CN113230892B - 一种用于超滤纯化胶原蛋白的超滤膜及纯化胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于超滤纯化胶原蛋白的超滤膜及纯化胶原蛋白的方法，所述的超滤膜为中空纤维膜，其膜丝长度/膜丝内径的比值为25～1000。优选所述中空纤维膜由亲水性有机材料制成，丝膜内径为0.6～3mm，截留孔径为0.001μm～0.12μm。将胶原蛋白预处理后分散于分散介质中，采用所述的超滤膜对其进行超滤即可获得纯度＞99％的胶原蛋白。该方法不仅不会堵塞超滤膜，显著提高胶原蛋白的纯化效率，且不会对胶原蛋白的分子结构、生物活性等造成影响。
Description
技术领域
本发明属于动物胶原纯化技术领域，具体涉及一种用于超滤纯化胶原蛋白的超滤膜及纯化胶原蛋白的方法。
背景技术
目前动物胶原蛋白一般采用透析的方法进行分离纯化，以达到保留目标蛋白、去除杂质的目的。但是透析纯化周期长、纯化介质消耗量大、纯化过程易产生污染，且纯化设备占地面积大。
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。但被截留的杂质在膜表面上不断积累，会产生浓差极化现象，当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降，这使得超滤的应用受到一定程度的限制。
胶原蛋白属于链状蛋白，具有高粘度、高吸水性、易成膜等特征，在超滤技术中，该蛋白极易堵塞超滤膜，要经常更换滤膜，且超滤极易破坏胶原蛋白的三螺旋结构，导致其失去生物活性。
中国发明专利，一种纯化Ⅰ型胶原蛋白的方法，CN107354192A，其为将稀释的胶原蛋白(0.1mg/ml～3mg/ml)，在0.05Mpa～1Mpa的压力下，进行超滤纯化，在纯化过程中不断加入纯化水，直至纯化后的胶原液pH值在4～7之间，即得到纯化后的Ⅰ型胶原蛋白。该方法适用于浓度较低的胶原蛋白，但若超滤量大或浓度高时就会造成堵孔，需要频繁更换滤膜。另外，其采用的超滤膜的截流分子量为100000道尔顿，因此综合来看，其只适用于分子量＞100000道尔顿、浓度较低的胶原蛋白液的纯化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有超滤纯化胶原蛋白的滤膜易于堵塞、需经常更换超滤膜，以及超滤效率低的技术问题。本发明的超滤膜，以及配套的超滤纯化胶原蛋白的方法，不仅不会堵塞超滤膜，显著提高胶原蛋白的纯化效率，且不会对胶原蛋白的分子结构、生物活性等造成影响。
本发明的目的是一种用于超滤纯化胶原蛋白的超滤膜。
本发明的另一目的是提供一种基于上述超滤膜的超滤纯化胶原蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
现有超滤纯化蛋白的技术中，基本关注和认为对超滤效果有影响的因素是超滤膜孔径和材质，均没有关注过超滤膜膜丝长度、内径等参数对超滤或过滤效果是否有影响，我们研究的结果显示，中空纤维膜的膜丝长度/内径的比值对胶原蛋白超滤纯化的效率以及产物活性都有着明显的影响。
目前市售的中空纤维超滤膜，其膜丝长度/内径的比值均在1000以上。例如改性聚氯乙烯膜的常规膜丝长度一般为1192mm，膜丝内径为0.9mm，膜丝长度/内径的比值为1324。根据我们的研究结果，现有的中空纤维超滤膜用于胶原蛋白超滤纯化的效率差强人意。
因此本发明提供了一种胶原蛋白超滤膜，其是膜丝长度/膜丝内径的比值为25～1000的中空纤维膜。
其中，优选地，所述的膜丝内径≥0.1mm，优选0.1～20mm，更优选0.6～3mm。
其中，优选地，所述的膜丝长度/膜丝内径比值为100～1000。
其中，优选地，所述的中空纤维膜由亲水性的有机材料制成，所述的亲水性的有机材料为聚醚砜树脂、聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚丙烯或合金聚氯乙烯中的任意一种。
其中，优选地，所述超滤膜的截留分子量为1kDa～300kDa，或膜孔尺寸为0.001μm～0.12μm。
一种超滤纯化胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将胶原蛋白液通过如上述的超滤膜进行超滤；
(2)往步骤(1)超滤后的胶原蛋白中加入相当于其体积的0.1～10倍的纯化介质，通过如上述的超滤膜进行循环超滤，得到纯化的胶原蛋白。
其中所述的胶原蛋白液是胶原蛋白粗提液或其它胶原蛋白相关原料。
其中，优选地，步骤(1)和步骤(2)的超滤采用的是外压式或内压式超滤，进料压力为0.01MPa～0.30MPa，出料端压力为0.01MPa～0.30MPa，跨膜压差为0.01MPa～0.3MPa，纯化介质流量为1L/min～500L/min。
其中，优选地，所述的分散介质为40％-80％的乙醇溶液、水、钠盐溶液、铵盐溶液或醋酸溶液。
其中，优选地，所述的纯化介质为40％-80％的乙醇溶液、水、钠盐溶液、铵盐溶液或醋酸溶液。
其中，优选地，所述超滤膜为管式/柱式超滤膜，按竖直方向(垂直于地面)摆放，超滤膜的平面与纯化介质的流向平行。
其中，优选地，所述加入纯化介质，其加入方式可以是持续补液或分次补液。
另外，如有必要，可以继续多次重复步骤(2)，提高胶原蛋白的纯度。
本发明的超滤膜和基于该超滤膜的超滤方法具有以下有益效果：
(1)超滤时，可用于高浓度的胶原蛋白的稀释或浓缩。
(2)不容易造成滤膜堵塞，无需频繁更换滤膜，简言之滤膜使用寿命长。
(3)纯化效率高，缩短纯化周期。
(4)适当的膜丝的内径或长度，降低纯化介质的剪切力。另外，超滤膜摩擦系数小，减少对胶原的摩擦，继而减少因结构变化而导致的胶原蛋白失活。
附图说明
图1是本发明实施例3的柱式超滤系统(工艺流程)示意图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1超滤纯化胶原蛋白的超滤膜的制备
委托广州海科滤膜科技有限公司制备了如表1和表2所示的超滤膜。
表1
表2
实施例2胶原蛋白粗提液制备
以牛筋腱作为提取原料为例说明本发明，但本发明的应用不限于牛筋腱。
1、非变性Ι型胶原蛋白的快速制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：选取牛筋腱2kg，解冻后去除牛筋腱上的筋膜和脂肪，用切片机切成2mm的片状，清洗干净，液氮冷冻粉碎。
(2)消毒：取步骤(1)的牛筋腱2kg，加入浓度为100ppm的双氧水溶液10L，消毒3次，每次3h，然后用纯化水清洗3～4次，直至洗净。
(3)泡胀：取步骤(2)的牛筋腱，加入5％柠檬酸溶液40L，室温浸泡3h。
(4)过滤1：用100目的不锈钢滤网过滤除去柠檬酸溶液，得到泡胀牛筋腱。
(5)匀浆：向步骤(4)处理的泡胀牛筋腱中加入80L纯化水，用搅拌机匀浆120s，重复2次。
(6)过滤2：用200目的不锈钢滤网进行过滤，除去溶液中的大颗粒物质，收集滤液，该滤液为胶原蛋白粗提液。
说明：在从生物组织结构中提取胶原蛋白时，因现有提取技术，会引入组织中的其他杂质，如其他蛋白、脂肪、多肽、氨基酸等
实施例3超滤膜的膜丝长度/内径筛选
将实施例2的胶原蛋白粗提液等分成8组，每组10kg，粗提液蛋白浓度为5～8mg/mL。分别采用实施例1所述的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K编号的超滤膜进行超滤。
1.该8组溶液分别通过柱式超滤系统(如图1所示)将含杂质的胶原蛋白粗提液进行浓缩至至约8kg。
2.在超滤系统中，向已浓缩的胶原蛋白溶液中加入20kg纯化水后，继续浓缩至8kg。
3.重复步骤2，重复8次后。
其中超滤系统参数的设置均为：进料压力(0.2MPa)、出料端压力(0.08MPa)、跨膜压(0.14MPa)、流量(147L/min)、恒量纯化(持续补液)。
4.生物活性(促细胞增殖检测)：
将对数生长期3T3细胞用胰蛋白酶消化，配制成细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μL，使每孔细胞密度5000个，边缘孔用无菌PBS填充。5％CO2，37℃培养至细胞贴壁铺满孔底。
更换含胶原蛋白超滤液(0.1mg/mL)，阴性对照细胞更换不含胶原蛋白的完全培养基，继续培养2小时。
加入PBS漂洗洗脱未贴壁的细胞。
处理结束后，每个孔中分别加入10μL CCK-8溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育4小时。
用酶标仪测定在450nm处的吸光度。空白对照为培养基+CCK-8溶液。
增殖率(细胞活力)＝(实验组-空白对照)/(阴性对照-空白对照)×100％
5.三螺旋结构完整性(羟脯氨酸衍生后含量)：
称取60g胶原蛋白超滤液，调节pH为3.6。
加入3g胰蛋白酶溶液，常温震荡4小时。
加入0.5mL预冷的30％的TCA溶液，震荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min，保留沉淀。用10％TCA溶液洗涤沉淀。
往沉淀中加入10mL水和1mLα-氨基丁酸，并用6M的氢氧化钠调节pH至8.2。用水定容至25mL得到稀释液，吸取1mL用0.22μm滤膜过滤待用。
取10μL稀释液于样品管中，加入70μL AccQ·Fluor硼酸盐缓冲液到样品中，涡旋混合10秒，再加入20μLAccQ·Fluor衍生剂到样品管中，涡旋混合。55℃加热10min后HPLC检测。
色谱条件：Waters AccQ·Tag(3.9x150)mm；柱温：37℃；进样量：10μL，流速：1mL/min。流动相：由(A)Eluent A缓冲溶液；(B)纯化水；(C)乙腈组成。
三螺旋结构完整性计算公式：
式中：
NC——样品中具有完整三股螺旋结构胶原蛋白的含量，单位为％；
X2和X1分别为酶解后，酶解前样品中羟脯氨酸的含量，单位为mg/g
6.结果如表3所示
表3
实施例4超滤膜材质和孔径筛选
将实施例2的胶原蛋白粗提液等分成8组，每组10kg，粗提液蛋白浓度约为5～8mg/mL。分别采用实施例1所述的L、M、N、O、P、Q、R和S编号的超滤膜进行超滤。
1.该8组溶液分别通过柱式超滤系统将含杂质的胶原蛋白粗提液进行浓缩至至约8kg。
2.在超滤系统中，向已浓缩的胶原蛋白溶液中加入20kg纯化水后，继续浓缩至8kg
3.重复步骤2，重复4次后。
超滤系统参数的设置均为：进料压力(0.2MPa)、出料端压力(0.08MPa)、跨膜压(0.14MPa)、流量(147L/min)、恒量纯化(持续补液)。
4.生物活性(促细胞增殖检测)如实施例3的操作进行。
5.三螺旋结构完整性检测如实施例3的操作进行
6.结果如表4所示。
表4
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.超滤膜在超滤纯化胶原蛋白中的应用，其特征在于，所述胶原蛋白为Ι型胶原蛋白，在超滤前Ι型胶原蛋白液的浓度为5～8mg/mL；所述超滤膜的膜丝长度/膜丝内径比值为750，膜丝长度为300 mm，膜丝内径为0.4mm，膜面积为1.6m2；所述的超滤膜为中空纤维超滤膜，所述中空纤维超滤膜的材料为聚乙烯，此时其截留分子量为300 kDa，或所述中空纤维超滤膜的材料为聚偏氟乙烯、聚丙烯或合金聚氯乙烯中的任意一种，此时其孔径为0.12 μm；
通过所述超滤膜进行循环超滤，得到纯化的Ι型胶原蛋白。
2.一种超滤纯化Ι型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将Ι型胶原蛋白液通过权利要求1中所述超滤膜进行超滤；在超滤前Ι型胶原蛋白液的浓度为5～8mg/mL；
（2）往步骤（1）超滤后的Ι型胶原蛋白中加入相当于其体积的0.1～10倍的纯化介质，通过权利要求1中所述超滤膜进行循环超滤，得到纯化的胶原蛋白。
3.如权利要求2所述的一种超滤纯化Ι型胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）的超滤采用的是外压式或内压式超滤，进料压力为0.01MPa～0.30MPa，出料端压力为0.01MPa～0.30MPa，跨膜压差为0.01MPa～0.3MPa，纯化介质流量为1L/min～500L/min。
4.如权利要求2所述的一种超滤纯化Ι型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述的纯化介质为40%-80%的乙醇溶液、水、钠盐溶液、铵盐溶液或醋酸溶液。
5.如权利要求2所述的一种超滤纯化Ι型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述加入纯化介质的方式是持续补液或分次补液。
6.如权利要求2～5任一所述的一种超滤纯化Ι型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述超滤膜的平面与纯化介质的流向平行。
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