CN103408657B

CN103408657B - 藻蓝蛋白生产工艺及其产品

Info

Publication number: CN103408657B
Application number: CN201310378448.2A
Authority: CN
Inventors: 郑行
Original assignee: FUQING KING DNARMSA SPIRULINA Co Ltd
Current assignee: FUQING KING DNARMSA SPIRULINA Co Ltd
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103408657A

Abstract

本发明的目的是提供一种可工业化生产、提取率高的藻蓝蛋白生产工艺。它包括以下步骤：1、制备藻粉悬浊液：将单位质量的藻粉溶解于水中，制成藻粉悬浊液,2、藻细胞壁破碎：将步骤1中的藻粉悬浊液放置于冰库，反复冻融；在冻融液中加入适量的试剂1、试剂2、试剂3，试剂4后搅拌；3、通过板框过滤机和袋式过滤器过滤，收集滤液；4、离心处理：滤液用离心分离机分离；5、超滤膜浓缩：收集的离心液用超滤膜浓缩，6、制备成品：浓缩液用喷雾器进行干燥。本发明的优点在于：整体工艺能耗底；不易发生蛋白变性的情况，减少目标蛋白损失率；纯化步骤简单，成本进一步降低；产品纯度高；可工业化生产。

Description

藻蓝蛋白生产工艺及其产品

技术领域

本发明涉及一种植物蛋白生产工艺，特别是一种涉及藻蓝蛋白生产工艺及其产品。

背景技术

藻蓝蛋白具有十分广阔的应用前景，但藻蓝蛋白属于胞内蛋白质，要使其溶出首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其以溶解的状态溶于提取液中，再采用适宜的方法将其沉淀，在提取过程应保持蛋白的活性。由于其分离纯化步骤繁琐，纯化过程的费用约占其成本的50%-90%，造成藻蓝蛋白商品价格昂贵，其应用受到了一定限制。因此，解决问题的关键在于纯化方法的简化和高效性。目前藻细胞破碎的方法有：反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法、超声波法和组织捣碎法等5种，蛋白质沉淀方法有：盐析法、结晶法、等电点沉淀法和超滤法等4种方法，纯化方法多采用色谱层析法(如羟基磷灰石柱、离子交换色谱、分子排阻色谱等)。目前螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化取得如下的研究进展。

林红卫等用0.3mmol/L十二烷基苯磺酸钠提取钝顶螺旋藻的藻蓝蛋白，提取率达到了98%，再用硅藻土545柱分级洗脱，进一步经DEAE-纤维素柱纯化，藻蓝蛋白的纯度达到4.1。张以芳等用KCl和溶菌酶联合作用于螺旋藻提取藻蓝蛋白，破壁率达95%以上，并与冻融法比较，认为冻融法只适用于少量样品的制备，大剂量的样品很难快速冻融，而溶菌酶法则适用于大量藻蓝蛋白的制备。化学试剂法由于加入化学试剂使后期纯化处理的难度增加且操作不好易引起蛋白变性，而冻融法操作简单、方便。在实际操作中，经常是几种方法混合使用，以使藻蓝蛋白尽可能地溶出。如高天荣等采用反复冻融法和超声波法使螺旋藻的细胞壁破裂。林红卫等采用洗涤循环冻融法提取螺旋藻藻蓝蛋白，结果显示用Tween20作为提取试剂提取率可达65.1%，较缓冲液循环冻融法高。曲文娟等以钝顶螺旋藻为原料，采用脉冲超声辅助提取技术提取藻蓝蛋白。优化出脉冲超声辅助提取藻蓝蛋白的工艺参数:超声全程时间90min、超声功率1400W、超声发出时间6s、间歇时间9s、循环泵转速12r/s、提取温度20℃，当投料量为20g时，藻蓝蛋白提取率为13.45%。细胞破碎后，藻蓝蛋白溶于提取液中，应选择适当的方法进行沉淀。张以芳等用等电点沉淀法沉淀藻蓝蛋白。一般认为藻蓝蛋白对pH较为敏感，沉淀时pH控制不好易引起蛋白变性。文献报道较多的还是采用盐析法进行藻蓝蛋白沉淀。硫酸铵溶液是常用的盐溶液，张以芳等也曾用硫酸镁、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵等盐溶液与硫酸铵溶液进行盐析比较，结果表明硫酸铵盐析效果好，其它几种盐析效果较差。胡一兵等用新鲜藻丝为原料和分段梯度盐析分离纯化藻蓝蛋白，经羟基磷灰石层析，能使提取的PC纯度大于普遍认可的标准。Siegleman研究认为采用不同浓度的硫酸铵溶液盐析还可以将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分开,而彭卫民的研究却认为无法用硫酸铵盐析将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分开。

藻蓝蛋白的提取物中杂质蛋白的含量很高,而藻蓝蛋白的纯度比(A620/A280)要达到4.0以上才具有实际应用价值。因此,还必须对粗提物进一步的分离纯化，提高藻蓝蛋白的纯度。韦萍等将藻蓝蛋白的粗提液分别通过DEAE-Sephadex A25和羟基磷灰石吸附上柱,并将藻蓝蛋白部分的洗脱液再一次进行HA柱层析后过G250柱的方法从极大螺旋藻中提取藻蓝蛋白。结果表明,采用自制的羟基磷灰石二次上柱可得到试剂级的藻蓝蛋白,纯度比达4.18,再经过G250柱层析可得成分单一的藻蓝蛋白。胡一兵等采用羟基磷灰石层析和SephadexG200凝胶层析得到纯度比大于5.0的藻蓝蛋白。殷钢等采用Sephacryl S200凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行分离纯化，得到藻蓝蛋白纯品。张成武等将经过两次HA柱层析纯化的藻蓝蛋白再经一次Sephadex G200柱层析过滤纯化可得电泳纯的藻蓝蛋白。殷钢等还研究了采用DEAE Sepharose F F离子交换和羟基磷灰石吸附从钝顶螺旋藻中分离纯化得到藻蓝蛋白，经鉴定该藻蓝蛋白为电泳纯。殷钢等曾采用羟基磷灰石和Sephadex G200进行柱层析，分离纯化出纯度比为4.71的藻蓝蛋白。彭卫民等用羟基磷灰石柱层析法对螺旋藻中藻胆蛋白进行纯化获得纯度较高的藻蓝蛋白。林红卫等先用硅藻土545柱分级洗脱、再用DEAE纤维素离子交换法进行纯化,从螺旋藻中获得纯度比为4.1的藻蓝蛋白。张建平等先用羟基磷灰石柱层析再过Sephadex G250的葡聚糖凝胶层析柱得到较纯的藻蓝蛋白。Ganapathi Patil等设计了一个简单而高效的操作方法，该方法包括两个步骤:双水相萃取和离子交换层析。结果从螺旋藻中得到的藻蓝蛋白粗提物，其纯度是1.18，经过双水相萃取步骤之后，其纯度是5.22，继续过离子交换层析，纯度从5.22上升到6.69。刘杨等研究了CTAB/正戊醇-正辛烷反胶团溶液萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白，藻蓝蛋白在该反胶团体系中的萃取效率和分配系数均较高。王勇等用盐泽螺旋藻变种经硫酸铵盐析、羟基磷灰石(HA)、DEAE–Sephadex A-25和Sephadex G-200柱层析可分离纯化出纯度为4.47的藻蓝蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为单条电泳带。

传统的藻蓝蛋白分离纯化方法的主要缺陷在于：（1）采用超声或高压均质等机械法处理藻粉，能耗高；（2）硫酸铵一步或多步沉淀蛋白法常需要1-2d的时间，而且容易造成蛋白变性，使目标蛋白损失率增大；（3）传统方法常需要多步色谱纯化步骤，才能获取高纯度藻蓝蛋白，不仅耗时长，而且因色谱填料的昂贵造成纯化成本的骤增。（4）许多藻蓝蛋白分离纯化的方法仅适用于实验室研究，而无法应用于工业化生产。因此必须研发一种供工业化生产藻蓝蛋白的生产技术。本发明的目的在于为克服传统藻蓝蛋白分离纯化分离效率低和产品纯度低的缺陷，提供一种工业化生产的高效的微藻藻蓝蛋白分离纯化的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可工业化生产、提取率高的藻蓝蛋白生产工艺。它包括以下步骤：

1、制备藻粉悬浊液：将单位质量的藻粉溶解于水中，制成藻粉悬浊液，干藻粉与水之间的质量配比关系为1：8-15；

2、藻细胞壁破碎：将步骤1中的藻粉悬浊液放置于冰库，反复冻融；在冻融液中加入试剂1、试剂2、试剂3，溶解2-8h,停3-12h，加试剂4，搅拌6-24h；其中加入试剂1、试剂2、试剂4与藻粉的质量比为0.1-1：0.02-0.4：0.1-1：1，藻粉与试剂3的比例为50kg藻粉中加入5-50ml试剂3；

3、通过板框过滤机和袋式过滤器过滤，收集滤液，袋式过滤器的孔径为0.5-10μm；

4、离心处理：滤液用离心分离机分离；

5、超滤膜浓缩：收集的离心液用超滤膜浓缩，

6、制备成品：浓缩液用喷雾器进行干燥或冷冻干燥或烘箱干燥，收集干粉。

其中，试剂1为氯化钙、氯化钾、硫酸铜中的任选一种；试剂2为酒石酸、碳酸氢钠、柠檬酸；试剂3为醋酸、次氯酸钠、草酸中的任选一种；试剂4为硫酸镁、磷酸氢二钠、硝酸钠中的任选一种；

其中：步骤1中干藻粉与水之间的质量配比关系为1：8-15。

步骤3中板框加压过滤后使用的过滤器为袋式过滤器，其孔径为0.5-10μm。

步骤4中离心机的转速6000-7000rpm。

步骤5中超滤膜的分子量为5000-30000D。

藻是指蓝藻门的螺旋藻、蓝藻水华，绿藻门的小球藻、浒苔，金藻门的微绿球藻。

制备成品：浓缩液干燥，收集干粉。

进一步详细的具体步骤为：

（1）、制备藻粉悬浊液：将藻粉溶解于水中，制成藻粉悬浊液；干藻粉与水之间的质量配比关系为1：8-15；

（2）、藻细胞壁破碎：将步骤1中的藻粉悬浊液放置于-18—-30℃冰库，反复冻融3-5次；在冻融液中加入试剂1、试剂2、试剂3，溶解2-8h,停3-12h，加试剂4，搅拌6-24h；其中加入试剂1、试剂2、试剂4与藻粉的质量比为0.1-1：0.02-0.4：0.1-1：1，藻粉与试剂3的比例为50kg藻粉中加入5-50ml试剂3；

（3）、收集滤液：通过板框过滤机和袋式过滤器过滤，收集滤液，袋式过滤器的孔径为0.5-10μm；

（4）、离心处理：滤液用转速为6000-7000rpm的离心分离机进行分离；

（5）、超滤膜浓缩：收集的离心液用分子量为5000-30000D超滤膜浓缩，

（6）、制备成品：浓缩液用喷雾器进行干燥或冷冻干燥或烘箱干燥，收集干粉，然后再用气流干燥。

其中，试剂1为氯化钙、氯化钾、硫酸铜中的任选一种；试剂2为酒石酸、碳酸氢钠、柠檬酸；试剂3为醋酸、次氯酸钠、草酸中的任选一种；试剂4为硫酸镁、磷酸氢二钠、硝酸钠中的任选一种。

产品纯度比(A620/A280)达到3.0-3.6；收率10-15%。

本发明的优点在于（1）整体工艺能耗底；（2）不易发生蛋白变性，减少目标蛋白损失；（3）纯化步骤简单，成本进一步降低；（4）产品纯度高；（5）可工业化生产。

具体实施方案

实施例1

1、制备螺旋藻粉悬浊液：将50kg螺旋藻粉溶解于400kg水中，制成螺旋藻粉悬浊液；

2、螺旋藻细胞壁破碎：将步骤1中的螺旋藻粉悬浊液放置于-18℃冰库，反复冻融4次；在冻融液中加入氯化钙35kg、酒石酸18kg、次氯酸钠40ml，溶解2h,停6h，加硫酸镁8kg，搅拌16h；

3、收集滤液：用板框过滤机过滤，然后再经过孔径为10μm的袋式过滤器过滤，收集滤液；

4、离心处理：滤液用转速为6000-7000rpm的离心分离机进行分离；

5、超滤膜浓缩：收集的离心液用分子量为5000D超滤膜浓缩，

6、制备成品：浓缩液用喷雾器进行干燥，收集干粉。

7、采用本工艺生产的螺旋藻藻蓝蛋白产品，其产品纯度高，纯度比(A620/A280)达到3.6；收率高达12%。

实施例2

1、制备小球藻藻粉悬浊液：将50kg小球藻藻粉溶解于500kg水中，制成小球藻粉悬浊液；

2、小球藻细胞壁破碎：将步骤1中的小球藻粉悬浊液放置于-18℃冰库，反复冻融5次；在冻融液中加入硫酸铜25kg、碳酸氢钠10kg、次氯酸钠10ml，溶解3h,停8h，加磷酸氢二钠15kg，搅拌12h；

3、收集滤液：用板框过滤机过滤，收集滤液，然后再经过孔径为3μm的袋式过滤器过滤，收集滤液；

5、超滤膜浓缩：收集的离心液用分子量为3000D超滤膜浓缩，

6、制备成品：浓缩液用冷冻干燥，收集干粉，然后再用气流干燥。

7、采用本工艺生产的小球藻藻蓝蛋白产品，其产品纯度高，纯度比(A620/A280)达到3.2；收率高达15%。

实施例3

1、制备蓝藻水华藻粉悬浊液：将50kg蓝藻水华藻粉溶解于600kg水中，制成蓝藻水华藻粉悬浊液。

2、蓝藻水华藻细胞壁破碎：将步骤1中的蓝藻水华藻粉悬浊液放置于-18℃冰库，反复冻融6次；在冻融液中加入氯化钾45kg、柠檬酸4kg、醋酸25ml，溶解2h,停6h，加磷酸氢二钠32kg，搅拌16h；

3、收集滤液：用板框过滤机过滤，然后再经过孔径为7μm的袋式过滤器过滤，收集滤液；

5、超滤膜浓缩：收集的离心液用分子量为5000D超滤膜浓缩，

6、制备成品：浓缩液用喷雾器进行干燥，收集干粉，然后再用气流干燥。

7、采用本工艺生产的蓝藻水华藻蓝蛋白产品，其产品纯度高，纯度比(A620/A280)达到3.3；收率高达10%。

实施例4

1、制备微绿球藻藻粉悬浊液：将50kg微绿球藻粉溶解于700kg水中，制成螺旋藻粉悬浊液。

2、微绿球藻藻细胞壁破碎：将步骤1中的微绿球藻藻粉悬浊液放置于-18℃冰库，反复冻融4次；在冻融液中加入氯化钙10kg、柠檬酸13kg、草酸24ml，溶解2h,停6h，加硝酸钠21kg，搅拌16h；

5、超滤膜浓缩：收集的离心液用分子量为5000D超滤膜浓缩，

7、采用本工艺生产的微绿球藻藻蓝蛋白产品，其产品纯度高，纯度比(A620/A280)达到3.0；收率高达13%。

Claims

1.一种用螺旋藻粉制备藻蓝蛋白的生产方法，其特征在于其步骤如下：

（1）、制备螺旋藻粉悬浊液：将50kg螺旋藻粉溶解于400kg水中，制成螺旋藻粉悬浊液；

（2）、螺旋藻细胞壁破碎：将步骤1中的螺旋藻粉悬浊液放置于-18℃冰库，反复冻融4次；在冻融液中加入氯化钙35kg、酒石酸18kg、次氯酸钠40ml，溶解2h,停6h，加硫酸镁8kg，搅拌16h；

（3）、收集滤液：用板框过滤机过滤，然后再经过孔径为10μm的袋式过滤器过滤，收集滤液；

（5）、超滤膜浓缩：收集的离心液用分子量为5000D的超滤膜浓缩制备成浓缩液；

（6）、制备成品：浓缩液用喷雾器进行干燥，收集干粉。