CN108070032B - 一种重组人源胶原蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，先采用固液分离技术、过滤技术以及超滤技术对大批量的重组人源胶原蛋白进行粗纯，然后用离子交换层析技术进行精纯，所得目标蛋白纯度大于98％，收率大于70％。本发明工艺过程更简单、易操作，对纯化成本要求低，可满足重组人源胶原蛋白工业化生产要求。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白的分离纯化方法。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％～33％，可作为食品添加剂、絮凝剂、乳胶材料、固定化酶载体材料。胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构。每条α-肽链由多达300个以上的Gly-X-Y三联体重复构成，两端连接具有不同结构的其它小片段。
在现有技术中，生产胶原蛋白传统的也是最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织，为提高胶原蛋白的生物安全性、纯度及活性，拓宽其在化妆品和医疗器械等领域的应用。基因工程技术被广泛应用。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研究开发重组人源胶原蛋白，西北大学的范代娣等利用大肠杆菌通过高密度发酵培养生产类人胶原蛋白。中国专利201110327865公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，构建了毕赤酵母重组人缘胶原蛋白的基因工程菌，获得了重组人源胶原蛋白。这两种方法都实现了产业化，但在生产过程中，主要的生产成本和工艺难点都在分离纯化阶段。大肠杆菌需要进行菌体收集及破壁，到最后的蛋白复性，毕赤酵母重组人源胶原蛋白分离纯化过程中的发酵液脱色，纯化过程蛋白稳定性等均存在问题。
发明内容
本发明针对现有重组人源胶原蛋白生产存在的问题，提供一种操作简单，所需溶剂少，纯化成本低廉，适合规模化重组人源胶原蛋白纯化的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、粗分离
将重组人源胶原蛋白发酵液用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为6K的超滤膜进行超滤。
2、精细分离纯化
向步骤1超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.1～5.8mS/cm，再用NaOH调节pH至4.5～6.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为95:5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30的混合液洗脱，洗脱流速均为150～250L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组人源胶原蛋白，其中所述的流动相A是20～50mmol/L pH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；流动相B是含1mol/L NaCl的20～50mmol/L pH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液。
本发明重组人源胶原蛋白的氨基酸数量为411个，分子量为37.2KDa，PI为8.9～9.2，氨基酸序列如下所示：
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上述步骤1中，优选所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤过程中，压力不得高于0.15MPa。
上述步骤1中，进一步优选所述截留分子量为6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于0.05MPa。
上述步骤2中，优选所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.06mmol/mL，线性流速不得高于10mL/cm，进一步优选所述高流速琼脂糖弱阳离子交换填料的粒径为45～150μm。
本发明纯化方法中离心、过滤技术均为成熟工艺，操作简单，成本低，适合大规模生产；采用6K超滤膜对滤出液进行超滤、浓缩、脱盐，此过程还可除去一些小分子物质，效率相比传统的凝胶层析脱盐，除小分子物质效率高，易操作；最后进行一步离子交换层析，得到的重组人源胶原蛋白纯度在98％以上，收率高达70％以上。本发明整个纯化工艺简单，工艺稳定，成本低廉，是一种理想的大规模重组人源胶原的纯化方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。
下面实施例中含有重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵液的制备方法为：将设计并人工合成的重组人源胶原蛋白核苷酸序列(GGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCATAA)插入质粒中，并提取该质粒，线性化后经电转化毕赤酵母GS115宿主菌，平板筛选得到含有重组人源胶原蛋白目的基因的转化子，将得到的转化子用BMGY培养基摇瓶培养24h，作为一级种子在5L发酵罐中培养18h，作为二级种子接种到150L发酵罐中进行发酵生产，其中重组人源胶原蛋白的氨基酸数量为411个，分子量为37.2KDa，PI为8.9～9.2，氨基酸序列如下所示：
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实施例1
1、粗分离
将104L含有重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵液放入沉降式离心机，2000r/min离心60min，通过撇液管收集上清液68L。将68L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤除菌并除去一些大分子物质，过滤压力为0.05MPa，并且在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液85L。再将收集的85L滤出液用截留分子量为6K的卷式超滤膜超滤浓缩脱盐，超滤压力为0.02MPa，得到10L浓缩液。
2、精细分离纯化
向步骤1超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.13mS/cm，再用NaOH调节pH至4.6，然后通过高效液相色谱过弱阳离子交换层析柱进行纯化，填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.06mmol/mL，线性流速不得高于10mL/cm，粒径为45～150μm。纯化时先用20mmol/L pH＝4.6的柠檬酸缓冲液洗脱未结合杂质及杂蛋白，再用20mmol/L pH＝4.6的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的20mmol/L pH＝4.6的柠檬酸缓冲液体积比为95:5的混合液洗脱与层析柱结合的杂蛋白，最后用20mmol/LpH＝4.6的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的20mmol/L pH＝4.6的柠檬酸缓冲液体积比为90:10的混合液洗脱目的蛋白，洗脱流速均为150mL/min，收集用20mmol/L pH＝4.6的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的20mmol/L pH＝4.6的柠檬酸缓冲液体积比为90:10的混合液洗脱的洗脱液，得到纯度为98.21％的重组人源胶原蛋白，收率为75％。
实施例2
1、粗分离
将110L含有重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵液放入沉降式离心机，2000r/min离心60min，通过撇液管收集上清液70L。将70L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤除菌并除去一些大分子物质，过滤压力为0.14MPa，并且在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液87L。再将收集的87L滤出液用截留分子量为6K的卷式超滤膜超滤浓缩脱盐，超滤压力为0.05MPa，得到8L浓缩液。
2、精细分离纯化
向步骤1超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为5.60mS/cm，再用NaOH调节pH至5.2，然后通过高效液相色谱过弱阳离子交换层析柱进行纯化，填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.06mmol/mL，线性流速不得高于10mL/cm，粒径为45～150μm。纯化时先用50mmol/L pH＝5.2的柠檬酸缓冲液洗脱未结合杂质及杂蛋白，再用50mmol/L pH＝5.2的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的50mmol/L pH＝5.2的柠檬酸缓冲液体积比为95:5的混合液洗脱与层析柱结合的杂蛋白，最后用50mmol/LpH＝5.2的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的50mmol/L pH＝5.2的柠檬酸缓冲液体积比为80:20的混合液洗脱目的蛋白，洗脱流速均为200mL/min，收集用50mmol/L pH＝5.2的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的50mmol/L pH＝5.2的柠檬酸缓冲液体积比为80:20的混合液洗脱的洗脱液，得到纯度为98.69％的重组人源胶原蛋白，收率为74％。
实施例3
1、粗分离
将112L含有重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵液放入沉降式离心机，2000r/min离心60min，通过撇液管收集上清液70L。将70L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤除菌并除去一些大分子物质，过滤压力为0.05MPa，并且在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液87L。再将收集的87L滤出液用截留分子量为6K的卷式超滤膜超滤浓缩脱盐，超滤压力为0.03MPa，得到12L浓缩液。
2、精细分离纯化
向步骤1超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为3.60mS/cm，再用NaOH调节pH至6.0，然后通过高效液相色谱过弱阳离子交换层析柱进行纯化，填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.06mmol/mL，线性流速不得高于10mL/cm，粒径为45～150μm。纯化时先用30mmol/L pH＝6.0的柠檬酸缓冲液洗脱未结合杂质及杂蛋白，再用30mmol/L pH＝6.0的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的30mmol/L pH＝6.0的柠檬酸缓冲液体积比为95:5的混合液洗脱与层析柱结合的杂蛋白，最后用30mmol/LpH＝6.0的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的30mmol/L pH＝6.0的柠檬酸缓冲液体积比为70:30的混合液洗脱目的蛋白，洗脱流速均为250mL/min，收集用30mmol/L pH＝6.0的柠檬酸缓冲液与含1mol/L NaCl的30mmol/L pH＝6.0的柠檬酸缓冲液体积比为70:30的混合液洗脱的洗脱液，得到纯度为98.45％的重组人源胶原蛋白，收率为80％。
Claims (5)
1.一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：
（1）粗分离
将重组人源胶原蛋白发酵液用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2µm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为6K的超滤膜进行超滤；
（2）精细分离纯化
向步骤（1）超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.1～5.8mS/cm，再用NaOH调节pH至4.5～6.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为95:5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30的混合液洗脱，洗脱流速均为150～250L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30时的洗脱液，得到纯度大于98%的重组人源胶原蛋白；
上述的流动相A是20～50mmol/L pH=4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；流动相B是含1mol/LNaCl的20～50mmol/L pH=4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；
所述的重组人源胶原蛋白的氨基酸数量为411个，分子量为37.2KDa，PI为8.9～9.2，氨基酸序列如下所示：
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2.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：在步骤（1）中，所得上清液用0.2µm中空纤维膜进行过滤过程中，压力不得高于0.15MPa。
3.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：在步骤（1）中，所述截留分子量为6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于0.05MPa。
4.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.06mmol/mL，线性流速不得高于10mL/cm。
5.根据权利要求4所述的重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述高流速琼脂糖弱阳离子交换填料的粒径为45～150μm。
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