NL8601814A - Werkwijze voor het extraheren van eiwitten uit melk, produkten, toepassingen van de werkwijze en farmaceutische preparaten. - Google Patents

Description

f . i

86-3058/ Ar/vL V

-1-

Korte aanduiding: Werkwijze voor het extraheren van eiwitten uit melk, produkten, toepassing van de werkwijze en farmaceutische preparaten

De onderhavige aanvrage heeft betrekking op eén werkwijze voor het extraheren van eiwitten uit melk, in het bijzonder degene, die in staat zijn om ijzer te binden, de toepassing daarvan bij de bereiding van in het bijzonder lactotransfer-5 rinen, de volgens de werkwijze verkregen produkten en de farmaceutische preparaten, die hen bevatten.

Werkwijzen voor de bereiding van eiwitten, in het bijzonder lactotransferrinen en/of immunoglobulinen zijn reeds beschreven. In het bijzonder kunnen het Franse octrooischrift 10 2 505 615 en het artikel van Chéron (C.R. Acad. Sc. Paris t 284 (14 februari 1977)) genoemd worden.

Deze werkwijzen maken het niet mogelijk om het lactotrans-ferrine met een met een industriële bereiding verenigbare kwaliteit, opbrengst en uitrusting te bereiden.

15 De werkwijze volgens de onderhavige aanvrage maakt het mogelijk om melkeiwitten, in het bijzonder lactotransferrine, in êên enkele adsorptie-elutietrap met een ionenwisselaar, bij constante pH, onder niet denaturerende en bijzonder milde omstandigheden, met een lichte en industriële uitrusting en in 20 een korte tijd te bereiden.

De onderhavige aanvrage heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het extraheren van eiwitten uit melk, in het bijzonder degene, die in staat zijn om ijzer te binden, uitgaande van een melk, die in hoofdzaak bevrijd is van caseïne en vet-25 ten, door adsorptie aan een ionenwisselaar, gevolgd door elu-tie van de geadsorbeerde eiwitten, die gekenmerkt is, doordat de adsorptie en de elutie bij een constante pH worden uitgevoerd.

De toegepaste ionenwisselaar kan een anionenwisselaar zijn, 30 doch is bij voorkeur een kationenwisselaar- Teneinde een snellere en gemakkelijkere elutie te verkrijgen om de denaturatie 55313 14

ï 'B

-2- van de eiwitten te vermijden gebruikt men bij voorkeur een zwak kationisch hars, bijvoorbeeld een carboxymethylhars, zoals de onder de namen CM Trisacryl (IBF) of CM Sêpharose (Pharmacia) in de handel verkrijgbare harsen.

5 Wanneer men een kationisch hars toepast, worden de adsorp tie en de elutie uitgevoerd bij een pH beneden het isoëlektri-sche punt van lactotransferrine, bij voorkeur bij een pH tussen 5 en 8,5, in het bijzonder tussen 6,5 en 8,3 en zeer in het bijzonder tussen 7 en 8.

10 Het uitgangsmateriaal is bij voorkeur een ruwe melk, waar uit men tevoren het grootste gedeelte van de caseïne en de vetten heeft verwijderd. Bijvoorbeeld gebruikt men een zoet of zuur melkserum. De melk mag niet onderworpen zijn aan bewerkingen, die de eiwitten vernietigen of afbreken, zoals pasteuri-15 satie onder strenge omstandigheden,, zoals bijvoorbeeld enkele minuten bij 90°C, of afromsn. De ruwe melk kan bijvoorbeeld van caseïne bevrijd worden door middel van precipitatie met behulp van chloorwaterstofzuur.

De afscheiding van de wrongel en het melkserum wordt uit-20 gevoerd volgens de gewoonlijk voor vloeistof-vastestofsehei-dingen toegepaste methoden, zoals decanteren, centrifugeren of bij voorkeur filtreren.

In het geval van filtratie moet het gekozen membraan bij voorkeur niet de eiwitten binden, bijvoorbeeld door adsorptie, 25 en men gebruikt bijvoorbeeld een membraan van het cellulose-type.

Onder de voorkeursuitvoeringsomstandigheden gaat men uit van een geconcentreerd melkserum. Het melkserum kan volgens de gebruikelijke methoden geconcentreerd worden, bijvoorbeeld 30 door indampen, in een hoëveelheid, die bijvoorbeeld van 2 tot 20 maal en bij voorkeur ongeveer 5 maal bedraagt.

Het geconcentreerde melkserum wordt bij voorkeur ontzou-ten om het ionengehalte te verlagen.

Aan de laatstgenoemde voorwaarden met betrekking tot de 35 concentratie en het ionengehalte wordt met voordeel in één enkele trap voldaan, wanneer men een ultrafiltratie uitvoert.

ëfiO 1814 s ·% -3-

De aard van het ultrafilter moet 2odanig gekozen worden, dat het niet in aanzienlijke mate de melkeiwitten adsorbeert en ze vasthoudt. De selectiviteitsdrempel zal bijvoorbeeld gekozen worden tussen 10.000 en 70.000 en bij voorkeur tussen 25.000 5 en 50.000, en het ultrafilter kan vlak of buisvormig zijn, in de vorm van holle of spiraalvormige vezels. Als ultrafilters, die melkeiwitten, in het bijzonder lactotransferrine, niet of weinig binden, kunnen in het bijzonder degene van het poly-sulfon-type genoemd worden, die onder de naam Millipore, met 10 name onder de aanduiding PSED OHV 10 in de handel verkrijgbaar zijn.

Het ontzouten en het concentreren worden aldus uitgevoerd met dezelfde inrichting, met dezelfde apparatuur. Het ontzouten wordt in dat geval bij voorkeur uitgevoerd door diafiltratie 15 (ultrafiltratie onder lichte overdruk), bijvoorbeeld met een 1/2 tot 2 volumedelen gedestilleerd water.

De adsorptie van de melkeiwitten en hun elutie worden uitgevoerd onder toepassing van eenzelfde concentratie van het bufferprodukt om de gekozen pH te handhaven en onder uitsluitend 20 wijzigen van de ionensterkte met behulp van natriumchloride.

De verschillende ionensterkten worden zodanig gekozen, dat eerst de ongewenste eiwitten en vervolgens uitsluitend het gewenste eiwit geëlueerd wordt. Bijvoorbeeld wordt de elutie van de eiwitten, die in staat zijn ijzer te binden, in het bij-25 zonder lactotransferrine, met voordeel vooraf gegaan door 1 tot 5 eluties met een geringere ionensterkte, en bij voorkeur 1 tot 3 eluties. De elutiebuffer is bij voorkeur een anionische buffer, zoals een fosfaatbuffer.

Het van belang zijnde eluaat wordt vervolgens met voordeel 30 ontzouten om de kleine moleculen met een molecuulgewicht van minder’dan 1000 te verwijderen. Het ontzouten wordt op gebruikelijke wijze uitgevoerd, bijvoorbeeld door zeven met behulp van Millipore-ultrafilters of door chromatografie door permeatie van een gel, bijvoorbeeld G25.

35 De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding levert bij zonder hoge prestaties, aangezien een volledige cyclus voor de 5301814 r v -4- bereiding van zuivere lactotransferrine uitgaande van melk-serum door ultrafiltraties en scheiding met behulp van een kationenwisselaar uitgevoerd wordt in 9 uur, terwijl een werkwijze zoals de eerder genoemde werkwijze van Chéron 24 uur 5 vereist, d.w.z. ongeveer driemaal zo lang duurt.

De vrijwel zuivere melkeiwitten in oplossing kunnen dan met voordeel gedroogd worden, in het bijzonder door vriesdrogen.

De ijzer-bindende eiwitten kunnen met voordeel onderworpen worden aan de inwerking van een complex-vormend middel, 10 bij voorkeur chelaat-vormend middel, dat meer affiniteit ten opzichte van ijzer bezit dan de eiwitten, om hun vermogen voor het binden van ijzer te vergroten. Bijvoorbeeld gebruikt men een EDTA fosfaatbuffer.

Het complex-vormende middel kan verwijderd worden door 15 ontzouten volgens de eerder genoemde methoden.

De onderhavige aanvrage heeft tevens betrekking op de volgens de eerder beschreven werkwijzen verkregen produkten, in het bijzonder lactotransferrine en immunoglobulinen. De eerder beschreven werkwijze wordt met voordeel toegepast voor hun be-20 reiding en de uitvinding heeft derhalve tevens betrekking op de toepassing van de eerder beschreven werkwijze voor hun bereiding.

Het belang van de melkeiwitten op therapeutisch gebied, in het bijzonder de bacteriostatische werkzaamheid van lacto-25 transferrine, is algemeen bekend. Dientengevolge heeft de onderhavige uitvinding tenslotte betrekking op farmaceutische preparaten, die de volgens de eerder beschreven werkwijze verkregen produkten bevatten. Het volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding verkregen lactotransferrine heeft nl. zijn 30 bacteriostatische eigenschappen behouden.

Als geneesmiddelen kunnen de volgens de eerder beschreven werkwijze verkregen produkten opgenomen worden in farmaceutische preparaten voor orale of parenterale toediening.

Deze farmaceutische preparaten kunnen bijvoorbeeld vast 35 of vloeibaar zijn en de gewoonlijk op geneeskundig gebied voor mensen toegepaste farmaceutische vormen bezitten, zoals bijvoor- 1801 8 K- -5- beeld tabletten, dragees, capsules, korrels, suppositoria, oogwaters en neusspoelingen. Ze worden bereid volgens de gebruikelijke methoden. Het werkzame bestanddeel of de werkzame bestanddelen kunnen erin opgenomen worden met de gewoonlijk in 5 dergelijke farmaceutische preparaten toegepaste excipiëntia, zoals talk, arabische gom, lactose, zetmeel, magnesiumstearaat, cacaoboter, al dan niet waterige dragers, vetten van dierlijke of plantaardige oorsprong, paraffinederivaten, glycolen, verschillende bevochtigingsmiddelen, dispergeermiddelen.of emul-10 gatoren en conserveermiddelen.

De toepassingen van de volgens de werkwijze der uitvinding verkregen lactotransferrinen strekken zich vanzelfsprekend uit tot andere gebieden zoals de diergeneeskunde, voedingsmiddelen of vaedermiddelen.

15 De hierna volgende voorbeelden lichten de onderhavige uit vinding op niet beperkende wijze toe.

Voorbeeld 1: Extractie van lactotransferrine

Men voegt onder roeren 15,8 ml 37-39%'s zoutzuur toe aan 3,5 1 ruwe melk, laat gedurende 1 uur bij 40°C precipiteren, 20 filtreert met behulp van een cellulosemembraan, onderwerpt de aldus verkregen 2100 ml melkserüm aan een ultrafiltratie op een Millipore-membraan van het polysulfon-type met een schei-dingsdrempel van 25000 (aanduiding PSED OHV 10), door diafil-tratie met eenzelfde volume gedestilleerd water, en concentreert 25 vervolgens tot 420 ml.

Men brengt de pH van de geconcentreerde oplossing met behulp van natriumhydroxyde op 7,0 en regelt de ionensterkte metbehulp van natriumchloride op 0,15 M (door meten met een conductometer). Men leidt 400 ml van de oplossing met een snel-30 heid van 3 ml/min in een kolom met een inwendige diameter van 25 mm, die gevuld is met 100 ml CM Sëpharose CL 6B (Pharmacia), dat tevoren in evenwicht gebracht is met een 0,15 M fosfaat-buffer met een pH van 7,0, onder uitvoeren van de eluties met een snelheid van 3 ml/min met een 0,1 M fosfaatbuffer met een 35 pH van 7,0, waarvan de ionensterkte met behulp van natriumchloride volgens de onderstaande gradient is geregeld: «soi e 14 ^ .....

-6.- 270 ml van 0,15 Μ

145 ml van 0,25 M

145 ml van 0,30 M

Het lactotransferrine wordt geelueerd met 430 ml van 0,4 M.

5 Men voert een ontzouting uit met behulp van gel G 25 (Pharmacia), vriesdroogt de verkregen oplossing en verkrijgt 84 mg lactotransferrine.

Voorbeeld 2; Extractie van lactotransferrine

Men gaat te werk zoals in voorbeeld 1 uitgaande van 1,5 1 10 ruwe melk.

Men leidt 150 ml oplossing met een snelheid van 1 ml/min in de kolom. Men voert een elutie uit met 150 ml 0,15 M fosfaat-buffer met een pH van 7,0 en een ionensterkte van 0,25 M en elueert het lactotransferrine met 80 ml buffer met een pH van 15 7,0 en een ionensterkte van 0,43 M.

Na ontzouten en vriesdrogen verkrijgt men 40 mg lactotransferrine.

Voorbeeld 3: Extractie van lactotransferrine

Men bereidt het lactoserum en zet het af op een zwakke 20 kationenwisselaar zoals aangegeven in voorbeeld 1.

Men wast vervolgens de kolom en de ionenwisselaar met 200 ml 0,1 M fosfaatbuffer met een pH van 7,0, waarvan de ionensterkte met behulp van natriumchloride op 0,15 M is gebracht.

Men elueert het lactotransferrine vervolgens met 100 ml van 25 dezelfde buffer, waarvan de ionensterkte met behulp van natriumchloride op 1 M is gebracht. Men voert het ontzouten op dezelfde wijze als in het voorafgaande uit (filtratie met behulp van gel G25 van Pharmacia). Na vriesdrogen bedraagt de opbrengst van de bewerking ongeveer 90 mg lactotransferrine per 30 3,5 1 melk.

Voorbeeld 4

Men bereidt het lactoserum zoals in de voorgaande voor-. beelden. Men brengt de pH met behulp van natriumhydroxyde op 7,0. Men voegt vervolgens de oplossing van AZARI en BAUGH in 35 een hoeveelheid van 1 ml per liter lactoserum toe.

Men laat de verzadiging van het lactotransferrine met 8601814 -7- ferri-ionen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur plaatsvinden. Men centrifugeert en ultrafiltreert de oplossing vervolgens zoals in de voorgaande voorbeelden.

Men leidt 400 ml van het verkregen, vastgehouden produkt 5 over 100 ml van een zwakke kationenwisselaar en elueert na wassen met 200 ml van een 0,15 M fosfaatbuffer met een pH van 7,0 het verzadigde lactotransferrine met 100 ml van dezelfde buffer, waarvan de ionensterkte met behulp van natriumchloride op 1 M is gebracht.

10 Men ontzout het preparaat door filtreren over gel (G25) en onderwerpt het aan vriesdrogen.

Men lost het verzadigde, ontzouten lactotransferrine op in ëen 0,05 M fosfaat-citraatbuffer met een pH van 4,5 in een hoeveelheid van 1 mg per ml buffer.

15 Het opheffen van de verzadiging vindt gedurende 12 uur bij 4°C plaats. De niet meer verzadigde oplossing van lactotransferrine wordt vervolgens ontzouten door gelfiltratie (G25) en vervolgens gevriesdroogd.

Samenstelling van de oplossing van AZARI en BAÜGH 20 Men bereidt een oplossingvan 0,1 M natriumcitraat en 0,1 M

natriumbicarbonaat.

Aan 100 ml van deze oplossing voegt men 232 mg ferrichloride- 6^0 toe.

Voorbeeld 5 25 Men bereidt en concentreert melkserum zoals in de voor gaande voorbeelden. Men brengt de pH van de geconcentreerde oplossing met behulp van natriumhydroxyde op 7,0.

Men leidt 10 liter van het preparaat met een snelheid van 6 liter per uur in een kolom met een diameter van 10 cm die 30 gevuld is met 600 ml CM Sepharose Fast-Plow (Pharmacia), dat tevoren in evenwicht is gebracht met een 0,15 M fosfaatbuffer met een pH van 7,0.

Na de afzetting wast men de kolom met één liter 0,15 M fosfaatbuffer met een pH van 7,0 en vervolgens met een liter 35 van dezelfde buffer, waarvan de ionensterkte met behulp van natriumchloride op 0,3 M is gebracht.

8601314 ΐ -8-

Men elueert het lactotransferrine vervolgens met 600 ml van dezelfde buffer, waarvan de ionensterkte dit maal/ΨM is gebracht.

Men voert een ontzouting door gelfiltratie (G25) uit en 5 vriesdroogt het preparaat. Men verkrijgt ongeveer 30 mg lactotransferrine per liter substraat.

Voorbeeld 6; Farmaceutisch preparaat

Men heeft neusdruppels met de volgende samenstelling bereidt: 10 - Lactotransferrine 5 mg - stabilisatiemiddel 250 mg - gedestilleerd water q.s.p. 5 ml #601814

Claims (15)

1. Werkwijze voor het extraheren van eiwitten uit melk, in het bijzonder degene, die in staat zijn om ijzer te binden, uitgaande van een vrijwel van caseïne en vetten bevrijde melk, door adsorptie aan een ionenwisselaar gevolgd door elutie van 5 de geadsorbeerde eiwitten, m e t het kenmerk dat men de adsorptie en de elutie bij een constante pH uitvoert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat men als ionenwisselaar een kationenwisselaar toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met'het kenmerk dat men als ionenwisselaar een zwak kationisch hars toepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, m e t h e t kenmerk dat men de adsorptie en de elutie uitvoert bij een pH 15 tussen 5 en 8,5.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het ken merk dat men de adsorptie en de elutie uitvoert bij een pH tussen 7 en 8.

6. Werkwijze volgens één der conclusies 1-5, m è t het 20 kenmerk dat de in hoofdzaak van caseïne en vetten bevrijde melk een ongeveer 5 maal geconcentreerd melkserum is.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het ken merk dat men de concentratie uitvoert door ultrafiltratie.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het ken- 25. e r k dat de scheidingsdrempel van het ultrafilter tussen 25.000 en 50.000 ligt,

9. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk dat het ultrafilter van het polysulfon-type is.

10. Werkwijze volgens één der conclusies 1-9 , met het 30 kenmerk dat men voor de elutie van de eiwitten, die in staat zijn ijzer te binden, 1 tot 5 eluties met een geringere ionensterkte uitvoert.

11. Werkwijze volgens één der conclusies 1-10, met het kenmerk dat men na de elutie van de eiwitten, die in .08013.14 «ï· -lost aat zijn ijzer te binden, een ijzer-complexvormend middel laat inwerken.

12. Produkten verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens één der conclusies 1-11. 5

13, Toepassing van de werkwijze volgens één der conclusies 1-11 voor de bereiding van lactotransferrine.

14. Toepassing van de werkwijze volgens één der conclusies 1-11 voor de bereiding van immunoglobulinen.

15. Farmaceutische preparaten, die tenminste een van de onder 10 toepassing van de werkwijze volgens één der conclusies 1-11 verkregen produkten bevatten. 8601814