量的4MHCl，浸提3小时后加入2倍体积的乙醇，并在0℃过夜，9000r/min离心8分钟后得甘露聚糖粗拼；取适量粗多糖在温度52℃、pH8.8、碱性蛋白酶浓度1.0％的条件下酶解5小时，酶解结束后调pH为中性，透析48小时经低温浓缩后冷冻干燥；费林试剂络合过程需重复3次；提取过程简单易行，而且经过络合粗提与酶解纯化后，甘露聚糖的得率较高，提取过程中有机物含量较少，适合规模化应用。
培养步骤为：培养液组成及其重量份为：葡萄糖10g、浓缩酵母浸出粉5.0g、蛋白胨5.0g、MnCl20.5g、(R)-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛0.038g、蒸馏水950g，固体培养基需加入20g的琼脂粉，pH为4.8，121℃灭菌10分钟；挑取菌种于装有50mL种子培养基的培养皿中，20℃、150r/min培养36小时；经过扩大培养，红发夫酵母能够迅速地恢复到活力旺盛的状态，得到纯而壮的培养物，有利于发酵培养中代谢产物的生成；培养液中特定占比的(R)-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛可以提高MnCl2对细胞中β-D-葡糖苷酶的活化能力，提高红法夫酵母细胞中β-D-葡糖苷酶的活力，β-D-葡糖苷酶可以有效降解红法夫酵母细胞壁中的主要物质——几丁质，从而可以有效薄化红法夫酵母细胞的细胞壁。
发酵步骤为：发酵培养液的组成及其重量份为：葡萄糖10g、浓缩酵母浸出粉5.0g、蛋白胨5.0g、CaCl2·2H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 2.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO43.0g、蒸馏水950g，pH为4.8，121℃灭菌10分钟；将种子液按10％接种量接入已灭菌的发酵罐中，在20℃、200r/min、通气量为2.5vvm的条件下培养36小时；发酵培养液可以为红法夫酵母提供足量的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，促使酵母细胞进行生长繁殖与新陈代谢，有利于代谢产物的生成。
实施2：
1)虾青素的测定：
取5mL发酵液于5000rpm下离心10分钟，去离子水洗涤两次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入lmL55℃预热的二甲亚砜，振荡悬浮，加入丙酮4mL，漩涡振荡20-30s，4℃，5000rmp离心10min，上清液用分光光度计测OD474。如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，虾青素含量计算公式如下：
式中：OD474——抽提液在波长474nm下的吸光度；Vl——有机溶剂的总体积，mL；V2——发酵液体积，mL；W——细胞干重，g；0.21——有机溶剂的消光系数；
2)菌体生物量的测定：
取5mL菌悬液，5000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用去离子水洗两次，在烘箱中于105℃烘至恒重，然后称重。
实施例3：
红法夫酵母菌体的诱变：
将经活化并培养后的红法夫酵母菌体菌悬液用无菌生理盐水稀释至1.2×106个/mL，取10mL菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入350μL12％LiCl水溶液，混匀后开盖进行紫外线照射，诱变条件为：30cm、15W、6分钟，处理后适当稀释涂板，在22℃恒温培养箱中培养5天；在LiCl-紫外复合诱变的同时，将制备好的菌悬液浓度调整为1.2×106个/mL，取菌悬液于无菌试管中，送浙江省农科院钴室进行60Co-γ射线诱变；氯化锂是一种碱金属卤化剂，本身并无诱变作用，但与紫外线复合，在一定浓度范围内，有利于菌体正突变的发生；选取菌体致死率在60-95％区间范围的诱变剂量进行诱变。
将红法夫酵母经LiCl-紫外线连续复合诱变后，测量突变菌株的生物量及其虾青素产率与产量如表1所示。
表1.红法夫酵母经LiCl-紫外复合诱变后突变株的生物量及虾青素产量
由表1可以看出，经LiCl-紫外复合诱变后，菌株发生突变，选取菌株虾青素产率较高的Z2-1、Z2-4作为基因组重排的部分亲本菌株。
将红法夫酵母经60Co-γ射线连续诱变后，测量突变菌株的生物量及其虾青素产率与产量如表2所示。
表2.红法夫酵母经60Co-γ射线诱变后突变株的生物量及虾青素产量
由表2可以看出，经60Co-γ射线诱变后，菌株发生突变，选取菌株虾青素产率较高的Co1-6(3.5)、Co1-16(4)、Co2–20(4)作为基因组重排的部分亲本菌株。
实施例4：
制备原生质体：
选取Z2-1、Z2-4、Co1-6(3.5)、Co1-16(4)、Co2–20(4)五株突变株作为亲本菌株混合培养。培养步骤为：培养液组成及其重量份为：葡萄糖12g、浓缩酵母浸出粉5.0g、蛋白胨5.0g、MnCl20.5g、(R)-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛0.038g，蒸馏水970g，pH为4.9，121℃灭菌15分钟；将亲本菌株接种入培养液中，在22℃、160r/min培养36小时；
从培养成熟的新鲜液体培养基中取细胞悬液10mL，7000r/min离心10分钟，弃上清液；细胞沉淀物用无菌生理盐水洗涤两次，离心后即得菌体；将亲本细胞悬浮于20mL体积比为30:1的0.05mo1/LEDTA和0.6mo1/Lβ-疏基乙醇的混合液中，22℃振荡处理15分钟，离心收集菌体，用KT缓冲液洗涤3次，离心后再次得菌体；
在菌体中加入10mL溶壁酶混合液之后放于22℃下100r/min的摇床中轻微振荡，溶壁酶混合液中纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶的重量比为2:1:1，以使菌体充分悬浮在酶液中；使用1mL枪头反复吸取酶解液促使原生质体的释放，同时用显微镜观察细胞形成原生质体的情况，10小时酶解结束后灭活，以6000r/min离心10分钟，用KT缓冲液洗涤3次收集菌体，用KT缓冲液配置成1×107个/mL原生质体悬液；2-巯基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键，二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏，从而可以利用复合酶更加高效的进行破壁处理制备原生质体，为红法夫酵母细胞的基因组重排做好准备。红法夫酵母原生质体的制备过程如图1所示。
由图1可以看出，酶解4小时时没有形成原生质体，酶解6小时时才开始有原生质体，到了8小时时原生质体数量明显增多，酶解10小时即得所需原生质体。在培养液中加入质量比为13:1的MnCl2与(R)-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛后，菌体细胞中β-D-葡糖苷酶活性最大，细胞壁较薄，有利于酶解破壁的进行。
实施例5：
基因组重排：
各取2mL原生质体悬液，混匀后，3000r/min离心8分钟，弃上清；在原生质体沉淀中加入4mLPTC溶液，用移液枪吸吹混匀，20℃保温15分钟，3000rpm离心8分钟，弃上清；之后以KT缓冲液洗涤2次，最后重悬于2mLKT缓冲液中，适当稀释后涂布于42μmol/L浓度的二苯胺再生选择平板上，22℃在恒温培养箱中培养6天；挑取颜色较红、菌落较大的菌株于斜面保藏，之后进行复筛。
第一轮融合从选择性再生平板上挑选单菌落86个，结果见图2。
图2中，黑色实线代表亲本菌株中虾青素体积产量最高的Co1-16(4)，融合后菌株F1-10﹑F1-11﹑F1-24﹑F1-54的虾青素体积产量较Co1-16(4)高，其中F1-10体积产率最高，达13.713μg·mL-1，是Co1-16(4)产率的1.37倍。F1-10﹑F1-11﹑F1-24﹑F1-54的生物量及虾青素产量如表3所示。
表3.红法夫酵母第一轮融合后融合子的生物量及虾青素产量
第二轮融合仍以二苯胺为筛选剂，浓度是55μmol/L。此次融合挑选单菌落142个，结果见图3。
图3中，黑色实线代表第一轮融合中虾青素体积产量最高的F1-10，只有F2-28虾青素体积产量较F1-10高，达14.571μg·mL-1，表4列出了此次融合筛选出的融合子生物量及虾青素产量。
表4.红法夫酵母第二轮融合后融合子的生物量及虾青素产量
第三轮融合仍以二苯胺为筛选剂，浓度是66μmol/L。此次融合挑选单菌落116个，结果见图4。
图4中，黑色实线代表第二轮融合中虾青素体积产量最高的F2-28，F3-3﹑F3-22﹑F3-26﹑F3-31﹑F3-42﹑F3-90﹑F3-110虾青素体积产量较F2-28高，其中F3-22体积产量最高，达31.287μg·mL-1，是F2-28产量的2.15倍。表5列出了此次融合挑选出的融合子的生物量及虾青素产量。
表5.红法夫酵母第三轮融合后融合子的生物量及虾青素产量
经过三次融合筛选得到遗传稳定F3-22菌株，虾青素体积产量最高，达31.287μg·mL-1，是亲本菌株中产量最高的Co1-16(4)的3.13倍。
实施例6：
虾青素的提取：
取经基因组重排融合后的高产菌株F3-22培养发酵，发酵步骤为：发酵培养液的组成及其重量份为：葡萄糖10g、浓缩酵母浸出粉5.0g、蛋白胨5.0g、CaCl2·2H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 2.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO43.0g、蒸馏水950g，pH为4.8，121℃灭菌10分钟；将种子液按10％接种量接入已灭菌的发酵罐中，在20℃、200r/min、通气量为2.5vvm的条件下培养48小时；发酵培养液可以为红法夫酵母提供足量的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，促使酵母细胞进行生长繁殖与新陈代谢，有利于代谢产物的生成；
经培养发酵后取发酵液于6000r/min下离心10分钟，去离子水洗涤4次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入55℃预热的二甲亚砜，振荡悬浮，加入丙酮，漩涡振荡25秒，4℃、8000r/min离心15分钟，去离子水洗涤抽提，取抽提液提取即得虾青素，收集残渣，如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，测量生物量与虾青素产率与虾青素产量的结果如图5所示。
由图5可以看出，菌体大约有12小时左右的停滞期，之后进入快速生长的对数期，至对数期基本结束，即48小时时，菌体的生物量达到最大值，之后菌体生物量有所下降。和生物量最大值的时间一致，虾青素产量在48小时左右达到最大值，为59.7μg/mL，在随后的6小时内维持稳定。之后随着发酵时间的延长，虾青素的产量也随着下降。这主要是因为红发夫酵母生物量的变化对胞内物虾青素影响很大，虾青素会随着生物量的降低而降低。重量体积产率在18小时达到最大值之后，就趋于稳定，说明该菌性能较为稳定。
实施例7：
甘露聚糖的提取：
取红法夫酵母残渣按料液比1:1.2(g/mL)用7％KOH溶液在78℃处理100分钟，在9500r/min离心10分钟，转移上清液至干净容器，以7％KOH溶液洗涤沉淀一次，合并上清液；按1:0.8体积比加入费林试剂1℃反应10分钟，沉淀用0.5MNaCl清洗后溶解于12倍重量的4MHCl，浸提3小时后加入2倍体积的乙醇，并在4℃过夜，9500r/min离心8分钟后得甘露聚糖粗拼；取适量粗多糖在温度54℃、pH9.0、碱性蛋白酶浓度1.0％的条件下酶解5.5小时，酶解结束后调pH为中性，透析48小时经低温浓缩后冷冻干燥；费林试剂络合过程需重复3次；提取过程简单易行，而且经过络合粗提与酶解纯化后，甘露聚糖的得率较高，提取过程中有机物含量较少，适合规模化应用。
以考马斯亮蓝法[王学圭.植物生理生化实验原理和技术[M].2版.北京:高等教育出版社，2006:190-191.]测定蛋白含量，以快速水分测定仪测定水份，以气相色谱法(GC)分析单糖种类及含量。
酵母粉是鲜酵母泥经冷冻干燥所得，酵母残渣是红法夫酵母提取虾青素之后经40℃恒温烘箱烘干所得，酵母粉中总糖、粗蛋白、甘露聚糖的占比如图6所示。
根据图6去除水分影响，酵母粉中总糖、粗蛋白、甘露聚糖的比例分别为42.15％、51.52％、10.53％，酵母残渣总糖、粗蛋白、甘露聚糖的比例分别为48.01％、41.83％、12.55％。蛋白含量比例的降低以及总糖和甘露聚糖含量比例的升高都有利于以酵母残渣为原料进一步分离提取甘露聚糖。
红法夫酵母的细胞壁尤其坚硬，一般酵母经酸碱处理之后细胞壁都会被破坏，但是红法夫酵母经长时间的高酸或高碱处理后部分细胞细胞壁仍然完整，因此糖得率极低，本发明方法经络合法得粗多糖的得率为6.13％，纯化之后得率是4.65％，如图7所示。
纯化样品经KBr压片，在4000-400cm-1区间进行红外光谱扫描，红外图谱如图8所示。
由图8可知，红外图谱中含有多个多糖类物质的特征吸收峰，在3401cm-1处有强的O-H键的伸缩振动引起的特征吸收，1054cm-1处为O-H变角振动峰，在2926cm-1和1372cm-1处有两组糖类C-H的引起的特征峰，分别代表了糖类C-H伸缩振动与变角振动，在1633cm-1处有C-O非对称伸缩振动峰，870及810cm-1处有不明显吸收峰，说明含甘露糖。
以高效液相色谱法(HPLC)测定经Fehling试剂纯化后的甘露聚糖分子量分布，测定结果如图9所示。由图9可知，甘露聚糖的HPLC色谱图为单一对称峰，这说明经Fehling试剂纯化后的甘露聚糖为均一组分。
甘露糖糖腈、葡萄糖、甘露聚糖样品气相精谱图分别如图10、11、12所示。
糖腈乙酸酯气相色谱图中出现两个峰，对比标准单糖保留时间确定其为甘露糖和葡萄糖，根据二者的峰面积可知在甘露聚糖中甘露糖和葡萄糖的含量比是4.3∶1。综合前面的分析可知样品为甘露聚糖。
实施例8：
改变联产发酵的条件，测得虾青素和甘露聚糖的产量关系如图13所示。由图13可知，虾青素产率和甘露聚糖含量存在着正相关关系。
实施例9：
虾青素与甘露聚糖的应用，精确称量虾青素0.3g、甘露聚糖0.03g、茶多酚1.0g、大蒜素1.5g、壳聚糖2.5g、乳酸链球菌素3g、蒸馏水55g，混合均匀后即得食品保鲜剂；将蔬、果、蛋、鱼、虾等食品在食品保鲜剂中浸泡后取出置于冷冻环境中，保鲜剂具有超强的抑菌性、抗氧化性，可以大大延长食品的保鲜期限，延长食品的货架期。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，包括：诱变、制备原生质体、基因组重排、虾青素的获取、甘露聚糖的提取，其特征在于：所述的制备原生质体的步骤为：选取5-8株虾青素体积产率较高的突变株作为亲本菌株混合培养，从培养成熟的新鲜液体培养基中取细胞悬液5-10mL，5000-7000r/min离心8-10分钟，弃上清液；细胞沉淀物用无菌生理盐水洗涤两次，离心后即得菌体；将亲本细胞悬浮于l0-20mL体积比为25-35:1的0.05-0.06mo1/LEDTA和0.5-0.6mo1/Lβ-疏基乙醇的混合液中，20-22℃振荡处理10-25分钟，离心收集菌体，用KT缓冲液洗涤2-3次，离心后再次得菌体；在菌体中加入8-10mL溶壁酶混合液之后放于20-22℃下90-100r/min的摇床中轻微振荡，以使菌体充分悬浮在酶液中；使用1mL枪头反复吸取酶解液促使原生质体的释放，同时用显微镜观察细胞形成原生质体的情况，8-10小时酶解结束后灭活，以5000-6000r/min离心8-10分钟，用KT缓冲液洗涤2-3次收集菌体，用KT缓冲液配置成1×107 个/mL原生质体悬液。
2.根据权利要求1所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述制备原生质体的步骤中的亲本菌株混合培养的步骤为：培养液组成及其重量份为：葡萄糖10-12g、浓缩酵母浸出粉5.0-6.0g、蛋白胨5.0-6.0g、MnCl20.5-0.055g、（R）-1,1'-联萘-2,2'-氧合二氯化钛0.038-0.040g、蒸馏水950-1000g，固体培养基需加入20-22g的琼脂粉，pH为4.8-5.0，121-123℃灭菌10-15分钟；挑取菌种于装有50-60mL种子培养液的培养皿中，20-22℃、150-180r/min培养36-48小时。
3.根据权利要求1所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述制备原生质体的步骤中的溶壁酶混合液为：分别将纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶溶于KT缓冲液中，制成20-35%的酶溶液，分别用0.2µm的无机微孔膜过滤灭菌，0-4℃保存，使用时按比例2-3:1-2:1将纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶的溶液混合。
4.根据权利要求1所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述的诱变步骤为：将经活化并培养后的红法夫酵母菌体菌悬液用无菌生理盐水稀释至1-1.2×106个/mL，取5-10mL菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入300-350μL10-12%LiCl水溶液，混匀后开盖进行紫外线照射，诱变条件为：28-30cm、15-16W、5-7分钟，处理后适当稀释涂板，在20-22℃恒温培养箱中培养4-6天；在LiCl-紫外复合诱变的同时，将制备好的菌悬液稀释液置于无菌试管中进行60Co-γ射线诱变。
5.根据权利要求1所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述的基因组重排步骤为：各取1-2mL原生质体悬液，混匀后，3000-3500 r/min离心8-10分钟，弃上清；在原生质体沉淀中加入4-6mLPTC溶液，用移液枪吸吹混匀，20-22℃保温15-20分钟，3000-3500rpm离心8-10分钟，弃上清；之后以KT缓冲液洗涤2-3次，最后重悬于2-3mLKT缓冲液中，适当稀释后涂布于含有二苯胺溶液的再生选择平板上，20-22℃在恒温培养箱中培养5-7天；挑取颜色较红、菌落较大的菌株于斜面保藏，选出虾青素体积产量较高的菌株进行第二轮融合，筛选后进行第三轮融合，将经原生质体融合后筛选出的高产菌株进行种子液培养待用。
6.根据权利要求5所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述的第一轮融合中二苯胺的浓度为40-42µmol/L浓度，第二轮融合中二苯胺的浓度为55-56µmol/L，第三轮融合中二苯胺的浓度为65-66µmol/L。
7.根据权利要求1所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述的虾青素的提取步骤为：将经基因组重排融合后的高产菌株经培养发酵后取发酵液于5000-6000r/min下离心8-10分钟，去离子水洗涤3-5次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入50-55℃预热的二甲亚砜，振荡悬浮，加入丙酮，漩涡振荡20-30秒，0-4℃、7000-8000r/min离心10-15分钟，去离子水洗涤抽提，残渣留用，取抽提液提取即得虾青素。
8.根据权利要求1所述的虾青素与甘露聚糖联产发酵方法，其特征在于：所述的甘露聚糖的提取步骤为：取红法夫酵母残渣按料液比1:1-1.2（g/mL）用6-8%KOH溶液在75-81℃处理90-100分钟，在9000-10000r/min离心8-10分钟，转移上清液至干净容器，以6-8%KOH溶液洗涤沉淀一次，合并上清液；按1:0.5-0.8体积比加入费林试剂1-0℃反应10-15分钟，沉淀用0.5-0.6MNaCl清洗后溶解于10-15倍重量的4-5MHCl，浸提3-4小时后加入2-2.5倍体积的乙醇，并在0-4℃过夜，9000-10000r/min离心8-10分钟后得甘露聚糖粗品；取适量粗多糖在温度52-55℃、pH8.8-9.0、碱性蛋白酶浓度1.0-1.3%的条件下酶解5-5.5小时，酶解结束后调pH为中性，透析48-72小时经低温浓缩后冷冻干燥；费林试剂络合过程需重复3-4次。
9.虾青素与甘露聚糖的应用，其特征在于：所述的虾青素用于抗氧化、饲料、食品、化妆品的用途；所述的甘露聚糖用于粘着剂、保香剂、饲料添加剂、化妆品添加剂、废水处理中的包埋材料、防尘剂、色谱填料、食品保鲜的用途。
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