CN106754841A - 一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法 - Google Patents

一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，以牛胰或猪胰为原料，包括以下步骤：原料粉碎；胰蛋白粗提；硫酸铵两级盐析；粗品酶解活化；以GE Health凝胶介质Sepharose CL‑4B为骨架，以(2，6‑二羟基)庚基‑(6‑氨基)乙酰基‑对氨基苯基胍为配基，在碱性条件下反应24h制备亲和层析填料进行亲和层析；超滤浓缩除菌；真空冷冻干燥得成品。本发明规避了传统工艺中繁琐的酶原沉淀步骤，大大简化了工序，同时能以较高的收率获得高纯度高活性的产品，工艺稳定，质量可控，大幅降低了生产成本，提高了产品的市场竞争力。

Description

一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法
技术领域
本发明属于生化分离和纯化技术领域，具体地说，涉及药用胰蛋白酶的亲和层析制备方法，更具体地说，涉及一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法。
背景技术
胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋水解酶，能水解蛋白质为多肽或氨基酸，对精氨酸和赖氨酸的肽链具有选择性的水解作用，为一肽链内切酶。胰蛋白酶在药理和临床上的功效主要有：分解液化血凝块、脓性分泌物、坏死组织等，能使脓液变稀，易于引流并能促进伤口愈合。
国内提取胰蛋白酶的工艺长期以来一直采用多重盐析、结晶结合透析的工艺，该种工艺纯化能力较弱、工艺复杂、透析工艺耗时较长、不便于规模化生产，且成品效价较低，以这种传统工艺生产的产品活性一般在2000-2500单位/毫克，最高仅能达到约2700单位/毫克。
由于胰蛋白酶的生产工艺在其生产厂家存在较大的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动，且受限于亲和层析技术本身的技术难度，使得开发以亲和层析工艺来制备胰蛋白酶具有较高的技术门槛和技术瓶颈，因此，胰蛋白酶工艺很难获得重大突破。目前，为了提高胰蛋白酶的活性，很多胰蛋白酶生产公司采用了慈菇蛋白酶抑制剂作为亲和层析柱配基，如：专利CN102911926A公开一种“采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法”，该方法采用的亲和层析介质以GE Health凝胶介质作为基础，并接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基，使用的洗脱液为0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液；但上述工艺或其类似工艺无一例外需要进行硫酸铵分级盐析和酶原沉淀步骤，工序较为复杂，对胰蛋白酶活性提高空间也十分有限。
发明内容
针对现有制备工艺存在的上述技术瓶颈和缺陷，本发明旨在提供一种工艺稳定、质量可控的高纯度高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下方案：
一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，以牛胰或猪胰为原料，包括以下步骤：原料粉碎；胰蛋白初步提取；硫酸铵两级盐析；粗品酶解活化；以GE Health凝胶介质Sepharose CL-4B为骨架，以(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍为配基，在碱性条件下反应24h制备亲和层析填料进行亲和层析；超滤浓缩除菌；真空冷冻干燥得成品。
优选地，具体步骤如下：
(1)原料粉碎、胰蛋白粗提：取新鲜冷冻牛胰或猪胰，用粉碎机将其直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.125M硫酸溶液，于4度搅拌提取6h，放置过夜，于次日进行固液分离，取清液即为胰蛋白酶粗提液；
(2)硫酸铵两级盐析：
向上述胰蛋白酶粗提液加入硫酸铵至25％饱和度，并加入硅藻土助滤，于4度放置过夜后过滤，取上清液；再补充硫酸铵至65％饱和度，于4度放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心收集底层沉淀；
(3)粗品酶解活化：取上述沉淀加6-8倍体积的去离子水溶解，调节pH至8.0，每升溶液添加6mg高纯度牛胰蛋白酶或高纯度猪胰蛋白酶，于4度酶解24h，酶解后的溶液离心得酶解活化液；
(4)亲和层析分离纯化：
采用以GE Health凝胶介质Sepharose CL-4B为骨架，以(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍为配基的亲和层析柱，用0.1M巴比妥钠-盐酸，pH8.0缓冲液平衡，酶解活化液上样，控制线性流速为25cm/h；上样完毕，用上述缓冲液冲柱至流出液的OD280值＜0.1，换用0.1M甘氨基酸-0.05M HCl，pH2.2缓冲液洗脱，控制线性流速为45cm/h，收集洗脱峰液；亲和层析的时间为15～16h。
(5)超滤浓缩除菌：将上述洗脱峰液用超滤膜系统进行浓缩，浓缩液过0.22μm滤膜过滤除菌；
(6)真空冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术，将上述滤液直接冷冻干燥，即得高活性胰蛋白酶成品。
优选地，在步骤(1)中，采用机电一体化箱式板框过滤设备进行固液分离。
优选地，在步骤(2)中，所述硫酸铵为试剂级。
优选地，在步骤(3)中，所述高纯度牛胰蛋白酶活性＞3000U/mg，高纯度猪胰蛋白酶活性＞4000U/mg。
优选地，所述超滤膜系统的截留分子量为10000。
优选地，在步骤(6)中，所述冷冻干燥的冷冻温度为-40℃以下。
本发明的有益技术效果在于：
针对现有胰蛋白酶提取产业存在的工艺惯性大，工序复杂，酶活力难以提高的缺陷，本申请人经不断研发、小试、中试和规模化生产，独创以GE Health凝胶介质SepharoseCL-4B为骨架，以(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍为配基在碱性条件下反应24h制备亲和层析填料进行亲和层析的特殊工艺，在本发明层析过程中，在PH8.0条件下，配基(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍与胰蛋白酶发生高特异性结合，在PH2.2时与胰蛋白酶的结合体分离，高纯度胰蛋白酶将从该亲和层析柱解离下来，进一步配套开发出蛋白粗提、硫酸铵两级盐析、酶解活化、亲和层析、超滤浓缩和冷冻干燥一整套工艺，规避了传统工艺中繁琐的酶原沉淀步骤，大大简化了工序，同时能以较高的收率获得高纯度高活性的产品(高纯度牛胰蛋白酶活性＞3000U/mg，高纯度猪胰蛋白酶活性＞4000U/mg)，工艺稳定，质量可控，体现出亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，突破了现有亲和层析的技术壁垒，大幅降低了生产成本，提高了产品的市场竞争力。
附图说明
图1为本发明高活性胰蛋白酶亲和层析法工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。
如图1所示为本发明高活性胰蛋白酶亲和层析法工艺流程示意图。
如无特殊说明，以下实施例所采用的生产仪器和设备均为本领域通用，所涉及原料和试剂均为市售商品。
实施例1～实施例3所用新鲜冷冻牛胰或猪胰均采购自专业畜牧或肉业公司，有良好的品质保证，动物检疫证明齐全，原料的运输采用冷藏运输，保存条件为冷冻保存。
实施例1～实施例3所采用的自制亲和层析介质的制备方法如下：以GE Health凝胶介质Sepharose CL-4B为骨架，在碱性条件下，依次与二缩水甘油反应2h、6-氨基己酸反应12h、对氨基苯基胍反应10h，合计反应24h，生成以(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍为配基的亲和层析填料进行亲和层析。
制备实施例
实施例1
(1)原料粉碎、胰蛋白酶粗提：取新鲜冷冻牛胰150公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎；加入450L预冷的0.125M硫酸溶液，转移到1吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取6小时，放置过夜；次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液即为胰蛋白酶粗提液。
(2)硫酸铵两级盐析：向上述胰蛋白酶粗提液加入试剂级硫酸铵至25％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤，取上清液；再在该上清液中补充试剂级硫酸铵至65％饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到粗品7.5公斤。
(3)粗品酶解活化：粗品用60L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入360mg高纯度牛胰蛋白酶(效价：3200单位/毫克)，在4度冷库中酶解24小时，离心得到酶解活化液。根据中国药典2015年版相应方法检测该酶解活化液的效价。
(4)亲和层析分离纯化：将10L自制的亲和层析介质装柱，用30L 0.1M巴比妥钠-盐酸，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解活化液上样，控制线性流速为25cm/h；上样完毕，用30L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，保留穿透液，测定穿透液中的胰蛋白酶活性；换用0.1M甘氨酸-0.05M HCl，pH2.2缓冲液洗脱，控制线性流速为45cm/h，收集洗脱峰液20L。亲和层析的时间为15h。
(5)超滤浓缩除菌：用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至4.5L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。
(6)真空冷冻干燥：除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-45℃，得到高活性胰蛋白酶成品一。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求进行全项测定。
实施例2
(1)原料粉碎、胰蛋白酶粗提：取新鲜冷冻牛胰450公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆；加入1350L预冷的0.125M硫酸溶液，转移到2吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取6小时，放置过夜；次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液即为胰蛋白酶粗提液。
(2)硫酸铵两级盐析：向上述胰蛋白酶粗提液中搅拌加入试剂级硫酸铵至25％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤，取上清液；再在该上清液中再补充试剂级硫酸铵至65％饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到粗品23公斤。
(3)粗品酶解活化：粗品用138L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入828mg高纯度牛胰蛋白酶(效价：3200单位/毫克)，在4度冷库中酶解24小时，离心得到酶解活化液。根据中国药典2015年版的相应方法测定该酶解活化液胰蛋白酶的效价。
(4)亲和层析分离纯化：将25L自制的亲和层析介质装柱，用75L 0.1M巴比妥钠-盐酸，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解活化液上样，控制线性流速为25cm/h；上样完毕，用75L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，保留穿透液，测定穿透液中的胰蛋白酶活性；换用0.1M甘氨酸-0.05M HCl，pH2.2缓冲液洗脱，控制线性流速为45cm/h，收集洗脱峰液50L。亲和层析的时间为16h。
(5)超滤浓缩除菌：用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至8L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。
(6)真空冷冻干燥：除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-45℃，得到高活性胰蛋白酶成品二。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求进行全项测定。
实施例3
(1)原料粉碎、胰蛋白酶粗提：取新鲜冷冻猪胰200公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆。加入600L预冷的0.125M硫酸溶液，转移到1吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取6小时，放置过夜；次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液即为胰蛋白酶粗提液。
(2)硫酸铵两级盐析：向上述胰蛋白酶粗提液中搅拌加入试剂级硫酸铵至25％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤，取上清液；再在该上清液中再补充试剂级硫酸铵至65％饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到粗品16公斤。
(3)粗品酶解活化：粗品用128L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入768mg高纯度猪胰蛋白酶(效价：4100单位/毫克)，在4度冷库中酶解24小时，离心得到酶解活化液。根据中国药典2015年版的相应方法测定该酶解活化液胰蛋白酶的效价。
(4)亲和层析分离纯化：将30L自制的亲和层析介质装柱，用90L 0.1M巴比妥钠-盐酸，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解活化液上样，控制线性流速为25cm/h；上样完毕，用90L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，保留穿透液，测定穿透液中的胰蛋白酶活性；换用0.1M甘氨酸-0.05M HCl，pH2.2缓冲液洗脱，控制线性流速为45cm/h，收集洗脱峰液50L。亲和层析的时间为16h。
(5)超滤浓缩除菌：用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至10L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。
(6)真空冷冻干燥：除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-45℃，得到高活性胰蛋白酶成品三。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求进行全项测定。
实施例4
(1)原料粉碎、胰蛋白酶粗提：取新鲜冷冻猪胰400公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆。加入1200L预冷的0.125M硫酸溶液，转移到2吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取4小时，放置过夜；次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液即为胰蛋白酶粗提液。
(2)硫酸铵两级盐析：向上述胰蛋白酶粗提液中搅拌加入试剂级硫酸铵至25％饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤，取上清液；再在该上清液中再补充试剂级硫酸铵至65％饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到粗品35公斤。
(3)粗品酶解活化：粗品用210L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入1260mg高纯度猪胰蛋白酶(效价：4100单位/毫克)，在4度冷库中酶解48小时，离心得到酶解活化液。根据中国药典2015年版的相应方法测定该酶解活化液胰蛋白酶的效价。
(4)亲和层析分离纯化：将60L自制的亲和层析介质装柱，用180L 0.1M巴比妥钠-盐酸，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解活化液上样，控制线性流速为25cm/h；上样完毕，用180L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，保留穿透液，测定穿透液中的胰蛋白酶活性；换用0.1M甘氨酸-0.05M HCl，pH2.2缓冲液洗脱，控制线性流速为45cm/h，收集洗脱峰液50L。亲和层析的时间为16h。
(5)超滤浓缩除菌：用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至20L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。
(6)真空冷冻干燥：除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，冷冻温度为-45℃，得到高活性胰蛋白酶成品四。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求进行全项测定。
胰蛋白酶中间产品质量跟踪和成品活力检测结果
根据上表检测数据可知，实施例1～实施例4所述工艺省略了繁琐的酶原沉淀步骤，大大简化了工艺，降低了生产成本，同时能制备得到高纯度高活力的胰蛋白酶产品(高纯度牛胰蛋白酶活性＞3000U/mg，高纯度猪胰蛋白酶活性＞4000U/mg)，突破了现有胰蛋白酶纯化提取产业的技术瓶颈，工艺稳定，质量可控。
以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部改动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。

Claims (7)

1.一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于以牛胰或猪胰为原料，包括以下步骤：原料粉碎；胰蛋白粗提；硫酸铵两级盐析；粗品酶解活化；以GE Health凝胶介质Sepharose CL-4B为骨架，以(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍为配基，在碱性条件下反应24h制备亲和层析填料进行亲和层析；超滤浓缩除菌；真空冷冻干燥得成品。
2.根据权利要求1所述的高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)原料粉碎、胰蛋白粗提：取新鲜冷冻牛胰或猪胰，用粉碎机将其直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.125M硫酸溶液，于4度搅拌提取6h，放置过夜，于次日进行固液分离，取清液即为胰蛋白酶粗提液；
(2)硫酸铵两级盐析：
向上述胰蛋白酶粗提液加入硫酸铵至25％饱和度，并加入硅藻土助滤，于4度放置过夜后过滤，取上清液；再补充硫酸铵至65％饱和度，于4度放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心收集底层沉淀；
(3)粗品酶解活化：取上述沉淀加6-8倍体积的去离子水溶解，调节pH至8.0，每升溶液添加6mg高纯度牛胰蛋白酶或猪胰蛋白酶，于4度酶解24h，酶解后的溶液离心得酶解活化液；
(4)亲和层析分离纯化：
采用以GE Health凝胶介质Sepharose CL-4B为骨架，以(2，6-二羟基)庚基-(6-氨基)乙酰基-对氨基苯基胍为配基的亲和层析柱，用0.1M巴比妥钠-盐酸，pH8.0缓冲液平衡，酶解活化液上样，控制线性流速为25cm/h；上样完毕，用上述缓冲液冲柱至流出液的OD280值＜0.1，换用0.1M甘氨酸-0.05M HCl，pH2.2缓冲液洗脱，控制线性流速为45cm/h，收集洗脱峰液；亲和层析的时间为15～16h。
(5)超滤浓缩除菌：将上述洗脱峰液用超滤膜系统进行浓缩，浓缩液过0.22μm滤膜过滤除菌；
(6)真空冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术，将上述滤液直接冷冻干燥，即得高活性胰蛋白酶成品。
3.根据权利要求2所述的高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，采用机电一体化箱式板框过滤设备进行固液分离。
4.根据权利要求2所述的高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述硫酸铵为试剂级。
5.根据权利要求2所述的高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述高纯度牛胰蛋白酶活性＞3000U/mg，高纯度猪胰蛋白酶活性＞4000U/mg。
6.根据权利要求2所述的高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述超滤膜系统的截留分子量为10000。
7.根据权利要求2所述的高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述冷冻干燥的冷冻温度为-40℃以下。
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