KR100690043B1 - 난황 유용성분의 연속적 분리 및 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난황의 유용성분을 연속적으로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 난황과 증류수를 1 : 6∼15의 부피비로 희석하고 최종 pH를 약 5.0으로 조절하여 원심분리한 후 상층액 및 침전물을 얻는 단계, 상기 상층액으로 부터 지질을 제거하고 pH 3.5 내지 5.0에서 한외여과법으로 농축시킨 후, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피로 IgY를 분리 및 정제하는 단계, 및 상기 침전물로부터 3 내지 10배 부피의 에탄올을 최종 농도 80 내지 90%가 되도록 혼합하고 원심분리하여 상층액으로부터 인지질을 추출하고, 침전물로 부터는 헥산 추출법 및 물 추출법으로 중성지질 및 난황단백질을 추출하는 단계를 포함하는 난황의 유용성분을 연속적으로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법으로 사용하면, 계란의 유용성분 분리시 잔여물의 폐기없이 경제적으로 연속적으로 계란의 유용성분을 분리할 수 있어 계란을 경제적으로 이용할 수 있는 장점이 있다.

난황, IgY, 인지질, 중성지질, 정제, 분리방법

Description

난황 유용성분의 연속적 분리 및 정제 방법{Method of seqeuntial separation and purification of value-added components from chicken egg yolk}

도 1은 본 발명에 따라 난황으로부터 IgY를 분리하는 단계를 개략적으로 나타낸 흐름도이다.

도 2는 본 발명에 따라 난황으로부터 지질을 분리하는 단계를 개략적으로 나타낸 흐름도이다.

도 3은 본 발명에 따라 분리된 IgY를 웨스턴 블럿(western blot)을 통해 확인한 사진이다.

도 4는 본 발명에 따라 분리된 지질의 분획을 나타내는 사진이다.

본 발명은 난황 유용성분의 순차적 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 난황으로부터 특정 성분의 추출 후 잔여물의 폐기없이, 난황 유용성분의 화학적, 물리적 변화를 최소화시키면서 순차적인 단일 과정으로 분리할 수 있는 난황 유용성분의 연속적 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 계란의 생산량은 증가한 반면, 산업화가 이루어진 나라들에서 는 지난 10년간 계란의 소비량에 변화가 없거나 소폭 감소하는 추세를 보이고 있는 실정이다. 특히 계란의 콜레스테롤이 성인병의 주요 원인으로 지목되면서 소비량 변화에 영향을 주는 것으로 여겨지고 있다. 한편, 우리나라에서도 계란 소비의 정체에 따른 치열한 경쟁으로 인해 지난 30년간 계란 가격은 소비자 물가 상승에도 미치지 못하는 수준(1970년 기준 2000년도 계란 물가변동율은 소비자 물가변동율의 절반이하임)으로 형성되어 양계 농가의 수익성이 크게 악화되고 있는 실정이다. 따라서, 계란의 이용방법을 다양화하여 부가가치를 증대시키고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 이러한 시도들은 국내외에서 이루어지고 있는데, 계란 전체를 발효시키거나 다양한 부재료를 혼합 가공하거나, 또는 난황과 난백을 분리하여 특성에 따라 가공하는 것 등이 있다. 한편으로는 생명공학적 기법을 도입하여 유용한 특정 성분을 선택적으로 대량 함유하는 계란을 생산하여 상기 특정성분을 추출하려는 시도가 다양하게 이루어지고 있다. 최근 계란의 성분별 추출, 분리를 통한 유용성분의 상품화는 북미, 일본 및 유럽 각국을 중심으로 활발하게 진행되고 있다. 국내에서도 인지질, 면역항체를 중심으로 상용화가 활성화되고 있으며 그 규모가 증가되는 추세이다. 특히, 식품 산업에서는 기존의 화학 합성에 의한 인공 첨가물 대신 계란 성분의 대체 가능성이 증대될 수 있다.

한국공개특허 제2003-68728호에는 췌장 아밀라제를 항원으로 사용하여 산란계에서 난황항체를 생산하고 이를 이용한 식이 탄수화물의 흡수 억제용 조성물을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있으며, 한국특허 제280333호는 가축의 설사를 유발하는 대장균 K987P 필리 항원에 특이적으로 결합하는 난황항체를 분리하는 방법 에 대해 개시하였고, 한국특허 제392566호에는 여드름 유발균에 대한 특수 면역 단백질을 함유하는 계란을 생산하고 분리하여 화장품에 포함시켜 여드름 질환예방 피부용 화장품을 제조하는 방법에 대해 개시하고 있다.

계란의 난황은 61%의 지질, 30%의 단백질, 4%의 수분 및 그 외 3%로 이루어지며, 크게는 수용성 및 지용성으로 나눌 수 있다. 상기 수용성 성분에는 항체 및 기타 수용성 단백질, 펩타이드류 등이, 지용성 성분에는 레시틴 및 기타 유용한 지질이 존재한다. 이중 난황 지질은 주로 중성 지질(65%), 인지질(32%) 및 콜레스테롤(3%)로 나눌 수 있다. 상기 중성 지질은 난황 지질의 주요 성분이며 식품 오일이나 동물의 사료로 이용된다. 계란의 오일은 영양면에서 식물성보다 우수하여 상업적으로도 이용가치가 높다.

한편, 계란의 유용성분을 분리 및 정제하는 방법에 대한 다양한 연구가 수행되었는데, 한국공개특허 제2003-18428호에는 특수 면역항체가 강화된 계란의 난황과 증류수를 일정비율로 희석하고 최종 pH를 조절하여 원심분리한 후 상등액을 취하고 4.1M 황산암모늄과 상등액을 2:3으로 혼합하여 원심분리하고 침전물을 증류수에 투석한 후 동결건조하여 고순도의 IgY를 정제하는 방법을 기술하고 있다. 또한, 한국특허 제370979호는 난황에 탈당처리한 후, 건조하여 얻은 건조 난황에 초임계 이산화탄소를 접촉시켜서 콜레스테롤 함유량이 적은 건조난황을 얻고 이어서, 상기 건조난황을 알콜 추출하여 추출액에서 알콜을 제거하여 인지질 함유율이 80% 이하이고, 보존 중 갈색변화가 생기기 어려운 난황인지질 조성물에 대해 기술하고 있으며, 한국특허 제406870호에는 침전법을 이용해 난황의 유용 수용성 성분을 분리하 고 침전부산물을 이용하는 방법에 대해 기술하고 있는데, 난황과 난황부피의 7 내지 10배의 물을 가하고 염과 산으로 pH를 5.0 내지 5.5로 조정시킨 난황 수용액을 얻고, 규조토를 난황 수용액의 2 내지 40(w/v)%로 첨가하고 교반, 일정시간 정치시켜 난황 지질-규조토 복합 침전물을 형성시킨 후, 상등액을 회수하여 난황 수용성 성분을 분리 정제하며, 상기 난황 지질-규조토 복합 침전물에 유기용매를 가한 후 압착 여과하여 난황의 지용성 성분을 분리하는 방법에 대해 기술하고 있다.

그러나, 상기 방법들은 난황의 특정 유용성분을 분리한 후 잔여물은 폐기하거나, 수용성 성분을 분리하고 지용성 성분은 사용하지 않았으며, 따라서, 특정 성분을 추출하여 분리한 뒤 잔여물을 폐기하는 것보다는 특화된 유용 성분 추출공정을 계열화하여 종합적인 추출, 분리 및 이용의 효율성을 극대화할 필요가 있었다. 다시말해서, 이전의 연구는 대부분 특정 성분 한가지만을 추출 후 정제하여 이용하는 데 연구의 중점을 두었으며, 연속공정에 의한 계란의 부가가치 증대 및 자원 활용적인 차원에서의 연구는 전무하였다. 기존에 특정성분을 최대한 취사선택하기 위해서 여러 가지 보조재를 사용하였는데, 특정 성분의 분리 후 이러한 보조재를 다시 분리하기 위한 단계가 더욱 필요하였을 뿐만 아니라, 이를 분리해 내기도 어려웠으며, 상기 보조재의 존재는 식품으로 이용 가치를 감소시키는 단점이 있었다.

한편, 난황으로부터 분리되는 IgY, 인지질, 중성지질, 및 단백질들은 고순도로 분리되면 그 용도가 매우 다양하며, 현재는 특히 인지질이 가장 활발하게 상품화가 이루어지고 있으며, 최근에는 IgY 분리와 그 이용에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 공정상의 어려움 및 경제성의 문제로 IgY를 분리해서 이용하는 경우는 드물고, 상술한 바와 같이 생물공학적 기법을 이용해 IgY 함량을 증대시킨 계란을 만들어 곧바로 이용하고 있다. 인지질의 경우, 알콜과 아세톤 추출을 통해 인지질 함량을 높인 제품을 생산하고 있으며, 최근에는 중성 지질을 헥산으로 추출하여 이용하려는 시도가 이루어지고 있는 것으로 보이나, 대부분의 잔여물은 동물 사료로 단순 이용되고 있는 실정이다. 즉, 현재까지 특정 성분 분리만을 목적으로 분리공정이 이루어져 목적하는 성분이외의 다른 성분에 변화를 야기하고 추후 이용성에 상당한 영향을 미치게 되었다. 따라서, 특정성분의 분리 공정으로 인해 그 외 다른 성분이 물리적, 화학적으로 변화되지 않도록, 식품으로서 사용할 수 있는 인체에 무해한 성분으로 난황의 유용성분을 계통적으로 분리하여 이용할 수 있는 방법이 요구되어왔다.

상술한 문제를 해결하기 위한 연구를 수행한 결과, 본 발명에서는 난황으로물희석법을 통해 난황항체를 얻고 잔여 침전물로부터 유기용매 추출법으로 지질을 분리하여, 특정 성분을 추출한 후 잔여물을 폐기하지 않고 유용한 성분을 연속적으로 분리하여, 계란을 경제적으로 사용할 수 있었으며, 본 발명은 이를 기초로 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 경제적으로 특정 성분 분리 후 잔여 성분의 폐기없이 난황의 유용성분을 연속적으로 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 난황 유용성분을 연속적으로 분리 및 정제하는 방법은 난황과 증류수를 1 : 6∼15의 부피비로 희석하고 최종 pH를 약 5.0으로 조절하여 원심분리한 후 상층액 및 침전물을 얻는 단계, 상기 상층액으로 부터 지질을 제거하고 pH 3.5 내지 5.0에서 한외여과법으로 농축시킨 후, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피로 IgY를 분리 및 정제하는 단계, 및 상기 침전물로부터 3 내지 10배 부피의 에탄올을 최종 농도 80 내지 90%가 되도록 혼합하고 원심분리하여 상층액으로부터 인지질을 추출하고, 침전물로 부터는 헥산 추출법 및 물 추출법으로 중성지질 및 난황단백질을 추출하는 단계를 포함한다.

이하 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 상술한 바와 같이, 난황의 유용성분을 연속적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.

상기 유용성분은 난황의 IgY, 인지질, 중성지질, 및 난황단백질을 의미하며, 본 발명에서는 연속적으로 IgY, 인지질, 중성지질 및 난황단백질 순으로 분리한다.

우선 IgY의 분리 및 정제는 도 1의 순서에 따른다. 먼저, 물희석법에 따라 수용성 분획의 분리를 위해서 난황과 물의 부피 비율을 1 : 6∼15 로 하여 난황을 희석하며, 지질단백질의 양을 감소시키고 IgY 수율을 높이기 위해 예를 들어, 1N HCl을 사용하여 산성 조건(예를 들어, pH 약 5.0)으로 조절한다. 상기 희석배수를 증가시킬수록 이온강도가 낮아져 지질 단백질의 침전이 용이하나, 희석배수를 너무 높게 하면 후속공정인 IgY 정제를 위한 비용이 증가하게 된다. 따라서 난황으로부터 물침전법을 통해 IgY를 분리한 후 농축하여, 물에 녹지 않는 침전물로부터 다른 유용성분을 계통적으로 분리하는 단계를 효과적으로 수행하기 위해서는 난황과 물의 부피비가 1 : 6∼15, 바람직하게는 1 : 10으로 희석하는 것이 이후 수행되는 일련의 공정과의 연관성, 물리적, 화학적 특성변화의 최소화, 및 경제적 측면에서 가장 바람직하다. 한편, 상기 pH를 산성조건으로 유지시키면 지방구들간의 응집이 잘 일어나면서 수용액층과 분리가 잘 일어나게 되며, 인지질이 쉽게 침전되어 이후 단계인 한외여과시 필터 구멍이 막히는 것을 방지하므로 수용성 단백질 용액의 분리가 잘 일어날 수 있다. 그러나 상기 pH가 5.0보다 낮은 pH에서는 단백질이 변성될 수도 있으므로, 본 발명에서 바람직한 pH 범위는 약 5.0을 전후하는 범위이다.

상기 물로 희석된 난황을 교반하고, 이후 2,800×g, 4℃에서 40분간 원심분리하여 수용성층과 지용성층을 분리하게 된다. 상기 수용성층으로부터 잔존하는 지질은 검, 펙틴 또는 하이드록시프로필메틸셀루로스 프탈레이트 등을 처리하여 더욱 제거할 수 있다.

상기 물희석법으로 분리된 수용성 분획으로부터 IgY를 분리하고 농축하기 위해 한외여과법(ultrafiltration)을 수행하였다. 여과시 수용액중에 잔존하는 지질에 의한 필터의 막힘으로 인한 분리효율 저하를 방지하기 위해 pH는 3.5 내지 5.0, 바람직하게는 pH 4.5로 유지시키는 것이 바람직하다. 통상적으로는 상기 물희석법 후 교반하여 IgY를 함유한 상층액의 부피를 줄이고 단백질을 침전시키기 위해 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전법을 사용하나, 계통적으로 IgY 이외의 다른 성분들을 분리하는 공정을 수행하기 위해서는 한외여과법으로 IgY를 함유한 상층액을 농축하는 것이 효과적이며, 상기 암모늄설페이트 또는 에탄올 침전법은 대량생산시에 는 부피가 상당히 증가되므로 바람직하지 않다. 한편, 한외여과 수행한 여액에 존재하는 고형분은 재회수하여 이용할 수 있다.

상기 IgY를 더욱 정제하여 활성을 증가시키기 위해 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하며, 최종적으로 황산암모늄 침전법으로 농축시키고 투석을 수행할 수 있다. 이렇게 분리 및 정제된 IgY는 그 순도가 약 88%로 높게 나타났다. 또한, 최종 수율은 86%였다.

한편, 도 2에는 상기 물희석법으로 분리된 불용성 분획으로 부터는 인지질, 및 중성지질을 분리한다. 이때 에탄올, 아세톤 및 헥산 추출을 통해 분리하게 되는데 상기 에탄올을 불용성 분획에 대해 3 내지 10배 부피로 사용하며 최종 농도는 80 내지 90%가 인지질을 추출하기 위한 최적의 조건이다. 또한, 아세톤을 처리하여 중성지질 또는 콜레스테롤을 순차 제거하여 인지질의 수율과 순도를 더욱 높일 수 있다.

상기 에탄올로 추출하고 남은 분획을 헥산으로 추출하여 중성지질을 분리하였다. 이때 사용되는 헥산의 양은 용해도를 고려하여 지질을 충분히 추출할 수 있는 범위에서 경제성을 고려하여 최소화하는 것이 바람직하며, 따라서, 에탄올 분획물에 대해 4배 부피가 가장 바람직하다. 상기 헥산 추출 과정을 반복 수행하여 수율을 높힐 수 있다.

상기 인지질을 추출하고 남은 잔여부분은 주로 중성지질과 단백질로 이루어져 있다. 헥산 추출을 통해 중성지질을 분리할 수 있으나, 단백질의 변성과 헥산 추출설비비의 과다로 이용성이 떨어지며 경제적으로도 비효율적이다. 따라서, 에탄 올로 추출하고 남은 잔여물을 충분한 물(예를 들어,잔여물 무게비에 약 3배)에 용해시켜서 교반하면서 방치하면 지방구가 표면으로 부유하여 응집하므로 중성지질의 분리가 일어나게 된다. 상기 지방구가 응집된 상층액을 분리하고 유기산등으로 pH를 조절하여 지방구 주변에 붙은 단백질을 분리하고 물로 수차례 세척하여 지방층을 더욱 분리한 후, 분무 건조하면 분말화된 난황 단백질을 얻을 수 있다.

이렇게 본 발명의 방법을 사용하면 경제적으로 단순화된 단계를 통해 효율적으로 계란의 유용성분을 화학적, 물리적 변화를 최소화시켜 한번에 분리 및 정제할 수 있는 효과가 있어, 식품으로 사용할 수 있는 인체에 무해한 성분으로 사용될 수 있는 장점이 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같으나, 본 발명의 범주가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

계란의 난백과 난황을 분리하고, 준비한 난황으로부터 IgY를 분리하였다.

우선 난황과 증류수의 비율이 1 : 10(v:v)이 되도록 혼합하고 1N HCl로 최종 pH를 5.0으로 맞추었다. 이후, 4℃에서 2,800×g로 상기 혼합물을 40분간 원심분리하여 수용성 상층액을 취하였으며, 지용성 침전층은 지질과 단백질 분리에 사용하였다.

먼저, 상층액으로부터 IgY를 분리하였는데, 상층액 1ℓ에 지질을 제거하기 위해 1g의 카라기난을 22℃에서 20분간 처리하였다. 지질이 제거된 상기 상층액을 농축하기 위해 한외여과법을 수행하였다. 한외여과법을 수행한 후, 카복시메틸(CM) 셀루로즈 컬럼을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 IgY를 더욱 정 제하였다. 이 때 사용된 완충 용액으로는 세척을 위해서는 20mM의 citrate-phosphate buffer (pH5.0), 용리(elution)완충용액으로는 200mM의 citrate-phosphate buffer(pH6.4)를 사용하였다. 이후, 최종 IgY를 투석하고 동결건조하였다. 하기 표 1에는 IgY의 각 정제 단계에 따른 IgY의 수율 및 순도를 나타내었다.

한편, 상기 지용성 침전물에 4배 부피의 100% 에탄올을 가하고, 4℃에서 2,800×g로 15분간 원심분리를 수행하였다. 상기 상층액으로부터 인지질을 추출하였으며, 상기 침전물로부터 중성지질 및 단백질을 분리하기 위해서 4배 부피의 헥산을 가하여 중성지질과 단백질을 분리하였다. 헥산 추출 과정은 3번 반복하였다. 추출된 지질층에서 용매를 증발시킨 후, 85%의 에탄올을 가하여 60℃의 수욕조에서 용해시키고, 인지질과 중성지질을 다시 분리하였다. 이렇게 분리된 인지질과 중성지질의 순도 및 수율은 표 2에 나타내었다.

정제 단계	수율(%)	순도(%)
물희석	100	41
한외여과(농축)	100	41
양이온 교환	80 - 90	85 - 90
투석 및 동결건조	86	88

	수율(%)	순도(%)
인지질	≥ 95	≥ 95
중성지질	≥ 90	≥ 95

실시예 2

웨스턴 블랏팅(western blotting)

실시예 1로부터 분리한 IgY를 웨스턴 블럿을 실시하여 확인하였다. SDS PAGE(7% SDS)에 의해 분리된 단백질 밴드는 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 전이시킨 후 Alkaline phosphate conjugated Anti chicken IgG를 이용하여 IgY와 반응시켰다. 색깔은 Biorad사의 Alkaline phosphate conjugate kit를 이용하여 발현시켰다. 1% Tween 20 buffer로 세척하였으며, blocking step은 3%의 탈지분유를 PBS Tween buffer에 타서 사용하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

실시예 3

실시예 1에서 알코올로 추출하고 남은 침전물에 3배(무게비)의 물을 가한 뒤 3분간 교반한다. 그 후 60℃에서 4시간동안 천천히 교반하면서 지방구가 분리되어 표면에서 응집된 중성지질을 분리한다. 지방구가 응집된 상층액을 분리하여 유기산으로 pH를 3.0으로 조정하여 지방구 주위에 붙어 있는 단백질을 분리한 뒤 물로 수차례 세척하여 지방층을 깨끗이 분리한다.

본 발명에 따른 방법을 사용하면, 기존에 인체에 유해한 보조재 등의 사용하는 특정성분의 분리 목적으로 사용된 공정에 의해 물리, 화학적으로 변화되어 사용할 수 없었던 계란의 다른 유용성분을 폐기하지 않고 경제적이며 효율적으로 분리할 수 있으며, 이렇게 분리된 계란의 유용성분은 인체에 무해한 식품원료 등으로 제공될 수 있는 장점이 있다.

Claims (2)

1. 난황과 증류수를 1 : 6∼15의 부피비로 희석하고 최종 pH를 약 5.0으로 조절하여 원심분리한 후 상층액 및 침전물을 얻는 단계, 상기 상층액으로부터 지질을 제거하고 pH3.5 내지 5.0에서 한외여과법으로 농축시킨 후, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피로 IgY를 분리 및 정제하고 여액의 고형분을 회수하는 단계; 및

   상기 침전물로부터 3 내지 10배 부피의 에탄올을 최종 농도 80 내지 90%가 되도록 혼합하고 원심분리하여 상층액으로부터 인지질을 추출하고, 침전물로 부터는 헥산 추출법 및 물 추출법을 통해 중성지질 및 난황 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 난황으로부터 유용성분을 연속적으로 분리 및 정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 지질 제거는 검, 펙틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀루로스 프탈레이트를 첨가하여 원심분리시키는 것을 특징으로 하는 난황으로부터 유용성분을 연속적으로 분리 및 정제하는 방법.

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