CN107488226A - 一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法 - Google Patents

一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法 Download PDF

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贾雪荣
张文宝
王亚周
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Abstract

本发明公开了一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备提取大豆胰蛋白酶抑制剂初级上清液；(2)制备提取大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；(3)对大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物进行透析、纯化和洗脱后得到最终的大豆胰蛋白酶抑制剂。本发明通过对大豆浆液过滤、浸提并通过离心处理，能有效的确保大豆中的胰蛋白酶抑制剂分子不会流失；同时采用了分子的物理分离的方法来提取大豆胰蛋白酶抑制剂的粗提物，能更好的保护胰蛋白酶抑制剂分子不被破坏，有效的提高了大豆中胰蛋白酶抑制剂提供的质量，从而确保了胰蛋白酶抑制剂的质量、使用效果。

Description

一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法
技术领域
本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂的提取方法，具体是指一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法。
背景技术
大豆既是重要的粮食作物，又是主要的油料作物，还被用于畜禽饲料、食品和轻工业生产原料。而进年来，经科学家研究发现，大豆中所含的胰蛋白酶抑制剂不仅是一种能对人类的健康起到重要作用的保健品，而且在医学上也有着重要意义，具体的说大豆胰蛋白酶抑制剂在抗肿瘤、治疗糖尿病和调节胰岛素失调等方面都能起到重要的作用。
目前，科研人员多采用离子分离法来提取大豆胰蛋白酶抑制剂，这种方法是先将大豆浸泡液通过电解使阴离子和阳离子交换柱层析分离，然后对获得的各组分进行活性测定、SDS凝胶电泳和等电聚焦电泳分析，最后再次通过电解对大豆的离子进行分离后得到胰蛋白酶抑制剂。然而，这种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法存在容易破坏胰蛋白酶抑制剂分子的问题，导致提取的胰蛋白酶抑制剂质量较差，致使胰蛋白酶抑制剂的使用效果不理想。
因此，提供一种既能保护胰蛋白酶抑制剂分子，又能提高提取效率的大豆胰蛋白酶抑制剂提取方法便是当务之急。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的大豆胰蛋白酶抑制剂提取方法存在容易破坏胰蛋白酶抑制剂分子的缺陷，提供一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备大豆胰蛋白酶抑制剂初级上清液；
该初级上清液的具体制备步骤为：
(1.1)取干大豆加水浸泡过夜后磨碎并充分混匀成浆液；
(1.2)将步骤(1.1)中得到的浆液搅拌后加溶液用3层以上的纱布过滤，得到滤液和豆渣；
(1.3)对步骤(1.2)得到的滤液中以2-5：1.5的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠，直至滤液PH值达到4.5～6.0，对添加柠檬酸钠和磷酸三钠后的滤液进行浸提并水浴，水浴后离心去除杂蛋白，得到初级上清液；
(2)制备大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；
该大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的具体制备步骤为：
(2.1)将初级上清液加热，并在上清液中添加硫酸铵，直至硫酸铵浓度30％，搅拌后得到次级搅拌液；
(2.2)将次级搅拌液用滤纸过滤去脂，并将滤液静置过夜，即可得到粗提上清液；
(2.3)在粗提上清液中加入硫酸铵，直至硫酸铵浓度50％，搅拌沉淀后得到大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；
(3)对大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物进行透析、纯化和洗脱后得到最终的大豆胰蛋白酶抑制剂的制备步骤为：
(3.1)将大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物热溶，并在该热溶后的粗提物中加入平衡液，搅拌过夜后得到透析液；
(3.2)通过磷酸盐缓冲液和戊二醇以及磷酸缓冲液对透析液进行亲和层析住纯化，得到纯化液；
(3.3)通过洗脱缓冲液对纯化液进行洗脱，并最终得到胰蛋白酶抑制剂。
步骤(1.1)中的水选用50℃的去离子水，且去离子水与大豆的重量比例为5-7：3；步骤(1.2)的混合溶液中的柠檬酸钠为10～100mM，磷酸三钠为10～100mM，且柠檬酸钠与磷酸三钠的重量比例为1:1。
步骤(1.3)中对添加柠檬酸钠和磷酸三钠的溶液的浸提时间为24小时以上，浸提后采用80℃的热水对添加柠檬酸钠和磷酸三钠的溶液进行1小时左右的水浴，水浴后离心去除杂蛋白，最后得到初级上清液。
步骤(2.1)在初级上清液中添加硫酸铵时需将初级上清液加热至20-25℃，并在添加硫酸铵后的初级上清液冷却至4℃时匀速搅拌2-4小时，然后再以1000-8000r/min的转速搅拌10min；步骤(2.3)中对加入硫酸铵的粗提上清液搅拌时需在4℃的环境下进行2-4小时的搅拌，然后在4℃的环境下以1000-8000r/min的转速搅拌10min，沉淀后得到胰蛋白酶抑制剂粗提物。
步骤(3.1)中的平衡液为50mM、pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷hcl液和0.001-0.01mM的EDTA组成。
步骤(3.2)在对透析液进行亲和层析住纯化时，先取1～5g透析液溶解于100ml、0.05～0.5M和pH值为6.0～7.0的磷酸盐缓冲液中，缓慢吸附1～3小时后，加入浓度为1％～5％的戊二醇20～50ml搅拌均匀，交联4小时，再用0.1M、pH值为6.5的磷酸缓冲液洗涤至无胰蛋白酶活性，最后得到纯化液。
步骤(3.3)中的洗脱缓冲液为100ml、0.05～0.5M和pH值为4.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
本发明与现有技术相比具有以下的优点和有益效果：
(1)本发明通过对大豆浆液过滤、浸提并通过离心处理，能有效的确保大豆中的胰蛋白酶抑制剂分子不会流失，从而提高了本发明对大豆中的胰蛋白酶抑制剂提取的效率。
(2)本发明完全采用了物理分离的方法来提取大豆胰蛋白酶抑制剂的粗提物，能更好的保护胰蛋白酶抑制剂分子不被破坏，有效的提高大豆中胰蛋白酶抑制剂提供的质量，从而确保了胰蛋白酶抑制剂的使用效果。
(3)本发明的步骤简单、便于操作、实用性强，能很好的节约成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备提取大豆胰蛋白酶抑制剂初级上清液；
该初级上清液的具体制备步骤为：
(1.1)取干大豆加水浸泡过夜后磨碎并充分混匀成浆液；
(1.2)将步骤(1.1)中得到的浆液搅拌后加溶液用3层以上的纱布过滤，得到滤液和豆渣；
步骤(1.1)中的水选用50℃的去离子水，且去离子水与大豆的重量比例为5：3；步骤(1.2)的混合溶液中的柠檬酸钠为10mM，磷酸三钠为10mM，且柠檬酸钠与磷酸三钠的重量比例为1:1。
(1.3)将步骤(1.2)得到的滤液中以2：1.5的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠，直至滤液PH值达到4.5，对添加柠檬酸钠和磷酸三钠后的滤液进行浸提并通过离心去除杂蛋白，得到初级上清液；
步骤(1.3)中对添加柠檬酸钠和磷酸三钠的溶液的浸提时间为24小时以上，浸提后采用80℃的热水对添加柠檬酸钠和磷酸三钠的溶液进行1小时左右的水浴，水浴后离心去除杂蛋白，最后得到初级上清液。
(2)制备提取大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；
该大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的具体制备步骤为：
(2.1)将初级上清液加热，并在上清液中添加硫酸铵，直至硫酸铵浓度30％，搅拌后得到次级搅拌液；
步骤(2.1)在初级上清液中添加硫酸铵时需将初级上清液加热至20℃，并在添加硫酸铵后的初级上清液冷却至4℃时匀速搅拌2小时，然后以1000r/min的转速搅拌10min。
(2.2)将次级搅拌液用滤纸过滤去脂，并将滤液静置过夜，即可得到粗提上清液；
(2.3)在粗提上清液中加入硫酸铵，直至硫酸铵浓度50％，搅拌沉淀后得到大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；
步骤(2.3)中的搅拌时需在4℃的环境下进行2小时的搅拌，然后在4℃的环境下以1000r/min的转速搅拌10min，沉淀后得到胰蛋白酶抑制剂粗提物。
(3)对大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物进行透析、纯化与洗脱后得到最终的大豆胰蛋白酶抑制剂的制备步骤为：
(3.1)将大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物热溶，并在该热溶后的粗提物中加入平衡液，搅拌过夜后得到透析液；
步骤(3.1)中的平衡液为50mM、pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷hcl液和0.001mM的EDTA组成。
(3.2)通过磷酸盐缓冲液和戊二醇以及磷酸缓冲液对透析液进行亲和层析住纯化，得到纯化液；
步骤(3.2)在对透析液进行亲和层析住纯化时，先取1g透析液溶解于100ml、0.05M和pH值为6.0的磷酸盐缓冲液中，缓慢吸附1小时后，加入浓度为1％～5％的戊二醇20ml搅拌均匀，交联4小时，再用0.1M、pH值为6.5的磷酸缓冲液洗涤至无胰蛋白酶活性，最后得到纯化液。
(3.3)通过洗脱缓冲液对纯化液进行洗脱，并最终得到胰蛋白酶抑制剂。
步骤(3.3)中的洗脱缓冲液为100ml、0.05M和pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于：
步骤(1.1)中选用的去离子水与大豆的重量比例为5：3。
步骤(1.2)中的柠檬酸钠为70mM，磷酸三钠为70mM。
步骤(2.1)在初级上清液中添加硫酸铵时需将初级上清液加热至22℃，其搅拌3小时。
步骤(2.3)中的搅拌时需在4℃的环境下进行3小时的搅拌，然后在4℃的环境下以3000r/min的转速搅拌10min。
步骤(3.1)中选用的EDTA为0.006mM的EDTA。
步骤(3.2)在对透析液进行亲和层析住纯化时，先取3g透析液溶解于100ml、3.5M和pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中，缓慢吸附2小时后，加入浓度为5％的戊二醇50ml搅拌均匀。
步骤(3.3)中的洗脱缓冲液为100ml、0.25M和pH值为5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
实施例3
本实施例与实施例2基本相同，其不同点在于：
步骤(1.1)中选用的去离子水与大豆的重量比例为7：3。
步骤(1.2)中的柠檬酸钠为100mM，磷酸三钠为100mM。
步骤(2.1)在初级上清液中添加硫酸铵时需将初级上清液加热至25℃，其搅拌4小时。
步骤(2.3)中的搅拌时需在4℃的环境下进行4小时的搅拌，然后在4℃的环境下以8000r/min的转速搅拌10min。
步骤(3.1)中选用的EDTA为0.01mM的EDTA。
步骤(3.2)在对透析液进行亲和层析住纯化时，先取5g透析液溶解于100ml、0.5M和pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中，缓慢吸附3小时后，加入浓度为3％的戊二醇30ml搅拌均匀。
步骤(3.3)中的洗脱缓冲液为100ml、0.5M和pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
如上所述，便可以很好的实现本发明。

Claims (7)

1.一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备大豆胰蛋白酶抑制剂初级上清液；
该初级上清液的具体制备步骤为：
(1.1)取干大豆加水浸泡过夜后磨碎并充分混匀成浆液；
(1.2)将步骤(1.1)中得到的浆液搅拌后加入柠檬酸钠与磷酸三钠组成的混合溶液并用3层以上的纱布过滤，得到滤液和豆渣；
(1.3)在步骤(1.2)得到的滤液中，以2-5：1.5的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠，直至滤液PH值达到4.5～6.0，对添加柠檬酸钠和磷酸三钠后的滤液进行浸提并水浴，水浴后离心去除杂蛋白，得到初级上清液；
(2)制备大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；
该大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的具体制备步骤为：
(2.1)将初级上清液加热，并在上清液中添加硫酸铵，直至硫酸铵浓度30％，搅拌后得到次级搅拌液；
(2.2)将次级搅拌液用滤纸过滤去脂，并将滤液静置过夜，即可得到粗提上清液；
(2.3)在粗提上清液中加入硫酸铵，直至硫酸铵浓度50％，搅拌沉淀后得到大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；
(3)对大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物进行透析、纯化和洗脱后得到最终的大豆胰蛋白酶抑制剂的制备步骤为：
(3.1)将大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物热溶，并在该热溶后的粗提物中加入平衡液，搅拌过夜后得到透析液；
(3.2)通过磷酸盐缓冲液和戊二醇以及磷酸缓冲液对透析液进行亲和层析住纯化，得到纯化液；
(3.3)通过洗脱缓冲液对纯化液进行洗脱，并最终得到胰蛋白酶抑制剂。
2.一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，步骤(1.1)中的水选用50℃的去离子水，且去离子水与大豆的重量比例为5-7：3；步骤(1.2)的混合溶液中的柠檬酸钠为10～100mM，磷酸三钠为10～100mM，且柠檬酸钠与磷酸三钠的重量比例为1:1。
3.根据权利要求2所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，步骤(1.3)中对添加柠檬酸钠和磷酸三钠的溶液的浸提时间为24小时以上，浸提后采用80℃的热水对添加柠檬酸钠和磷酸三钠的溶液进行1小时左右的水浴，水浴后离心去除杂蛋白，最后得到初级上清液。
4.根据权利要求3所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，步骤(2.1)在初级上清液中添加硫酸铵时需将初级上清液加热至20-25℃，并在添加硫酸铵后的初级上清液冷却至4℃时匀速搅拌2-4小时，然后再以1000-8000r/min的转速搅拌10min；步骤(2.3)中对加入硫酸铵的粗提上清液搅拌时需在4℃的环境下进行2-4小时的搅拌，然后在4℃的环境下以1000-8000r/min的转速搅拌10min，沉淀后得到胰蛋白酶抑制剂粗提物。
5.根据权利要求4所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，步骤(3.1)中的平衡液为50mM、pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷HCl液和0.001-0.01mM的EDTA组成。
6.根据权利要求5所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，步骤(3.2)在对透析液进行亲和层析住纯化时，先取1～5g透析液溶解于100ml、0.05～0.5M和pH值为6.0～7.0的磷酸盐缓冲液中，缓慢吸附1～3小时后，加入浓度为1％～5％的戊二醇20～50ml搅拌均匀，交联4小时，再用0.1M、pH值为6.5的磷酸缓冲液洗涤至无胰蛋白酶活性，最后得到纯化液。
7.根据权利要求6所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法，其特征在于，步骤(3.3)中的洗脱缓冲液为100ml、0.05～0.5M和pH值为4.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
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