DE3623474A1 - Verfahren zur extraktion von proteinen der milch, produkte, anwendung des verfahrens und pharmazeutische zusammensetzungen - Google Patents

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen der Milch, insbesondere von denjenigen, die zur Fixierung des Eisens befähigt sind, seine Anwendung zur Herstellung insbesondere von Lactotransferrinen, nach dem Verfahren erhaltene Produkte und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

Verfahren zur Herstellung von Proteinen, insbesondere von Lactotransferrinen und/oder Immunoglobulinen, wurden bereits beschrieben. Man kann insbesondere die FR-PS 25 05 615 und den Artikel von Ch´ron (C.R. Acad. Sc. Paris t 284 (14. Februar 1977)) nennen.

Diese Verfahren ermöglichen es nicht, Lactotransferrin mit einer Qualität, einer Ausbeute und einer Ausrüstung bzw. einem Material herzustellen, die mit einer industriellen Herstellung verträglich sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Lactoproteine, insbesondere Lactotransferrin in einer einzigen Adsorptions- Elutionsstufe an Ionenaustauschern bei konstantem pH-Wert unter nicht denaturierenden und besonders milden Bedingungen mit einer geringen und industriellen Ausrüstung und innerhalb einer verminderten Zeitdauer herzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen der Milch, insbesondere von denjenigen, die zur Fixierung des Eisens befähigt sind, ausgehend von einer im wesentlichen von Casein und Fettbestandteilen befreiten Milch durch Adsorption an Ionenaustauschern und anschließende Elution der adsorbierten Proteine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Adsorption und die Elution bei konstantem pH-Wert durchgeführt werden.

Der verwendete Ionenaustauscher kann ein Anionenaustauscher, vorzugsweise jedoch ein Kationenaustauscher, sein. Um eine schnellere und einfachere Elution zur Vermeidung einer Denaturierung der Proteine zu erzielen, verwendet man vorzugsweise ein schwaches kationisches Harz, z. B. ein Carboxymethylharz wie die unter den Bezeichnungen CM Trisacryl (IBF) oder CM S´pharose (Pharmacia) in den Handel gebrachten.

Verwendet man ein kationisches Harz, werden die Adsorption und die Elution bei einem pH-Wert durchgeführt, der niedriger ist als der isoelektrische Punkt des Lactotransferrins, vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 8,5, insbesondere zwischen pH 6,5 und 8,3 und vor allem zwischen pH 7 und pH 8.

Das Ausgangsprodukt ist vorzugsweise eine Rohmilch, der man zuvor den überwiegenden Anteil des Caseins und der Fettbestandteile entzogen hat. Man verwendet beispielsweise ein mildes oder saures Lactoserum. Die Milch darf keinen Maßnahmen unterzogen worden sein, die die Proteine zerstören oder sie abbauen, wie die Pasteurisierung unter heftigen Bedingungen, wie beispielsweise einige Minuten bei 90°C oder die Entrahmung. Die rohe Milch kann z. B. durch Ausfällung mit Hilfe von Chlorwasserstoffsäure entcaseiniert werden.

Die Abtrennung des Caseins und des Lactoserums erfolgt nach Techniken, wie sie für die Flüßigkeits-Feststoff-Trennungen üblich sind, wie die Dakantierung, Zentrifugierung und vorzugsweise die Filtration.

Im Fall der Filtration darf die ausgewählte Membran vorzugsweise nicht durch Adsorption, z. B. die Proteine, fixieren. Man verwendet beispielsweise eine Membran von Cellulosenatur.

Gemäß bevorzugten Durchführungsbedingungen geht man von einem konzentrierten Lactoserum aus. Das Lactoserum kann nach klassischen Methoden wie durch Eindampfen, z. B. in einem Verhältnis, das vom Zwei- bis Zwanzigfachen beispielsweise variiert, und vorzugsweise von etwa dem Fünffachen konzentriert werden.

Das konzentrierte Lactoserum wird vorzugsweise entsalzt, derart, daß man seine Ionenstärke vermindert.

Diese letztgenannten Bedingungen hinsichtlich Konzentrierung und Ionenstärke werden vorteilhaft in einer einzigen Stufe erfüllt, wenn man eine Ultrafiltration durchführt. Die Natur des Ultrafilters muß derart ausgewählt werden, daß man nicht die Lactoproteine in zu erheblichem Ausmaß adsorbiert und sie zurückhält. Die Selektivitätsschwelle wird z. B. zwischen 10 000 und 70 000 und vorzugsweise zwischen 25 000 und 50 000 ausgewählt; das Ultrafilter kann in ebener röhrenförmiger Form oder in Form von Hohlfasern oder spiralförmigen Fasern vorliegen. Als Ultrafilter, die Lactoproteine, insbesondere das Lactotransferrin nicht oder wenig filtrieren, kann man insbesondere diejenigen von Polysulfonnatur nennen, die unter der Bezeichnung Millipore, insbesondere diejenigen mit dem Zeichen PSED OHV 10 in den Handel gebracht werden.

Die Entsalzung und die Konzentrierung werden somit mit der gleichen Vorrichtung, mit der gleichen Apparatur durchgeführt. Die Entsalzung erfolgt in diesem Fall vorzugsweise durch Diafiltration (Ultrafiltration unter geringem Überdruck) mit 1/2 bis 2 Volumen destilliertem Wasser beispielsweise.

Die Adsorption der Lactoproteine und ihre Elution erfolgen, indem man eine gleiche Konzentration an Pufferprodukt verwendet, um den gewählten pH-Wert beizubehalten, und indem man lediglich die Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid modifiziert. Die verschiedenen Ionenstärken werden derart gewählt, daß man zunächst die unerwünschten Proteine und dann lediglich das gewünschte Protein eluiert. Zum Beispiel gehen der Elution von zur Fixierung des Eisens befähigten Proteinen, insbesondere von Lactotransferrin, vorteilhaft 1 bis 5 Elutionen von geringerer Ionenstärke und vorzugsweise 1 bis 3 Elutionen voran. Der Puffer der Elution ist vorzugsweise anionisch wie ein Phosphatpuffer.

Das interessierende Eluat wird darauf vorteilhafterweise entsalzt, um die kleinen Moleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb 1000 zu eliminieren. Die Entsalzung erfolgt auf klassische Weise, z. B. durch Sieben mit Millipore-Ultrafiltern oder durch Chromatographie durch Permeation von Gelen, G25 beispielsweise.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders leistungsfähig, weil ein vollständiger Cyclus der Herstellung von reinem Lactotransferrin aus Lactoserum durch Ultrafiltration und Trennung an Kationenaustauschern innerhalb von 9 Stunden durchgeführt wird, während ein Verfahren wie das vorstehend angegebene von Ch´ron 24 Stunden erfordert, entsprechend etwa der dreifachen Zeitdauer.

Die im wesentlichen reinen Lactoproteine in Lösung können dann auf vorteilhafte Weise getrocknet werden, insbesondere durch Lyophilisation.

Die das Eisen fixierenden Proteine können vorteilhafterweise der Einwirkung eines Komplexierungsmittels, vorzugsweise eines Chelatisierungsmittels unterzogen werden, das für das Eisen eine größere Affinität besitzt als diese, um deren Kapazität im Hinblick auf die Fixierung des Eisens zu erhöhen. Vorzugsweise verwendet man einen Phosphat-EDTA-Puffer.

Das Komplexierungsmittel kann durch Entsalzen nach den bereits angegebenen Techniken eliminiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Produkte, erhalten nach den vorstehend beschriebenen Verfahren, insbesondere das Lactotransferrin und die Immunoglobuline. Das vorstehend beschriebene Verfahren wird vorteilhafterweise zu deren Herstellung verwendet, und die Erfindung betrifft somit auch die Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zu deren Herstellung.

Das therapeutische Interesse an den Lactoproteinen ist gut bekannt, insbesondere die bakteriostatische Aktivität des Lactotransferrins. Die vorliegende Erfindung betriffte daher schließlich auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Produkte enthalten. In der Tat hat das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Lactotransferrin seine bakteriostatischen Eigenschaften beibehalten.

Als Arzneimittel können die nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenen Produkte in pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet werden, die für die Verabreichung über den Verdauungsweg oder den parenteralen Weg bestimmt sind.

Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. fest oder flüssig sein und in pharmazeutischen Formen vorliegen, wie sie üblicherweise in der Humanmedizin verwendet werden, wie z. B. einfache oder dragierte Tabletten, Gelkapseln, Granulate, Suppositorien, Augentropfen und Lösungen für Nasentropfen. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt. Der oder die Wirkstoffe können hierbei Exzipienten einverleibt werden, wie sie üblicherweise in derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie Talk, Gummiarabikum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nicht wäßrige Träger, Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, verschiedene Netz-, Dispergier- oder Emulgiermittel und Konservierungsmittel.

Die Verwendungen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Lactotransferrine erstrecken sich wohl verstanden auf weitere Bereiche, wie die veterinärmedizinischen, die die Ernährung oder die Agro-Nahrungsmittel betreffenden.

Die folgenden Beispiels erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Extraktion von Lactotransferrin

Man gibt unter Rühren 15,8 ml 37- bis 39-%ige Chlorwasserstoffsäure zu 3,5 l Rohmilch, läßt 1 Stunde bei 40°C ausfallen, fliltriert an einer Cellulosemembran, unterwirft die so erhaltenen 2100 ml Lactoserum einer Ultrafiltration an einer Milliporemembran von Polysulfonnatur mit einer Anschlußgrenze von 25 000 (Zeichen PSED OHV 10) durch Diafiltration mit einem gleichen Volumen an destilliertem Wasser und engt dann auf 420 ml ein.

Man stellt den pH-Wert der konzentrierten Lösung mit Hilfe von Natronlauf auf 7,0 und die Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid (indem man konduktometrisch mißt) auf 0,15 M ein. Man läßt 400 ml Lösung mit einem Durchsatz von 3 ml/Min. über eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 25 mm passieren, die mit 100 ml CM S´pharose CL 6B (Pharmacia) gefüllt ist und zuvor in einem Phosphatpuffer, 0,15 M, pH 7,0, equilibriert worden war, indem man die Elutionen bei einem Durchsatz von 3 ml/Min. mit einem Phosphatpuffer, 0,1 M, pH 7,0, bewirkt, dessen Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid entsprechend den folgenden Gradienten eingestellt wurde:
- 270 ml von 0,15 M
- 145 ml von 0,25 M
- 145 ml von 0,30 M.

Das Lactotransferrin wird mit 430 ml von 0,4 M eluiert. Man nimmt eine Entsalzung an dem Gel G25 Pharmacia vor, lyophilisiert die erhaltene Lösung und gewinnt 84 mg Lactotransferrin.

Beispiel 2 Extraktion von Lactotransferrin

Man arbeitet wie in Beispiel 1 angegeben, ausgehend von 1,5 l roher Milch.

Man läßt 150 ml eine Säule mit einem Durchsatz von 1 ml/Min. passieren. Man führt eine Elution mit 150 ml Phosphatpuffer, 0,15 M, pH 7,0, mit einer Ionenstärke von 0,25 M durch, eluiert dann das Lactotransferrin mit 80 ml Puffer, pH 7,0, mit einer Ionenstärke von 0,43 M.

Nach dem Entsalzen und der Lyophilisierung gewinnt man 40 mg Lactotransferrin.

Beispiel 3 Extraktion von Lactotransferrin

Das Lactoserum wird wie in Beispiel 1 angegeben hergestellt und an einem schwachen Kationenaustauscher abgeschieden.

Man nimmt dann ein Waschen der Säule und des Austauschers mit 200 ml Phophatpuffer, 0,1 M, pH 7,0, vor, dessen Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid auf 0,15 M eingestellt wurde. Das Lactotransferrin wird hierauf mit 100 ml des gleichen Puffers eluiert, dessen Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid auf 1 M eingestellt wurde. Das Entsalzen erfolgt auf die gleiche Weise wie vorstehend (Filtration an Gel G25 Pharmacia). Nach der Lyophilisierung beträgt die Ausbeute des Verfahrens etwa 90 mg Lactotransferrin je 3,5 l Milch.

Beispiel 4

Das Lactoserum wird wie in den vorhergehenden Beispielen hergestellt. Man stellt seinen pH mit Hilfe von Natronlauge auf 7,0 ein. Man gibt dann eine Lösung von AZARI und BAUGH in einer Menge von 1 ml je Liter Lactoserum zu.

Man läßt die Sättigung des Lactotransferrins an Eisenionen bei Raumtemperatur während zwei Stunden erfolgen. Die Lösung wird hierauf zentrifugiert und dann ultrafiltriert, wie in den vorhergehenden Beispielen angegeben.

Man leitet 400 ml des erhaltenen Retentats über 100 ml schwachen Kationenaustauscher, und nach einem Waschen mit 200 ml Phosphatpuffer, 0,15 M, pH 7,0, wird das gesättigte Lactotransferrin mit 100 ml Phosphatpuffer eluiert, dessen Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid auf 1 M eingestellt wurde.

Das Präparat wird durch Gelfiltration (G25) entsalzt und anschießend lyophilisiert.

Man löst das gesättigte, entsalzte Lactotransferrin in einem Phophat/Citrat-Puffer, 0,05 M, pH 4,5, in einer Menge von 1 mg je ml Puffer.

Die Desaturierung erfolgt während 12 Stunden bei +4°C. Die Lösung des desaturierten Lactotransferrins wird hierauf durch Gelfiltration (G25) entsalzt und dann lyophilisiert.

Herstellung der Lösung von AZARI und BAUGH

Herstellung einer Lösung, die 0,1 M an Natriumcitrat und 0,1 M an Natriumbicarbonat ist.

Zu 100 ml dieses Präparats Zugabe von 232 mg Ferrichlorid 6H₂O.

Beispiel 5

Lactoserum wird wie in den vorhergehenden Beispielen hergestellt und konzentriert. Man stellt den pH-Wert der konzentrierten Lösung mit Hilfe von Natronlauge auf 7,0 ein.

10 l Präparat läßt man mit einem Durchsatz von 6 l je Stunde eine Säule mit einem Durchmesser von 10 cm, die mit 600 ml CM Sepharose Fast-Flow (Pharmacia) gefüllt ist und zuvor in einem Phosphatpuffer, 0,15 M, pH 7,0, equilibriert wurde, passieren.

Nach dem Abscheiden wäscht man die Säule mit einem Liter Phosphatpuffer, 0,15 M, pH 7,0, dann mit einem Liter des gleichen Puffers, dessen Ionenstärke mit Hilfe von Natriumchlorid auf 0,3 M eingestellt wurde.

Das Lactotransferrin wird hierauf mit 600 ml des gleichen Puffers eluiert, dessen Ionenstärke dieses Mal auf 1 M eingestellt wurde.

Man nimmt eine Entsalzung durch Gelfiltration (G25) vor, wonach man das Präparat lyophilisiert. Man gewinnt etwa 30 ml Lactotransferrin je Liter Substrat.

Beispiel 6 Pharmazeutische Zusammensetzung

Man stellte Nasentropfen der folgenden Zusammensetzung her:
- Lactotransferrin 5 mg
- Stabilisierungsmittel 250 mg
- destilliertes Wasser quantum satis für 5 ml

Claims (15)

1. Verfahren zur Extraktion von Proteinen in der Milch, insbesondere von denjenigen, die zur Fixierung des Eisens befähigt sind, ausgehend von einer im wesentlichen von Casein und Fettbestandteilen befreiten Milch durch Adsorption an Ionenaustauschern und anschließende Elution der adsorbierten Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption und die Elution bei konstantem pH-Wert durchgeführt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher ein Kationenaustauscher ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Austauscher ein schwaches kationisches Harz ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption und die Elution bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8,5 durchgeführt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption und Elution bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 durchgeführt werden.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen von Casein und Fettbestandteilen befreite Milch ein um etwa das Fünffache konzentriertes Lactoserum ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrierung durch Ultrafiltration bewirkt wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zurückhalteschwelle bzw. Ausschlußgrenze des Ultrafilters zwischen 25 000 und 50 000 liegt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Ultrafilter eine Polysulfonnatur besitzt bzw. vom Polysulfontyp ist.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Elution der zur Fixierung des Eisens befähigten Proteine 1 bis 5 Elutionen von geringerer Ionenstärke vorangehen.

1. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Elution der zur Fixierung des Eisens befähigten Proteine die Einwirkung eines Komplexmittels für das Eisen anschließt.

12. Produkte, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Anwendung des Verfahrens gemäß den Patentansprüchen 1 bis 11 zur Herstellung von Lactotransferrin.

14. Anwendung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Herstellung von Immunoglobulinen.

15. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend zumindest eines der Produkte, erhalten nach den Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.