LU86508A1 - Procede d'extraction de proteins du lait,produits,application du procede,et compositions pharmaceutiques - Google Patents
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Description
V
/
BREVET D'INVENTION Société Anonyme dite : ROUSSEL-UCLAF
Procédé d'extraction de protéines du lait, produits, application du procédé, et compositions pharmaceutiques.
Inventeurs : Pierre, Frédéric, Emmanuel MONSAN; Philippe, André THIBAULT; Claudine BROSSARD et Christine, Solange, Jeanne BRUVIER
Convention Internationale : Priorité d’une demande de brevet déposée en France le 11 juillet 1985 sous le N° 85-10649.
La présente demande a pour objet un procédé d'extraction de protéines du lait, notamment celles capables de fixer le fer, son application à la préparation notamment de lactotransferrines, les produits obtenus par le procédé et les compositions pharmaceutiques les renfermant.
5 Des procédés de préparation de protéines, notamment de
Lactotransferrines et/ou d'immunoglobulines ont déjà été décrits. On peut citer notamment le brevet français nH 2 505 615 et l'article de Chéron (C.R. Acad. Sc. Paris t 284 (14 février 1977)).
Ces procédés ne permettent pas de préparer la lactotransferrine 10 avec une qualité, un rendement et un matériel compatible avec une préparation industrielle .
Le procédé de la présente demande permet de préparer des lactoprotéines, notamment la lactotransferrine en une seule étape d'adsorption-élution sur échangeur d'ions, à pH constant, dans des 15 conditions non dénaturantes et particulièrement douces, avec un matériel léger et industriel, et en un temps réduit.
C'est ainsi que la présente demande a pour objet un procédé d'extraction des protéines du lait, notamment de celles capables de fixer le fer, à partir d'un lait substantiellement débarrassé de la caséine et des matières grasses, 20 par adsorption sur échangeur d'ions puis élution des protéines adsorbées, caractérisé en ce que l'adsorption et l'élution sont réalisées à pH constant.
L'échangeur d'ions utilisé peut être un échangeur d'anions, mais de préférence un échangeur de cations. Afin d'obtenir une élution plus rapide et plus facile pour éviter la dénaturation des protéines, on utilise de 25 préférence une résine cationique faible, par exemple une résine * 4t > 2 * » carboxyméthylique comme celles commercialisées sous les noms CM Trisacryl (IBF) ou CM Sépharose (Pharmacia).
Lorsque l’on utilise une résine cationique, l'adsorption et l'élution sont réalisées à un pH inférieur au point isoélectrique de la 5 lactotransferrine, de préférence entre pH 5 et pH 8,5, notamment entre pH
6,5 et 8,3, et tout particulièrement entre pH 7 et pH 8.
Le produit de départ est de préférence un lait cru dont on a préalablement retiré la majeure partie de la caséine et des matières grasses. On utilise par exemple un lactosérum doux ou acide. Le lait ne 10 doit pas avoir été soumis à des opérations détruisant les protéines ou les dégradant, telles que pasteurisation dans des conditions violentes, comme quelques minutes à 90nc par exemple, ou écrémage. Le lait cru peut être, par exemple, décaséiné par précipitation à l'aide d'acide chlorhydrique.
La séparation du caillé et du lactosérum est réalisée selon les 15 techniques habituellement utilisées pour les séparations liquide-solide, telles que décantation, centrifugation ou, de préférence, filtration.
Dans le cas de la filtration, la membrane choisie ne doit pas de préférence, fixer, par adsorption par exemple, les protéines ; on utilise par exemple une membrane de nature cellulosique.
20 Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, on part d'un lactosérum concentré. Le lactosérum peut être concentré selon les méthodes classiques comme par évaporation par exemple, dans une proportion variant de 2 à 20 fois par exemple et de préférence d'environ 5 fois.
Le lactosérum concentré est de préférence dessalé, de manière à 25 diminuer sa force ionique.
Ces dernières conditions de concentration et force ionique sont avantageusement remplies en une seule étape si l'on effectue une ultrafiltration. La nature de l'ultrafilire doit être choisie de manière à ne pas adsorber les lactoprotéines de manière trop importante, et à les 30 retenir. Le seuil de sélectivité sera par exemple choisi entre 10 000 et 70 000, et de préférence entre 25 000 et 50 000, l'ultrafiItre peut se présenter sous forme plane, tubulaire, sous la forme de fibres creuses ou de spirales. Comme ultrafiltres ne fixant pas ou fixant peu les lactoprotéines, notamment la lactotransferrine, on peut citer 35 particulièrement ceux de nature polysulfonique commercialisés sous le nom Millipore, notamment ceux de référence PSED 0HV 10.
Le dessalage et la concentration sont ainsi réalisés par le même dispositif, avec le même appareillage ; le dessalage est dans ce cas de préférence effectué par diafiItration (ultrafiltration sous légère 40 surpression) avec 1/2 à 2 volumes d'eau distillée par exemple.
· 3 * , L'adsorption des lactoprotéines et leur élution sont réalisées en utilisant une même concentration du produit tampon pour conserver le pH choisi, et en modifiant seulement la force ionique à l'aide de chlorure de sodium. Les différentes forces ioniques sont choisies de manière à éluer 5 d'abord les protéines indésirables, puis seulement la protéine désirée.
Par exemple, l'élution des protéines capables de fixer le fer, notamment la lactotransferrinne, est avantageusement précédée de 1 à 5 élutions de force ionique moindre, et de préférence de 1 à 3 élutions. Le tampon d'élution est de préférence anionique tel un tampon phosphate.
10 L'êluat intéressant est ensuite avantageusement dessalé pour éliminer les petites molécules de poids moléculaire inférieur à 1 000. Le dessalage est réalisé classiquement, par exemple par tamisage à l'aide d'ultrafiItres Millipore ou par chromatographie par perméation de gels, 625 par exemple.
15 Le procédé selon la présente invention est particulièrement performant, car un cycle complet de préparation de lactotransferrine pure à partir de lactosérum par ultrafiltration et séparation sur échangeur de cations est réalisé en 9 heures, alors qu'un procédé tel que celui de Chéron ci-dessus cité nécessite 24 heures, soit trois fois plus de temps 20 environ.
Les lactoprotéines substantiellement pures en solution peuvent alors avantageusement être séchées, notamment par lyophilisation.
Les protéines fixant le fer peuvent avantageusement être soumises à l'action d'un complexant, de préférence un chélatant, plus affine qu'elles 25 pour le fer, afin d'augmenter leur capacité en fixation de fer. On utilise par exemple un tampon phosphate EDTA.
Le complexant peut être éliminé par dessalage selon les techniques déjà indiquées.
La présente demande a aussi pour objet les produits obtenus par les 30 procédés cidessus décrits, notamment La lactotransferrine et les immunoglobulines. Le procédé ci-dessus décrit est avantageusement utilisé pour leur préparation et l'invention a ainsi également pour objet l'application du procédé décrit ci-dessus à leur préparation.
L'intérêt en thérapeutique des lactoprotéines est bien connu, en 35 particulier l'activité bactériostatique de la lactotransferrine. C'est pourquoi la présente demande a enfin pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant les produits obtenus par le procédé ci-dessus décrit. En effet, la lactotransferrine obtenue par le procédé de la présente invention a conservé ses propriétés bactériostatiques.
40 A titre de médicaments, les produits obtenus par le procédé ci-dessus < 4 ♦ peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être/ par exemple/ solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment 5 utilisées en médecine humaine/ comme par exemple/ les comprimés/ simples ou dragéifiés/ les gélules, les granulés, les suppositoires, les collyres, les solutions nasales . Elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le 10 talc, la gomme arabique, le lactose , l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Les applications des lactotransferrines obtenues par le procédé de 15 l'invention s'étendent, bien entendu, à d'autres secteurs tels que vétérinaires, nutritionnels ou agro-alimentaire.
Les exemples qui suivent illustrent la présente invention, sans toutefois la limiter.
Exemple 1 : Extraction de lactotransferrine 20 On ajoute sous agitation 15,8 ml d'acide chlorhydrique à 37-39% à 3,5 l de lait cru, laisse précipiter à 40**C pendant 1 heure, filtre sur membrane cellulosique, soumet les 2100 ml de lactosérum ainsi obtenus à une ultrafiltration sur membrane Millipore de nature polysulfonique à seuil de coupure 25000 (Référence PSED 0HV 10), par diafiItration avec un 25 même volume d'eau distillée, puis concentre à 420 ml.
On ajuste à 7,0 le pH de la solution concentrée à l'aide de soude et ajuste la force ionique à 0,15 H à l'aide de chlorure de sodium (en mesurant au conductimètre). 400 ml de solution sont passés, au débit de 3 ml/mn, sur une colonne de 25 mm de diamètre interne remplie de 100 ml de 30 CM Sépharose CL 6B (Pharmacia) préalablement équilibré dans un tampon phosphate 0,15 M pH 7,0, en effectuant les élutions au débit de 3 ml/mn avec un tampon phosphate 0,1 M pH 7,0 dont la force ionique est ajustée à w l'aide de chlorure sodium, selon le gradient suivant :
270 ml à 0,15 M
35 145 ml à 0,25 M
145 ml à 0,30 M.
La lactotransferrine est éluée avec 430 ml à 0,4 M. On opère un dessalage sur gel G 25 Pharmacia, lyophilise la solution obtenue et obtient 84 mg de lactotransferrine.
40 Exemple 2 : Extraction de lactotransferrine ; ' 5 * · .
»
On opère comme indiqué à L'exemple 1 à partir de 1,5 l de lait cru.
150 ml de solution sont passés sur colonne au débit de 1 ml/mn. On effectue une élution avec 150 ml de tampon phosphate 0,15 M.pH 7,0 de 5 force ionique 0,25 H, puis élue la lactotransferrine avec 80 ml de tampon pH. 7,0 de force ionique 0,43 M.
Après dessalage et lyophilisation, on obtient 40 mg de lactotransferrine.
Exemple 5 : Extraction de lactotransferrine.
10 Le lactosérum est préparé et déposé sur l'échangeur cationique faible comme indiqué à l'exemple 1.
On pratique alors un lavage de la colonne et de l'échangeur avec 200 ml de tampon Phosphate 0,1 H pH 7,0 dont la force ionique est ajustée à 0,15 H à l'aide de chlorure de sodium. La lactotransferrine est ensuite 15 éluée avec 100 ml de même tampon dont la force ionique est ajustée à 1 M à l'aide de chlorure de sodium. Le dessalage est effectué de la même façon que précédemment (filtration sur gel 625 Pharmacia). Après lyophilisation, le rendement de l'opération est d'environ 90 mg de lactotransferrine pour 3,5 l de lait.
20 Exemple 4 :
Le lactosérum est préparé comme dans les exemples précédents. On ajuste son pH à 7,0 à l'aide de soude. On ajoute ensuite la solution d'AZARI et BAUGH à raison de 1 ml par litre de lactosérum.
On laisse la saturation de la lactotransferrine en ions ferriques se 25 réaliser à température ambiante pendant 2 heures. La solution est ensuite centrifugée puis ultra-fiItrée comme dans les exemples précédents.
On passe 400 ml du rétentat obtenu sur 100 ml d'échangeur cationique faible puis, après un lavage avec 200 ml de tampon phosphate 0,15 M pH
7,0, la lactotransferrine saturée est éluée avec 100 ml du même tampon 30 dont la force ionique est ajustée à 1 M à l'aide de chlorure de sodium.
La préparation est dessalée par filtration sur gel (625) puis lyophilisée.
v On dissout la lactotransferrine saturée, dessalée dans un tampon
Phosphate/Citrate 0,05 M pH 4,5, à raison de 1 mg par ml de tampon.
35 La désaturation s'effectue pendant 12 heures à +4«C. La solution de lactotransferrine désaturée est ensuite dessalée par filtration sur gel (G25) puis lyophilisée.
Composition de la solution d'AZARI et BAUGH.
Préparer une solution 0,1 M en citrate de sodium et 0,1 M en 40 bicarbonate de sodium.
' ‘ . , 6 * A 100 ml de cette préparation, ajouter 232 mg de chlorure ferrique-ôHjO.
Exemple 5 :
Du lactosérum est préparé et concentré comme dans les exemples 5 précédents. On ajuste à 7,0 le pH de la solution concentrée à l'aide de soude.
* 10 litres de préparation sont passés au débit de 6 litres àl'heure sur une colonne de 10 cm de diamètre remplie de 600 ml de CM Sepharose Fast-Flow (Pharmacia) préalablement équilibré dans un tampon phosphate 10 0,15 M pH 7,0.
Après le dépôt, on lave la colonne avec un litre de tampon phosphate 0,15 M pH 7,0 puis avec un litre du même tampon dont la force ionique est ajustée à 0,3 M à l'aide de chlorure de sodium.
La lactotransferrine est ensuite éluée avec 600 ml du même tampon 15 dont la force ionique est ajustée cette fois à 1 M.
On opère un dessalage par filtration sur gel (625) puis on lyophilise la préparation. On obtient environ 30 mg de lactotransferrine par litre de substrat.
Exemple 6 : Composition pharmaceutique.
20 On a préparé des gouttes nasales ayant la composition suivante : - lactotransferrine ........................................... 5 mg - stabilisant ............................................... 250 mg - eau distillée q.s.p. .........................................5 Ml.
Claims (13)
1. Procédé d'extraction des protéines du lait, notamment de celles capables de fixer le fer, à partir d'un lait substantiellement débarrassé de la caséine et des matières grasses, par adsorption sur échangeur d'ions puis élution des protéines adsorbées, caractérisé en ce que l'adsorption 5 et des l'élution sont réalisées à pH constant.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échangeur d'ions est un échangeur de cations.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'échangeur est une résine cationique faible. 10 4.- Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'adsorption et l'élution sont réalisées à un pH compris entre 5 et 8,5.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'adsorption et l'élution sont réalisées à un pH compris entre 7 et 8.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le 15 lait substantiellement débarrassé de la caséine et des matières grasses est un lactosérum concentré 5 fois environ.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration est réalisée par ultrafiltration.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le seuil de 20 coupure de l'ultrafiltre est compris entre 25 000 et 50 000.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'ultrafiItre a une nature polysulfonique.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'élution des protéines capables de fixer le fer est précédée par 1 à 5 25 élutions de force ionique moindre.
11. Procédé selon L'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'élution des protéines capables de fixer le fer est suivie de l'action d'un complexant du fer.
12. Les produits obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 30 à 11.
13. Application du procédé selon les revendications 1 à 11 à la préparation de lactotransferrine.
14. Application du procédé selon les revendications 1 à 11 à la préparation d'immunoglobulines. 35 15.- Compositions pharmaceutiques renfermant l'un au moins des produits obtenus par les procédés selon l'une des revendications 1 à 11.
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