CN102911926A - 采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法 - Google Patents
采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102911926A CN102911926A CN201110223112XA CN201110223112A CN102911926A CN 102911926 A CN102911926 A CN 102911926A CN 201110223112X A CN201110223112X A CN 201110223112XA CN 201110223112 A CN201110223112 A CN 201110223112A CN 102911926 A CN102911926 A CN 102911926A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- affinity chromatography
- high purity
- enzymolysis
- trypsinase
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，包括生产用原料获取，原料粉碎、提取蛋白，分级盐析、酶原沉淀，粗品酶解，亲和层析分离纯化，超滤浓缩除菌，真空冷冻干燥得到成品。与现有技术相比，本发明体现出了亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(＞3000单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术，尤其是涉及一种采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法。
背景技术
胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有：分解液化血凝块、脓性分泌物、坏死组织等，能使脓液变稀，易于引流并能促进伤口愈合。
国内提取胰蛋白酶的工艺长期以来一直采用多重结晶结合透析的工艺，多重结晶工艺复杂、纯化能力弱，透析工艺耗时长、不便于规模化生产，以这种传统工艺生产的产品活性一般在2000-2500单位/毫克，最高只能达到2700单位/毫克左右。
根据分析，胰蛋白酶工艺未获得重大突破的原因有二：一是生产厂家的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动；二是亲和层析技术本身的技术难度使得开发以亲和层析工艺来制备胰蛋白酶的技术不是那么容易。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工业化的高效手段采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获取生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；
(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3-5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；
(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；
(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液，根据中国药典2010年版第二部的相应方法测定酶解液中胰蛋白酶的效价，进行质量跟踪；
(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；
(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；
(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品，成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定。
步骤(2)中所述的固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备，而非传统的布袋压滤。
所述的硫酸铵为试剂级溶剂。
步骤(4)中所述的酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。
步骤(5)中所述的亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，使用的层析缓冲液为0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液，使用的洗脱液为0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液，用这种创新的亲和层析纯化方法，可以一步纯化胰蛋白酶，是生产高纯度胰蛋白酶的关键。
所述的慈菇蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质。
步骤(6)中所述的超滤膜的截流分子量为10000。
步骤(7)中所述的真空冷冻干燥中酶液的冷冻温度为-40℃以下。
本工艺的路线如下所示：
新鲜冷冻牛胰或猪胰→粉碎提取→板框过滤→分级盐析→酶原沉淀→酶原酶解→亲和层析→超滤浓缩→除菌过滤→冷冻干燥→成品
与现有技术相比，本发明建立起一套生产规模的制备工艺，体现出了亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(＞3000单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
取新鲜冷冻牛胰150公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎。加入450L预冷的0.25N硫酸溶液，转移到1吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取3小时，放置过夜。次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液搅拌加入硫酸铵至30％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤得到提取液。在提取液中补充硫酸铵至70％饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到沉淀7.5公斤。用11.25L冰水溶解沉淀，再加3.75公斤的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5.0。在25℃下保温静置48小时，过滤得到滤液，再加20公斤的饱和硫酸铵溶液，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得酶原粗品2.5公斤。粗品用25L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入125mg胰蛋白酶(效价：3400单位/毫克)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将10L自制的亲和层析介质装柱，用30L 0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/小时；上样完毕，用30L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/小时，收集洗脱峰20L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至4.5L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到3350单位/毫克。
实施例2
取新鲜冷冻牛胰450公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆。加入1350L预冷的0.25N硫酸溶液，转移到2吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取5小时，放置过夜。次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，在清液中搅拌加入硫酸铵至30％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤得到提取液。在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到沉淀23公斤。用34.5L冰水溶解沉淀，再加11.5公斤的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5.0。在25℃下保温静置48小时，过滤得到滤液，再加60公斤的饱和硫酸铵溶液，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得酶原粗品7.2公斤。粗品用72L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入360mg胰蛋白酶(效价：3400单位/毫克)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将25L自制的亲和层析介质装柱，用75L 0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/小时；上样完毕，用75L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/小时，收集洗脱峰50L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至8L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到3435单位/毫克。
实施例3
采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
(1)生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；
(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入试剂级的硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；
(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；
(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液，根据中国药典2010年版第二部的相应方法测定酶解液中胰蛋白酶的效价，进行质量跟踪；
(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，慈菇蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质，用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；
(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，超滤膜的截流分子量为10000，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；
(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-40℃以下，即得到高纯度胰蛋白酶成品，成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定。
实施例4
采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
(1)生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；
(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入试剂级的硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；
(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；
(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液，根据中国药典2010年版第二部的相应方法测定酶解液中胰蛋白酶的效价，进行质量跟踪；
(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，慈菇蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质，用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；
(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，超滤膜的截流分子量为10000，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；
(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-40℃以下，即得到高纯度胰蛋白酶成品，成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定。
Claims (8)
1.采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获取生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；
(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3-5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；
(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；
(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液；
(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；
(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；
(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品。
2.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备。
3.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述的硫酸铵为试剂级硫酸铵。
4.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶，活性＞3300u/mg。
5.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，使用的层析缓冲液为0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液，使用的洗脱液为0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液。
6.根据权利要求5所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述的慈菇蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质。
7.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的超滤膜的截流分子量为10000。
8.根据权利要求1所述的采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(7)中所述的真空冷冻干燥中酶液的冷冻温度为-40℃以下。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110223112XA CN102911926A (zh) | 2011-08-04 | 2011-08-04 | 采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110223112XA CN102911926A (zh) | 2011-08-04 | 2011-08-04 | 采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102911926A true CN102911926A (zh) | 2013-02-06 |
Family
ID=47610506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110223112XA Pending CN102911926A (zh) | 2011-08-04 | 2011-08-04 | 采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102911926A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105983092A (zh) * | 2015-02-06 | 2016-10-05 | 吴平安 | 一种承压注药治疗前列腺炎的药物制备方法 |
| CN106754841A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-31 | 宁波林叶生物科技有限公司 | 一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法 |
| CN107488226A (zh) * | 2017-09-06 | 2017-12-19 | 成都晟博源生物工程有限公司 | 一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法 |
| CN110527679A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-03 | 宁波林叶生物科技有限公司 | 一种亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1944641A (zh) * | 2006-10-26 | 2007-04-11 | 上海林叶生物科技有限公司 | 高纯度糜蛋白酶的制备方法 |
-
2011
- 2011-08-04 CN CN201110223112XA patent/CN102911926A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1944641A (zh) * | 2006-10-26 | 2007-04-11 | 上海林叶生物科技有限公司 | 高纯度糜蛋白酶的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘贤进等: "转基因棉对棉铃虫幼虫生长及中肠蛋白酶活性的影响", 《植物保护学报》, vol. 30, no. 3, 30 September 2003 (2003-09-30), pages 233 - 2 * |
| 孟国良: "亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究", 《郑州牧专学报》, vol. 16, no. 3, 30 September 1996 (1996-09-30), pages 11 - 16 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105983092A (zh) * | 2015-02-06 | 2016-10-05 | 吴平安 | 一种承压注药治疗前列腺炎的药物制备方法 |
| CN106754841A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-31 | 宁波林叶生物科技有限公司 | 一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法 |
| CN107488226A (zh) * | 2017-09-06 | 2017-12-19 | 成都晟博源生物工程有限公司 | 一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法 |
| CN110527679A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-03 | 宁波林叶生物科技有限公司 | 一种亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1944641B (zh) | 高纯度糜蛋白酶的制备方法 | |
| CN102040531B (zh) | 一种提取l-异亮氨酸的方法 | |
| CN101613390A (zh) | 一种高纯度虫草菌素分离纯化的方法 | |
| CN102911926A (zh) | 采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法 | |
| CN103408657A (zh) | 藻蓝蛋白生产工艺及其产品 | |
| CN101376646A (zh) | 从发酵液中提取l-色氨酸的新方法 | |
| CN101869169B (zh) | 以鱼下脚料发酵耦合膜技术制备鱼低聚肽的方法 | |
| CN103709235B (zh) | 一种减少溶媒使用的提取高纯度恩拉霉素的方法 | |
| CN102550794A (zh) | 一种从棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法 | |
| CN104876824A (zh) | 一种从咖啡豆中分离纯化绿原酸的工艺 | |
| CN101230106B (zh) | 香蕉多糖的制备方法 | |
| CN104745666A (zh) | 一种提取l-谷氨酰胺的新工艺 | |
| CN101654413A (zh) | 三级膜串联提取分离l-异亮氨酸的方法 | |
| CN103275948B (zh) | 从牛或猪胰脏中提取四种酶的生产工艺 | |
| CN101095454B (zh) | 一种采用膜分离技术从谷物籽粒中分离蛋白质的方法 | |
| CN101302505B (zh) | 一种分离提取糜蛋白酶的方法 | |
| CN102516041A (zh) | 一种从天然橡胶乳清中提取白坚木皮醇的方法 | |
| CN102391117B (zh) | 一种利用杜仲叶制备绿原酸的方法 | |
| CN103539688B (zh) | 一种从谷氨酸棒杆菌发酵液中分离提取l-丝氨酸的方法 | |
| CN101914511B (zh) | 一种制备高纯度胰激肽原酶的方法 | |
| CN106754841A (zh) | 一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法 | |
| CN103992297B (zh) | 一种利普司他汀的制备方法 | |
| CN102702038B (zh) | 一种从紫菜中提取天然牛磺酸的方法 | |
| CN102863433A (zh) | 莫匹罗星的一种纯化方法 | |
| CN108191991A (zh) | 一种杏鲍菇多糖的提纯方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130206 |