CN113321716A - 一种龙须菜试剂级r-型藻红蛋白的高效分离纯化方法 - Google Patents

一种龙须菜试剂级r-型藻红蛋白的高效分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于红藻分离纯化技术领域，公开了一种龙须菜试剂级R‑型藻红蛋白的高效分离纯化方法，包括：进行R‑型藻红蛋白粗提液的获取；利用硫酸铵沉淀法进行R‑型藻红蛋白粗提液的盐析处理；利用强阴离子交换柱层析进行R‑型藻红蛋白的分离纯化。本发明操作简单，回收率高，纯度高并达到试剂级要求，大大降低生产成本，为试剂级R‑型藻红蛋白应用于医学检测、生物技术等领域奠定了基础；提供的R‑型藻红蛋白经过CaptoTM Q离子交换柱层析一步纯化，纯度达到A566/A280＝5.37；采用CaptoTM Q离子交换柱层析具有纯化效果好、上样量大、样品得率高等特点，A566/A280达到5.0以上。

Description

一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法
技术领域
本发明属于红藻分离纯化技术领域，尤其涉及一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。
背景技术
目前，藻红蛋白在不同领域应用时对其纯度(Aλmax/A280)要求不同，一般纯度大于0.7是食品级，大于3.0是医药级，大于3.9是反应级，试剂级大于4.0。藻红蛋白在不同领域中应用时，因其纯度要求不同，所以藻红蛋白的价格也不尽相同。Cyanotech公司生产的R-藻红蛋白价格＄3.25-14/mg，Martek公司生产的山羊抗鼠IgG：R-藻红蛋白的价格高达＄165/mg。
现有藻红蛋白分离纯化方法是通过数次的羟基磷灰石柱层析结合离子交换层析或凝胶过滤层析来进行，以往的提纯方法在实际工业化生产过程中存在操作步骤复杂，动力能耗高以及操作周期长等缺点；据文献报道，分离纯化的成本占产品成本的50～90％；此外，由于步骤过多而导致产量损失大，通常每增加一步层析过程目标蛋白就会减少20％，这对工业化生产来说成本无疑是十分昂贵的。因此，一种高效、经济且易于放大的分离纯化方法对于生产高纯度和高回收率的藻红蛋白来说是十分必要的。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有藻红蛋白分离纯化方法存在操作步骤复杂，动力能耗高以及操作周期长等缺点，且由于步骤过多会导致产量损失大。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法。
本发明是这样实现的，一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，所述龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法包括以下步骤：
步骤一，进行R-型藻红蛋白粗提液的获取：选取大型经济海洋红藻龙须菜作为藻红蛋白分离纯化的原料；将冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜溶于灭菌蒸馏水中，经过冻结融解2～3h后，搅拌，并进行超声波破碎处理；将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中浸提，纱布过滤，离心，收集上清液，即可得到R-型藻红蛋白粗提液；
在对大型经济海洋红藻龙须菜剪碎时，将-20℃条件下冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；
步骤二，利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理：将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，根据饱和度进行分级沉淀，并静置12～24h；静置后于4℃、12000～15000rpm/min的条件下离心20～30min，收集上清液和沉淀；取沉淀溶于灭菌蒸馏水并置于透析袋中进行蒸馏水透析，除去硫酸铵，并将透析后的样品离心，收集上清液；超滤膜过滤，即可得到经盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；
所述根据饱和度进行分级沉淀，包括：
将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，于饱和度分别为20％、40％、和60％时进行分级沉淀；
步骤三，利用强阴离子交换柱层析进行R-型藻红蛋白的分离纯化：获取盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；利用离子交换层析技术将盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液进行强阴离子CaptoTM Q层析柱纯化；纯化后，利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理，得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白；
利用离子交换层析技术进行层析处理时，用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液的pH为8.0～8.5，清洗缓冲液中Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、EDTA溶液浓度为4.0～6.0mmol/L。
进一步，步骤一中，所述PBS缓冲液的体积为所述大型经济海洋红藻龙须菜体积的10～30倍，所述PBS缓冲液为50～80mmol/L，pH 6.0～7.0。
进一步，步骤一中，所述浸提的条件为：将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中，于4℃条件下，浸提24～48h。
进一步，步骤一中，所述离心的方法为：将滤液置于8000～16000rpm/min的条件下离心15～20min。
进一步，步骤一中，进行超声波破碎处理时，超声波破碎仪以30％～40％的输出功率破碎细胞4～5min，每破碎3～5s间隔停顿3～5s。
进一步，步骤二中，所述将透析后的样品离心的条件为：将透析后的样品置于高速冷冻离心机中，于4℃、6000～8000rpm/min的条件下离心20～25min。
进一步，步骤二中，所述利用超滤膜进行过滤，包括：
利用30～40kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30～40kDa的杂蛋白。
进一步，步骤三中，所述强阴离子CaptoTM Q层析柱的规格为：1.5×20cm，柱床高度5～10cm，平衡和洗脱的流速均为0.6～1.2ml/min，洗脱总体积为400～500mL。
进一步，步骤三中，所述洗脱液为0～0.6MNaCl的1～25mmol/L，pH为6.0～7.0的PBS缓冲液。
进一步，步骤三中，所述利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理后，还包括：根据检测波长280的洗脱曲线，收集蛋白峰为5的红色液体，即可得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，操作简单，回收率高，纯度高并达到试剂级要求，大大降低了生产成本，为试剂级R-型藻红蛋白应用于医学检测，生物技术等领域奠定了基础。同时，本发明提供的R-型藻红蛋白经过CaptoTM Q离子交换柱层析一步纯化，纯度达到A566/A280＝5.7；采用CaptoTM Q离子交换柱层析具有纯化效果好、上样量大、样品得率高等特点。本发明所得纯化的R-藻红蛋白吸收光谱吸收峰分别为499nm，540nm，566nm，A566/A280达到5.0以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法流程图。
图2是本发明实施例提供的进行R-型藻红蛋白粗提液的获取方法流程图。
图3是本发明实施例提供的利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理的方法流程图。
图4是本发明实施例提供的利用强阴离子交换柱层析进行R-型藻红蛋白的分离纯化的方法流程图。
图5是本发明实施例提供的分离纯化后的R-型藻红蛋白的光谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法包括以下步骤：
S101，进行R-型藻红蛋白粗提液的获取；
S102，利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理；
S103，利用强阴离子交换柱层析进行R-型藻红蛋白的分离纯化。
如图2所示，本发明实施例提供的步骤S101，所述进行R-型藻红蛋白粗提液的获取，包括：
S201，选取大型经济海洋红藻龙须菜作为藻红蛋白分离纯化的；
S202，将冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜溶于灭菌蒸馏水中，经过冻结融解2～3h后，搅拌，并进行超声波破碎处理；
S203，将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中浸提，纱布过滤，离心，收集上清液，即可得到R-型藻红蛋白粗提液。
本发明实施例提供的PBS缓冲液的体积为所述大型经济海洋红藻龙须菜体积的10～30倍，所述PBS缓冲液为50～80mmol/L，pH 6.0～7.0。
本发明实施例提供的浸提的条件为：将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中，于4℃条件下，浸提24～48h。
本发明实施例提供的离心的方法为：将滤液置于8000～16000rpm/min的条件下离心15～20min。
本发明实施例在对大型经济海洋红藻龙须菜剪碎时，将-20℃条件下冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现红藻细胞的破壁。
本发明实施例在进行超声波破碎处理时，超声波破碎仪以30％～40％的输出功率破碎细胞4～5min，每破碎3～5s间隔停顿3～5s。
如图3所示，本发明实施例提供的步骤S102中，所述利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理，包括：
S301，将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，根据饱和度进行分级沉淀，并静置12～24h；
S302，静置后于4℃、12000～15000rpm/min的条件下离心20～30min，收集上清液和沉淀；
S303，取沉淀溶于灭菌蒸馏水并置于透析袋中进行蒸馏水透析，除去硫酸铵，并将透析后的样品离心，收集上清液；
S304，超滤膜过滤，即可得到经盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液。
本发明实施例提供的根据饱和度进行分级沉淀，包括：将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，于饱和度分别为20％、40％和60％时进行分级沉淀。
本发明实施例提供的将透析后的样品离心的条件为：将透析后的样品置于高速冷冻离心机中，于4℃、6000～8000rpm/min的条件下离心20～25min。
本发明实施例提供的利用超滤膜进行过滤，包括：利用30～40kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30～40kDa的杂蛋白。
如图4所示，本发明实施例提供的步骤S103中，所述利用强阴离子交换柱层析进行R-型藻红蛋白的分离纯化，包括：
S401，获取盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；
S402，利用离子交换层析技术将盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液进行强阴离子CaptoTM Q层析柱纯化；
S403，纯化后，利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理，得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白。
本发明实施例提供的强阴离子CaptoTM Q层析柱的规格为：1.5×20cm，柱床高度5～10cm，平衡和洗脱的流速均为0.6～1.2ml/min，洗脱总体积为400～500mL。
本发明实施例提供的洗脱液为0～0.6MNaCl的1～25mmol/L，pH为6.0～7.0的PBS缓冲液。
本发明实施例提供的利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理后，还包括：根据检测波长280nm的洗脱曲线，收集蛋白峰为5的红色液体，即可得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白。
本发明实施例在利用离子交换层析技术进行层析处理时，用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液的pH为8.0～8.5，清洗缓冲液中Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、EDTA溶液浓度为4.0～6.0mmol/L。
本发明实施例提供的分离纯化后的R-型藻红蛋白的光谱图见图5。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，所述龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法包括以下步骤：
步骤一，进行R-型藻红蛋白粗提液的获取：选取大型经济海洋红藻龙须菜作为藻红蛋白分离纯化的原料；将冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜剪碎，浸泡灭菌蒸馏水中，经过冻结融解2～3次后，搅拌，并进行超声波破碎处理；将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中浸提，纱布过滤，离心，收集上清液，即可得到R-型藻红蛋白粗提液；
在对大型经济海洋红藻龙须菜剪碎后，将-20℃条件下冷冻保存的大型经济海洋红藻龙须菜在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现红藻细胞的破壁；
步骤二，利用硫酸铵沉淀法进行R-型藻红蛋白粗提液的盐析处理：将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，根据饱和度进行分级沉淀，并静置12～24h；静置后于4℃、12000～15000rpm/min的条件下离心20～30min，收集沉淀；取沉淀溶于灭菌蒸馏水并置于透析袋中进行蒸馏水透析，除去硫酸铵，并将透析后的样品离心，收集上清液；超滤膜过滤，即可得到经盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；
所述根据饱和度进行分级沉淀，包括：
将得到的R-型藻红蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，于饱和度分别为20％、40％、和60％时进行分级沉淀；
步骤三，利用强阴离子交换柱层析进行R-型藻红蛋白的分离纯化：获取盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液；利用离子交换层析技术将盐析处理后的R-型藻红蛋白提取液进行强阴离子CaptoTM Q层析柱纯化；纯化后，利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理，得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白；
利用离子交换层析技术进行层析处理时，用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液的pH为8.0～8.5，清洗缓冲液中Tris-HCl浓度为15～25mmol/L、EDTA溶液浓度为4.0～6.0mmol/L。
2.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述PBS缓冲液的体积为所述大型经济海洋红藻龙须菜体积的10～30倍，所述PBS缓冲液浓度为70mmol/L，pH 6.0～7.0。
3.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述浸提的条件为：将粉碎的大型经济海洋红藻龙须菜置于PBS缓冲液中，于4℃条件下，浸提24～48h。
4.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述离心的方法为：将滤液置于8000～16000rpm/min的条件下离心15～20min。
5.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，进行超声波破碎处理时，超声波破碎仪以30％～40％的输出功率破碎细胞4～5min，每破碎3～5s间隔停顿3～5s。
6.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，所述将透析后的样品离心的条件为：将透析后的样品置于高速冷冻离心机中，于4℃、6000～8000rpm/min的条件下离心20～25min。
7.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，所述利用超滤膜进行过滤，包括：
利用30～40kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30～40kDa的杂蛋白。
8.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤三中，所述强阴离子CaptoTM Q层析柱的规格为：1.5×20cm，柱床高度5～10cm，平衡和洗脱的流速均为0.6～1.2mL/min，洗脱总体积为400～500mL。
9.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤三中，所述洗脱液为0～0.6mol/LNaCl的浓度为1～25mmol/L，pH为6.0～7.0的PBS缓冲液。
10.如权利要求1所述的龙须菜试剂级R-型藻红蛋白的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤三中，所述利用不同离子强度、pH梯度的洗脱液进行洗脱处理后，还包括：根据检测波长280nm的洗脱曲线，收集蛋白峰为5的红色液体，即可得到分离纯化后的高浓度的R-型藻红蛋白。
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