JPH03502921A - 乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラクトフェリンの純粋な画分の抽出法 - Google Patents
乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラクトフェリンの純粋な画分の抽出法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラクトフェリンの純粋な画分の抽出法
本発明は、乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラクトフェリンの純粋な画
分の抽出法に関する。乳清とはスキムミルクとホエーの両者を意味する。
チーズの製造では、多量のホエーが副生成物として得られる。ホエーの乾燥固形
物含量は約Ｂ％であり、はぼ下記のようなものから構成されている。
重量％
ラクトース ４．８タン白質
０．Ｂ１その中のラクトペルオキシダーゼ ０．００２０ラクトフエ
リン ０．００３０脂肪 ０．
０５ （分離後）塩 ０．７固形物
含量 約ｅ、。
乾燥固形物含量の約１０〜１２％を構成するタン白質画分は、多数の異なるタン
白質成分から成っている。最大のものは、β−ラクトグロブリン、α−ラクトア
ルブミンおよびウシ血清アルブミンである。多数の生物活性成分も、タン白質画
分に属し、例えば免疫グロブリン、ラクトペルオキシダーゼ、ラクトフェリンお
よびリゾチームである。
ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンは、抗菌活性を有する。食品技術にお
ける新たな情況においておよび化学技術や医学の分野で用いられる天然の抗菌性
物質の抽出に大きな関心が持たれている。
スキムミルクとホエーでは（および元のミルクでは）これらの物質の含量は低い
。ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンの含量は、ウシの授乳状態によって
変わるが、１５〜５０■／リツトルで含まれる。したがって、これらの生物活性
成分をキログラムの量で抽出し易くするには、多量のホエー（ミルク）を濾過し
なければならない。
ミルク／ホエーからラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンをそれぞれ単離す
るためのプロセス工学条件は、これら２種類のタン白質の等電点（ｐりが約９．
５であるが、ホエータン白質の主要部分の等電点は約５．１〜５．４であり、カ
ゼインの等電点は約４．８であるという事実に基づいている。それ故、ラクトペ
ルオキシダーゼとラクトフェリンを分離するのに基本的に好適な方法は、ミルク
／ホエーをｐＨ＜８で陽イオン交換体と接触させて選択的に吸着させることであ
り、この場合に、ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンとの真の正電荷を用
いてこのｐＨで陰電荷を有する他のミルクタン白質と区別するのである。
研究のために少量でラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンを単離する伝統的
な方法は、しばしばゲル濾過と組み合わせて使用される沈降法およびイオン交換
クロマトグラフィを用いる方法であり、モリソン、エム（Ｍｏｒｒｊｓｏｎ、
Ｍ、）、ハミルトン、エイチ争ビー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ。
Ｈ−Ｂ、）、シュトッツ、イー（Ｓｔｏｔｚ、 Ｅ、） 、Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ、、 ２２８： ７６７ （１９５７）；モリソン、エム（Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎ。
Ｘ、）、フルトクィスト、ビー・イー（Ｈｕｌｔｑｕｉｓｔ、 Ｐ−Ｅ）、Ｊ、
Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ２３８： ２８４７ （１９６３）を参照された
い。これらの方法は、経済的に擁護し得る程度に前記の生物活性を有する成分を
多量に調製するのには適さない、米国特許第４，４３８．６５８号明細書（ベヴ
ロスセット（Ｐｅｖｒｏｓｕｓｅｔ））には、シリカカラムによるカゼイン不含
乳清（ホエー）からのラクトフェリンの吸着が開示されている。乳清のｐＨを７
．７〜８．２に調整した後、カラムに吸着させるのである。免疫グロブリン、ラ
クトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼがカラムに付着する。
吸着工程の後に、ｐＨ＜４の希釈した塩溶液で溶出を行う。吸着したタン白質は
、特にラクトペルオキシダーゼに関しても選択的には溶出しない。約５ｇ−のシ
リカを保持するカラムでは、ホエー１リツトルを処理することができる。この先
行技術による方法は、工業的規模での適用には適さないものと考えねばならない
。
ザグルスキイ（Ｚａｇｕｌｓｋｉ）らは、Ｐｒａｃｅ ｉｎ ｍａｔｅｒｉａｌ
ｙＺｏｏｔｅｃｈｎｉｃｚｎｅ、 ２０． （１９７９）、８７〜１０３頁にラ
クトフェリンを得るバッチ法であって、弱陽イオン交換体を用いてこれをミルク
と混合する方法を記載している。平衡に達したならば、イオン交換体をカラムに
入れて、吸着したタン白質を塩溶液で溶出させるのである。したがって、この方
法はバッチ法に基づいており、高純度のラクトフェリンを得るには第二のイオン
交換工程で更に精製を行わなければならない。
同様な方法はベルギー国特許第９０１．６７２号明細書（ジエイ・ビー・ブリー
ルス（Ｊ、Ｐ、 Ｐｒ１ｅｅｌｓ）とアール・パイパー（Ｒ，Ｐｅ１ｐｐｅｒ）
、オレフィナ・ニス争エイ（ＯＩｅｆｌｎａＳ、Ａ、） ）に記載されている。
この方法では、アルギン酸カルシウムを基剤とするイオン交換体であって、イオ
ン交換官能価をジルコニウム、チタン、石英またはアルミニウムの酸化物の添加
によって得たものが用いられる。
ミルク／ホエーを充填カラム中でイオン交換体と接触させ、またはタンク中で混
合することによって、等電点が７．５より高いタン白質を吸着させる。平衡に達
したならば、ゲルを機械的に分離して洗浄装置に供給し、塩化カルシウム溶液で
溶出させる。アルギン酸カルシウムと接触する総ての流体は少なくとも０．１％
のＣａ Ｃ１２を含み、ゲルが溶解するのを防止するものでなければならない。
ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンはこの溶出では分別されないが、別の
精製工程で分別を行わなければならない。
カラム法で商業的に確立されたイオン交換法で処理されない理由として、前記の
ベルギー国特許明細書は、媒質中に球状の脂肪とタン白質の凝集体の粒子が発生
することによってイオン交換体の目詰りを生じるという克服し難い問題点を挙げ
ている。
英国特許第２．１７９，９４７号明細書には、ミルクからのラクトトランスフェ
リン抽出法が開示されている。この方法を行って、ホ二一に限外濾過を施すこと
によって（ラクトトランスフェリンを含有する）ホエーのタン白質含量を約５倍
に濃縮した後、そのｐＨとイオン強度を調製するようにする。こうして処理され
た乳清を非常に低速度（約０，０３床容積／分）でイオン交換カラム、好ましく
は弱陽イオン交換体を通過させる。このカラムを、ラクトフェリンが溶出される
ときに０．４Ｍまで増加するイオン強度勾配を有する溶液で低速度で溶出させる
。これは小規模法であり、ラクトフェリンを工業的な製造には適さない。弱陽イ
オン交換体を使用することによって、容量が低くなる。天然の乾燥固形物含量に
転換された１００、床容積の量のホエーを、それぞれの溶出の間にイオン交換カ
ラムを通過させることができる。脂肪とタン白質粒子１こよって生じるイオン交
換フィルターの目詰りの問題は、この先行技術法によっては解決されてはいない
。
ホエー／スキムミルクからラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンを経済的に
回収するには、工業的に適用可能な方法に次のような要件を与えることができる
。
（１） 吸着マスの選択的処理能力が高い。ラクトペルオキシダーゼ／ラクト
フェリンの乳清中での含量は低いので、１回の溶出で処理することができる乳清
の容積は大きくなければならない。
（２） 吸着相における流量が高い。（通常のクロマトグラフィ法では低速、
０．０１〜０，１０床容積／分で処理するのが普通である）。この理由は、粒度
が小さいため、床は通常は圧降下が大きく、吸着法の反応速度には流量を高くす
る必要があることがしばしばあるからである。
（３） この方法は衛生的でなければならず、これは吸着マスは少なくともｐ
Ｈ１３〜１４の灰汁で処理しなければならないことを意味する。
本発明の目的は、乳清（ホエー）からラクトペルオキシダーゼとラクトフェリン
の純粋な画分を抽出するための前記の要件を満足する方法を得ることである。
本発明は、乳清からのラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンの純粋な画分を
抽出する方法に関し、この方法は乳清をマイクロ濾過し、これを高流量で強陽イ
オン交換体を通過させ、ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンを異なる濃度
を有する塩溶液で選択的に連続的に溶出させることを特徴とする。
本発明によれば、単一のイオン交換工程で２種類の異なる血清タン白質の純粋な
画分を調製する方法が提供される。これは、以前は工業的規模では行われていな
かったものである。先行技術による工業的規模でこれらのタン白質を抽出する方
法では、２または３の精製工程を必要とした。
血清またはホエー中で球状脂肪およびタン白質凝集体のような粒子の生成によっ
て起こるイオン交換体の目詰りの上記の問題は、乳清（ホエー）をマイクロ濾過
（例えばいわゆる十字流濾過法）した後、イオン交換床に接触させる本発明によ
って解決される。マイクロフィルターの好適な細孔度を選択することによって、
目詰りを引き起こす脂肪とタン白質の凝集体粒子を除去することができる。好適
なマイクロフィルターの細孔直径は０．ｌＯ〜２−１好ましくは０．４〜１．５
−である。
本発明による方法の出発材料としては、乳清（ホエー）すなわち脂肪とカゼイン
を除いたミルクが用いられる。
乳清を最初にマイクロ濾過によって処理して、脂肪とタン白質凝集体粒子の残渣
をいわゆる十字流法で除去する。
マイクロ濾過を行った乳清を、次に高速（約１〜１．５床容積／分）で強陽イオ
ン交換体であって、ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンを選択的に吸着す
るものを充填したカラムを通過させる。この陽イオン交換体は、優れた速度およ
び吸着速度特性と、乳清の約１０００床の容量を有する。これは、最も弱く結合
しているラクトペルオキシダーゼが漏出する、すなわちイオン交換マスがこれら
のタン白質で飽和されるまでに約１０００床容積の乳清か通過することができる
ことを意味する。吸着相の初めと終りとの間には、圧降下は極僅かしか増加しな
い。
イオン交換マスの溶出は、乳清をカラムから緩衝液、好ましくは乳清のｐＨ８，
５のリン酸緩衝液で洗い出すことによって開始する。次いで、不純物があるとす
ればこれが、好ましくは無機アルカリ、アルカリ土類またはアンモニウム塩の弱
塩溶液、例えば０．０７５ Ｍ ＮａＣ１を含む緩衝液で溶出する。
この予備的溶出の後、所望なタン白質を、異なる濃度で前記の塩から選択される
塩溶液を含む緩衝液で選択的に溶出する。例えば、ラクトペルオキシダーゼの溶
出を０．１０〜０．４Ｍの範囲の塩濃度で行い、ラクトフェリンの溶出を０．５
〜２Ｍの塩濃度で行う。
この処理の後、関連のタン白質を約５００倍に濃縮した。
純粋なタン白質画分を集めた後、好ましくは限外濾過の後に脱塩および凍結乾燥
を行うことによって更に濃縮して、純粋なタン白質画分が約９０％である商業製
品を得るようにする。
Ｉｋｇのラクトペルオキシダーゼと１ｋｇのラクトフェリンを製造するためには
、それぞれ約６５および４５コのホエ−が必要である。抽出した成分の純度は９
０％を上回る。
これはイオン交換体を適当に選択し、ｐＨおよび塩濃度が重要なパラメーターで
ある吸着および溶出条件を慎重に選択することによって得られる。
本発明を下記の実施例と添付の図面によって詳細に説明する。
第１図は、本発明による方法の好ましい態様の模式図であり、
第２図は、イオン交換カラムからラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンを溶
出するときの紫外線吸収スペクトルを表わし、
第３図は、本発明による分別を行った後のラクトペルオキシダーゼとラクトフェ
リンの純度を示すクロマトグラムである。
実施例
ｐＨ６，５で殺菌しスラッジを遠心分離したスィートホエー１００リツトルを、
５０℃で十字流法でマイクロ濾過した。マイクロ濾過によって、粒状の脂肪の残
っている残渣を、生成するタン白質凝集体と共に除去した。マイクロフィルター
の細孔度は１．４−であった。
冷却した後、ホエーを、アガロースを特徴とする特別の処理した強陽イオン交換
体（Ｓ−セファロース、急流、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ） ８０
ｍ１を充填したイオン交換カラムを通過させた。床の高さ約４．１（至）であり
、カラム中の流量は１００ ｍｌ／分であり、１，２５床容積／分の流量に相当
した。実験の開始時におけるカラムの前の圧降下はｏ、ｚａｔ＜−ルであった。
１５時間後に、流量は０．２８バールの圧降下で１００ ｍｌ／分であった。ホ
エー約８０〜９０リツトルがカラムを通過したときラクトペルオキシダーゼの漏
出が起こり、すなわち約１０００床容積であった。
次に、ホエーの流れを遮り、溶出相をリン酸緩衝液０、Ｏｆ ＭＫＨ２ＰＯ４、
ｐＨ８，５でカラムからのホエーを洗浄し、０．０７５ Ｍ ＮａＣ１を含むリ
ン酸緩衝液で不純物をイオン交換体から溶出させることによって開始した（第１
図）。ラクトペルオキシダーゼを０．３ＭＮａＣ１を含むリン酸緩衝液で溶出し
た後、ラクトフェリンを０．９ＭＮａＣ１を含むリン酸緩衝液で溶出させた（第
２図参照）。
画分を集めた後、集めた画分をセファデックスカラム中でゲル濾過によって脱塩
し、最後に凍結乾燥した。
イオン交換カラムを、最初に２．０ＭＮａＣ１で洗浄した後、１．０ Ｍ Ｎａ
ＯＨで洗浄することによって清掃した後、カラムを再び実験に用いた。
イオン交換後のラクトペル
オキシダーゼの収率： ９Ｂ、５％、溶出後に集められた両分の
純度” ４１２１Ａ２ＢＯ”＝ ０−８４＊活性として計算した凍結乾燥
後の方法における総酸率＝９０％
凍結乾燥した調製物の純度： ＾４１２／Ａ２８０−０−８７””０．９２が
１００％の純度に対応する最大値である。
対応する収率と純度をラクトフェリンについて得た（第３図参照）。
ＦＩＧ、 ３
２２トゲ／シＪ−千ンクニ仁゛
λ４し今め＾そ水の２０マトグ２々黙、狭補装置の翻訳文提出書（特許法第１８
４条の７第１項）平成 ２ 年 ５ 月 ２８日
特許庁長官 吉 １）文 毅 殿
１、 特許出願の表示
ＰＣＴ／ＳＥ ８８１００６４Ｂ
２、発明の名称
乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラクトフェリンの純粋な画分の抽出法
３、特許出願人
住 所 スエーデン国ストックホルム、ボックス、２４名 称 スベンス
力、メジエリールナス、リクスフエレニングス、エコノミー−アクチェボラーグ
５、 補正誉の提出年月日
１９９０年４ 月 １５日
６、 添付書類の目録
（１） 補正誉の翻訳文 １ 通添附の
請求の範囲はすべて補正されたものであり、国際出願時の請求の範囲第６項、第
７項は削除されております。
請求の範囲
１、 乳清からのラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンの純粋な両分を抽出
する方法であって、乳清をマイクロ濾過し、これをラクトペルオキシダーゼとラ
クトフェリンを選択的に吸着させるため約１〜１．５床容積／分の高流量で強陽
イオン交換体の床中を通過させた後、ｐＨが約８．５で濃度が０．１０〜０．４
Ｍの塩溶液でラクトペルオキシダーゼを、濃度が０．５〜２Ｍの塩溶液でラクト
フェリンを、連続的且つ選択的に溶出させることを特徴とする方法。
２、 ラクトペルオキシダーゼを溶出する前に、陽イオン交換体を濃度が０．
０１〜０．１５ Ｍの塩溶液、好ましくは無機アルカリ、アルカリ土類またはア
ンモニウム塩の溶液で溶出する、請求の範囲第１項に記載の方法。
３、 乳清のｐＨを５．９〜９．０、好ましくは約６．５に調整した後、陽イオ
ン交換体を通過させる、請求の範囲第１項または第４項に記載の方法。
４、 マイクロ濾過を、細孔直径が０．１０〜２ｕ、好ましくは０．４〜１．
５ ｕＥのマイクロフィルターで行う、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１
項に記載の方法。
５、 塩溶液で溶出したラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンをそれぞれ濃
縮し、脱塩し、凍結乾燥する、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載
の方法。
国際調査報告
一剛―畔瞳Ｉ−哨嶋１＾ｅｅ＋−＋−＋−−−ａ、ＰＣＴ／Ｓ［８８１００６４
３１−１ｓｕｎｌ−ＩＩｎ−１ｉ１轟＋１！・＾抛・Ｐ口Ｔ／Ｓ［！＋、８１０
０６４３
Claims (7)
- １．乳清からのラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンの純粋な画分を抽出す る方法であって、乳清をマイクロ濃過し、これをラクトペルオキシダーゼとラク トフェリンを選択的に吸着させるため高流量で強陽イオン交換体を通過させた後 、異なる濃度の塩溶液でラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンを連続的且つ 選択的に溶出させることを特徴とする方法。
- ２．ラクトペルオキシダーゼを、ｐＨが約６．５で濃度が０．１０〜０．４Ｍの 塩溶液で選択的に溶出する、請求の範囲第１項に記載の方法。
- ３．ラクトフェリンを、濃度が０．５〜２Ｍの塩溶液で選択的に溶出する、請求 の範囲第１項または第２項に記載の方法。
- ４．ラクトペルオキシダーゼを溶出する前に、陽イオン交換体を濃度が０．０１ 〜０．１５Ｍの塩溶液、好ましくは無機アルカリ、アルカリ土類またはアンモニ ウム塩の溶液で溶出する、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方 法。
- ５．乳清のｐＨを５．９〜９．０、好ましくは約６．５に調整した後、陽イオン 交換体を通過させる、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
- ６．マイクロ濾過を、細孔度が０．１０〜２μｍ、好ましくは０．４〜１．５μ ｍのマイクロフィルターで行う、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記 載の方法。
- ７．塩溶液で溶出したラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンをそれぞれ濃縮 し、脱塩し、凍結乾燥する、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の 方法。
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