CN103122027A - 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 - Google Patents
一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103122027A CN103122027A CN2012104825432A CN201210482543A CN103122027A CN 103122027 A CN103122027 A CN 103122027A CN 2012104825432 A CN2012104825432 A CN 2012104825432A CN 201210482543 A CN201210482543 A CN 201210482543A CN 103122027 A CN103122027 A CN 103122027A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- collagen protein
- human source
- recombination
- recombination human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 96
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 53
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 28
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108010009595 Inorganic Pyrophosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102100027050 Inorganic pyrophosphatase Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108010077465 Tropocollagen Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000003161 proteinsynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组人源胶原蛋白及其生产方法，属于基因工程技术领域。一种重组人源胶原蛋白，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。生产步骤为：大肠杆菌基因工程菌的构建；大肠杆菌基因工程菌的发培养；重组人源胶原蛋白的诱导和表达；重组人源胶原蛋白的纯化。本发明采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本低，产量高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种重组人源胶原蛋白及其生产方法。
背景技术
胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25%~35%。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。
然而，天然胶原蛋白无法溶于水，性质不均一，很难被人体利用，往往需要利用化学手段处理之后使用。而且，当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，很难避免病毒感染，同时无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状。如果从人胎盘原料中提取，不仅来源有限，更面临法律的严惩。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。
从结构上来说，人体天然的胶原蛋白的结构非常的复杂，所以才导致人源胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。天然胶原分子形成了一种特殊的超螺旋结构，由三条无链内氢键形成而仅受链间氢键支撑的多肽链组成。这种螺旋性的结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这3个氨基酸残基通常为Gly-X-Pro。Gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链，可以使胶原蛋白紧密堆积。在更高级的结构层次上，胶原超螺旋会进一步缔合成为胶原原纤维。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人源胶原蛋白及其生产方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种重组人源胶原蛋白，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。
进一步地，上述的重组人源胶原蛋白为HC8，为单链结构，包括氨基酸257个，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
所述人源胶原蛋白HC8的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
上述的人源胶原蛋白为HC16，为单链结构，包括氨基酸501个，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，其末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
所述人源胶原蛋白HC16的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
上述的重组人源胶原蛋白的生产方法，包括如下步骤：
（1）大肠杆菌基因工程菌的构建；
（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；
（3）重组人源胶原蛋白的诱导和表达；
（4）重组人源胶原蛋白的纯化。
其中，步骤（1）中所述大肠杆菌基因工程菌的构建，步骤如下：（1）优化选择人的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组基因；（2）将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。
步骤（2）中所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养，步骤如下：（1）挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于5ml的LB培养基中37℃培养过夜；（2）将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入IPTG进行诱导，20℃继续培养16小时，离心收集菌体。
步骤（4）中所述重组人源胶原蛋白的纯化，步骤如下：（1）用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；（2）利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
（1）本发明首次选择的III型胶原蛋白序列为长期筛选优化的序列；
（2）采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大， 20小时即可完成一轮发酵，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量；
（3）生产的重组人源胶原蛋白具有非常好的亲水性和稳定性，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100%相同，应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业；
（4）本发明产品经过活性检测，具有达到甚至超过人体天然蛋白的生物学活性，是目前报道过的最优化的胶原蛋白设计方案，可以在人体中行使天然蛋白的功能，达到真正的产品应用的目的。
附图说明
图1为本发明载体pET32a-HC8和pET32a-HC16构建的质粒图谱；
图2为本发明HC8和HC16蛋白纯化后的电泳图；
图3为本发明HC8和HC16蛋白与人胶原蛋白相对照的生物活性检测结果。以人胶原蛋白的细胞黏附活性为1，显示HC8和HC16样品的相对细胞黏附活性。
具体实施方式
实施例1：HC8基因表达载体的构建及表达
一、人源胶原蛋白HC8全长基因序列经过密码子优化后如下所示：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc
HC8基因全长771bp，利用PCR的方法克隆扩增此DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因。利用引物上加入的Nco I和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET32a-HC8重组表达载体。
二、将正确的pET32a-HC8质粒转化大肠杆菌BL21，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，20℃培养8-10小时（时间再延长会进一步提高产量），离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
三、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌（可选），在冰水混合物环境下超声破菌（2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃），12000rpm/min离心20min，收集上清液。此时溶液中即含有大量的Trx-HC8重组蛋白。
四、用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱（Ni-NTA His-Bind Resin）柱材，然后将柱材和Trx-HC8的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有15mM 咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的Trx-HC8，在柱上加入适量具有His标签的Prescission Protease（简称PPase）蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将HC8蛋白从柱上释放出来，用PBS溶液洗脱HC8蛋白，所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。
五、所得HC8蛋白利用SDS-PAGE检测纯度，并与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。
实施例2 HC16基因表达载体的构建及表达
一、人源胶原蛋白HC16全长基因序列经过密码子优化后如下所示：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc
HC16基因全长1503bp，利用PCR的方法克隆扩增此DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因。利用引物上加入的Nco I和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET32a-HC16重组表达载体。
二、将正确的pET32a-HC16质粒转化大肠杆菌BL21，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，20℃培养8-10小时（时间再延长会进一步提高产量），离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
三、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌（可选），在冰水混合物环境下超声破菌（2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃），12000rpm/min离心20min，收集上清液，此时溶液中即含有大量的Trx-HC16重组蛋白。
四、用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱（Ni-NTA His-Bind Resin）柱材，然后将柱材和Trx-HC16的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱；用含有15mM 咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的Trx-HC16；在柱上加入适量含有His标签的Prescission Protease（简称PPase）蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将HC16蛋白从柱上释放出来；用PBS溶液洗脱HC16蛋白；所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。
五、所得HC16蛋白利用SDS-PAGE检测纯度，并与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。
图1为pET-32a的质粒图谱说明，以及多克隆位点的展开示意图，显示插入的HC8或HC16的基因片段和人工构建的Prescission Protease蛋白酶切位点。图2 为纯化后的HC8和HC16的SDS-PAGE电泳结果，显示正确的蛋白大小和较高的蛋白纯度。图3 为HC8和HC16的蛋白活性检测结果，人胶原为商品化的人胶原蛋白，为阳性对照，PBS是空白缓冲液，由此可见，HC8和HC16的蛋白对于细胞有很强的黏附性，可以短时间内帮助细胞营造微环境，辅助细胞与基质相互结合，具有超过天然蛋白的高生物活性。
实施例3 HC8和HC16蛋白检测活性
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649 (2004)。具体实施方法如下：
1，利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括对照人胶原蛋白（Sigma, C7774），HC8和HC16样品。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)=144X(A215-A225) 计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。（参考文献为Walker JM. The Protein Protocols Handbook, second edition. Humana Press. 43-45.）。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
2，向96孔板中加入100μl各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min。
3，每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞，37度孵育60min。
4，每孔用PBS清洗4次。
5，用LDH检测试剂盒（Roche,04744926001）检测OD492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁程度。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。以人胶原蛋白的贴壁率为1，可以测算出HC8和HC16样品的相对细胞黏附活性。
Claims (9)
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，该人源胶原蛋白的结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端氨基酸序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。
2.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述的人源胶原蛋白为HC8，为单链结构，包括氨基酸257个，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端氨基酸序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
3.根据权利要求2所述的一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述人源胶原蛋白HC8的DNA序列如下：
Ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
4.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述的人源胶原蛋白为HC16，为单链结构，包括氨基酸501个，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，其末端氨基酸序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段，序列如下：
gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg。
5.根据权利要求4所述的一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述人源胶原蛋白HC16的DNA序列如下：
ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc。
6.权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）大肠杆菌基因工程菌的构建；
（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；
（3）重组人源胶原蛋白的诱导和表达；
（4）重组人源胶原蛋白的纯化。
7.根据权利要求6所述的重组人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，步骤（1）中所述大肠杆菌基因工程菌的构建，步骤如下：
（1）优化选择人的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组基因；
（2）将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。
8.根据权利要求6所述的重组人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，步骤（2）中所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养，步骤如下：
（1）挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于5ml的LB培养基中37℃培养过夜；
（2）将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入IPTG进行诱导，20℃继续培养16小时，离心收集菌体。
9.根据权利要求6所述的重组人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，步骤（4）中所述重组人源胶原蛋白的纯化，步骤如下：
（1）用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；
（2）利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210482543.2A CN103122027B (zh) | 2012-11-26 | 2012-11-26 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210482543.2A CN103122027B (zh) | 2012-11-26 | 2012-11-26 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103122027A true CN103122027A (zh) | 2013-05-29 |
| CN103122027B CN103122027B (zh) | 2014-05-14 |
Family
ID=48453199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210482543.2A Active CN103122027B (zh) | 2012-11-26 | 2012-11-26 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103122027B (zh) |
Cited By (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104548071A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-29 | 太原锦波生物医药科技有限公司 | 用于阴道干涩症的重组人源胶原蛋白阴道凝胶及制备方法 |
| CN104667335A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-06-03 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 皮肤屏障功能或痔的重组人源胶原蛋白产品及制备方法 |
| CN106046151A (zh) * | 2016-08-19 | 2016-10-26 | 易金阳 | 一种重组人源可溶高活性ⅰ型胶原蛋白及其制备方法 |
| CN106215250A (zh) * | 2016-08-26 | 2016-12-14 | 易金阳 | 一种用于阴道松弛的重组人源i型胶原蛋白凝胶支架及其制备方法 |
| CN106309151A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-01-11 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 蛋白维他命粉红面膜液及生产方法 |
| CN108048511A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-05-18 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN108070032A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-05-25 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种重组人源胶原蛋白的纯化方法 |
| CN109593126A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-04-09 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 多肽、其生产方法和用途 |
| CN109593127A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-04-09 | 暨南大学 | 基因重组胶原样肽mjlgg-34及其制备方法与应用 |
| CN110194795A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-03 | 郭伟 | 一种重组人源胶原蛋白及其应用 |
| CN111317866A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-06-23 | 四川大学 | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法 |
| CN111560066A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-21 | 紫水晶(山西)再生医学科技有限公司 | 一种医用重组人源胶原蛋白及其制造方法 |
| CN111569160A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-25 | 四川大学 | 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法 |
| CN111662377A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-09-15 | 卡杜兰(广州)生命基因工程科技有限公司 | 一种快速去除皱纹使皮肤年轻化的混合物料的制备方法 |
| CN111944057A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-17 | 广州启妆生物科技有限公司 | 一种重组人胶原蛋白肽及其应用 |
| CN113185612A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-30 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种酿酒酵母表达长效重组iii型胶原蛋白及其在化妆品中的应用 |
| CN113476593A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-10-08 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组人源化胶原蛋白的用途及其相关组合物和制备方法 |
| CN113621052A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-09 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
| CN113683680A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途 |
| CN113683681A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途 |
| CN113683678A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途 |
| CN113713086A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-30 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种含有重组iii型人源化胶原蛋白的组合物及其制备方法和用途 |
| CN113880941A (zh) * | 2020-07-03 | 2022-01-04 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用 |
| CN114085284A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-25 | 西安德诺海思医疗科技有限公司 | 一种重组iii型人源化胶原蛋白、核酸、载体及植入剂 |
| CN114671946A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-06-28 | 河北纳科生物科技有限公司 | 一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
| CN114940712A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-08-26 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
| CN115521372A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-12-27 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
| CN116286914A (zh) * | 2023-03-17 | 2023-06-23 | 南京斯拜科生物科技股份有限公司 | 一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用 |
| CN116715754A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-08 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 多肽及其用途 |
| CN116836264A (zh) * | 2023-06-01 | 2023-10-03 | 广东完美生命健康科技研究院有限公司 | 一种重组人源化纤连蛋白rhFEB及应用 |
| CN117024569A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-11-10 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 生物合成人体结构性材料viii型胶原蛋白的方法 |
| WO2023216099A1 (zh) * | 2022-05-07 | 2023-11-16 | 四川大学 | 具有心肌组织修复功能的抗心衰可注射水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN117126874A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-11-28 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 大规模制备164.88°三螺旋结构胶原蛋白生物方法 |
| CN117646013A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-05 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 重组人源化胶原蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用 |
| WO2024074119A1 (zh) * | 2022-10-08 | 2024-04-11 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组胶原蛋白及其在软骨修复基质中的用途 |
| CN117903288A (zh) * | 2024-01-25 | 2024-04-19 | 广州市科臣生物技术有限公司 | 一种重组iii型胶原蛋白水光精华液的制备方法及其功效测试方法 |
| WO2024119724A1 (zh) * | 2022-12-06 | 2024-06-13 | 武汉佳惟达生物科技有限公司 | 胶原蛋白肽及其制备方法和用途 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104402975B (zh) * | 2014-12-11 | 2017-06-30 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 抗衰老短肽及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1793177A (zh) * | 2006-01-09 | 2006-06-28 | 浙江理工大学 | 一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法 |
| CN102020716A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-04-20 | 西安华澳丽康生物工程有限公司 | 基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用 |
-
2012
- 2012-11-26 CN CN201210482543.2A patent/CN103122027B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1793177A (zh) * | 2006-01-09 | 2006-06-28 | 浙江理工大学 | 一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法 |
| CN102020716A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-04-20 | 西安华澳丽康生物工程有限公司 | 基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JUMING YAO ET AL: "Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens", 《J. BIOCHEM》 * |
| 杜春玲等: "胶原蛋白结构基础上的设计与合成", 《生物工程学报》 * |
Cited By (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104548071A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-29 | 太原锦波生物医药科技有限公司 | 用于阴道干涩症的重组人源胶原蛋白阴道凝胶及制备方法 |
| CN104667335A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-06-03 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 皮肤屏障功能或痔的重组人源胶原蛋白产品及制备方法 |
| CN104548071B (zh) * | 2015-01-27 | 2017-02-22 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 用于阴道干涩症的重组人源胶原蛋白阴道凝胶及制备方法 |
| CN106046151A (zh) * | 2016-08-19 | 2016-10-26 | 易金阳 | 一种重组人源可溶高活性ⅰ型胶原蛋白及其制备方法 |
| CN106309151A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-01-11 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 蛋白维他命粉红面膜液及生产方法 |
| CN106215250A (zh) * | 2016-08-26 | 2016-12-14 | 易金阳 | 一种用于阴道松弛的重组人源i型胶原蛋白凝胶支架及其制备方法 |
| CN108048511A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-05-18 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN108048511B (zh) * | 2018-01-18 | 2020-08-11 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN108070032A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-05-25 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种重组人源胶原蛋白的纯化方法 |
| CN108070032B (zh) * | 2018-01-23 | 2021-12-21 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种重组人源胶原蛋白的纯化方法 |
| CN109593126A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-04-09 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 多肽、其生产方法和用途 |
| CN109593126B (zh) * | 2018-11-28 | 2019-11-22 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 多肽、其生产方法和用途 |
| EP3660045A1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-06-03 | Shanxi Jinbo Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptide, process for the production thereof and use thereof |
| US11396537B2 (en) | 2018-11-28 | 2022-07-26 | Shanxi Jinbo Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptide, process for the production thereof and use thereof |
| CN109593127A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-04-09 | 暨南大学 | 基因重组胶原样肽mjlgg-34及其制备方法与应用 |
| CN110194795A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-03 | 郭伟 | 一种重组人源胶原蛋白及其应用 |
| CN111317866A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-06-23 | 四川大学 | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法 |
| US20210322641A1 (en) * | 2020-04-21 | 2021-10-21 | Sichuan University | Anti-thrombotic and endothelialization-enhanced bioprosthetic valve material and preparation method thereof |
| CN111560066A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-21 | 紫水晶(山西)再生医学科技有限公司 | 一种医用重组人源胶原蛋白及其制造方法 |
| CN111569160A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-25 | 四川大学 | 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法 |
| CN111569160B (zh) * | 2020-05-26 | 2021-05-11 | 四川大学 | 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法 |
| CN113880941A (zh) * | 2020-07-03 | 2022-01-04 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用 |
| CN113880941B (zh) * | 2020-07-03 | 2023-11-28 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用 |
| CN111662377A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-09-15 | 卡杜兰(广州)生命基因工程科技有限公司 | 一种快速去除皱纹使皮肤年轻化的混合物料的制备方法 |
| CN111944057A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-17 | 广州启妆生物科技有限公司 | 一种重组人胶原蛋白肽及其应用 |
| CN113185612A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-30 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种酿酒酵母表达长效重组iii型胶原蛋白及其在化妆品中的应用 |
| CN113713086A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-30 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种含有重组iii型人源化胶原蛋白的组合物及其制备方法和用途 |
| CN113621052B (zh) * | 2021-08-23 | 2022-06-07 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
| CN113621052A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-09 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
| CN113476593A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-10-08 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组人源化胶原蛋白的用途及其相关组合物和制备方法 |
| CN113683681B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-10-03 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途 |
| CN113683681A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途 |
| CN113683678A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途 |
| CN113683680A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-23 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途 |
| CN113683678B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-11-24 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途 |
| CN113683680B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-11-03 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途 |
| CN114085284A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-25 | 西安德诺海思医疗科技有限公司 | 一种重组iii型人源化胶原蛋白、核酸、载体及植入剂 |
| CN114671946A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-06-28 | 河北纳科生物科技有限公司 | 一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
| CN114671946B (zh) * | 2021-12-24 | 2022-11-01 | 河北纳科生物科技有限公司 | 一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2023216099A1 (zh) * | 2022-05-07 | 2023-11-16 | 四川大学 | 具有心肌组织修复功能的抗心衰可注射水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN115521372B (zh) * | 2022-05-31 | 2024-06-07 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
| CN115521372A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-12-27 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
| CN114940712A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-08-26 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
| CN114940712B (zh) * | 2022-06-01 | 2023-12-26 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
| WO2024074119A1 (zh) * | 2022-10-08 | 2024-04-11 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组胶原蛋白及其在软骨修复基质中的用途 |
| WO2024119724A1 (zh) * | 2022-12-06 | 2024-06-13 | 武汉佳惟达生物科技有限公司 | 胶原蛋白肽及其制备方法和用途 |
| CN116286914A (zh) * | 2023-03-17 | 2023-06-23 | 南京斯拜科生物科技股份有限公司 | 一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用 |
| CN116286914B (zh) * | 2023-03-17 | 2024-04-16 | 南京斯拜科生物科技股份有限公司 | 一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用 |
| CN116715754A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-08 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 多肽及其用途 |
| CN116715754B (zh) * | 2023-05-12 | 2024-03-12 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 多肽及其用途 |
| CN116836264B (zh) * | 2023-06-01 | 2024-02-20 | 广东完美生命健康科技研究院有限公司 | 一种重组人源化纤连蛋白rhFEB及应用 |
| CN116836264A (zh) * | 2023-06-01 | 2023-10-03 | 广东完美生命健康科技研究院有限公司 | 一种重组人源化纤连蛋白rhFEB及应用 |
| CN117024569B (zh) * | 2023-07-18 | 2024-05-10 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 生物合成人体结构性材料viii型胶原蛋白的方法 |
| CN117024569A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-11-10 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 生物合成人体结构性材料viii型胶原蛋白的方法 |
| CN117126874B (zh) * | 2023-09-28 | 2024-04-16 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 大规模制备164.88°三螺旋结构胶原蛋白生物方法 |
| CN117126874A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-11-28 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 大规模制备164.88°三螺旋结构胶原蛋白生物方法 |
| CN117903288A (zh) * | 2024-01-25 | 2024-04-19 | 广州市科臣生物技术有限公司 | 一种重组iii型胶原蛋白水光精华液的制备方法及其功效测试方法 |
| CN117903288B (zh) * | 2024-01-25 | 2024-08-20 | 广州市科臣生物技术有限公司 | 一种重组iii型胶原蛋白水光精华液的制备方法及其功效测试方法 |
| CN117646013A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-05 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 重组人源化胶原蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103122027B (zh) | 2014-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103122027B (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 | |
| WO2021083072A1 (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| CN109593126B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
| CN110194795A (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其应用 | |
| CN109293783B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
| CN110204608A (zh) | 一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用 | |
| CN108822209A (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
| CN100391974C (zh) | 一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法 | |
| CN110003324A (zh) | 重组人源胶原蛋白及其应用 | |
| CN110128521A (zh) | 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 | |
| CN104402975B (zh) | 抗衰老短肽及其制备方法 | |
| CN102618552B (zh) | 一种重组艾塞那肽的生产工艺 | |
| CN110903383A (zh) | 一种重组人源i型胶原蛋白、编码基因、工程菌及其应用 | |
| CN100362020C (zh) | 一种重组动物丝－rgd融合蛋白及其生物合成方法 | |
| Zhao et al. | Green biomanufacturing in recombinant collagen biosynthesis: trends and selection in various expression systems | |
| CN101948519A (zh) | 厚壳贻贝足丝黏附蛋白及其编码序列和制备方法 | |
| CN105463006A (zh) | 重组人表皮生长因子的新型制备方法 | |
| CN102702335B (zh) | 重组转录激活子样效应因子、转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因及应用 | |
| CN102206282A (zh) | 一种高效生产Trx-hCTRP2的方法 | |
| CN101413009A (zh) | 一种改构的人淀粉样多肽突变体－普兰林肽(pramlintide)的制备方法 | |
| CN102898512B (zh) | 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途 | |
| CN104892769B (zh) | 一种溶血素融合蛋白PeLa‑EK‑10His‑SLO及其表达质粒与应用 | |
| CN102180973A (zh) | 靶向多功能防栓融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN111961687A (zh) | 一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法 | |
| CN101775405B (zh) | 一种制备重组几丁质酶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: TAIYUAN JINBO BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: YANG XIA Effective date: 20141224 Owner name: FUDAN UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: LU LU Effective date: 20141224 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 030001 TAIYUAN, SHAANXI PROVINCE TO: 030032 TAIYUAN, SHAANXI PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20141224 Address after: 030032 Shanxi city of Taiyuan province by the economic and Technological Development Zone No. 18 North Street Patentee after: Taiyuan Jinbo Bio-Pharmaceutical Co.,Ltd. Patentee after: Fudan University Address before: 030001 No. 59 Kangle West Street, Ankang District, 3, Shanxi, Taiyuan Patentee before: Yang Xia Patentee before: Lu Lu |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Free format text: FORMER OWNER: FUDAN UNIVERSITY Effective date: 20150204 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150204 Address after: 030032 Shanxi city of Taiyuan province by the economic and Technological Development Zone No. 18 North Street Patentee after: Taiyuan Jinbo Bio-Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 030032 Shanxi city of Taiyuan province by the economic and Technological Development Zone No. 18 North Street Patentee before: Taiyuan Jinbo Bio-Pharmaceutical Co.,Ltd. Patentee before: Fudan University |
|
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SHANXI JINBO BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: TAIYUAN JINBO BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 030032 Shanxi city of Taiyuan province by the economic and Technological Development Zone No. 18 North Street Patentee after: Shanxi Jin Bo Biomedics Inc. Address before: 030032 Shanxi city of Taiyuan province by the economic and Technological Development Zone No. 18 North Street Patentee before: Taiyuan Jinbo Bio-Pharmaceutical Co.,Ltd. |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 030032 No.18, Jinbo street, Tanghuai Park, Taiyuan comprehensive reform demonstration zone, Taiyuan City, Shanxi Province Patentee after: SHANXI JINBO BIOMEDICAL Co.,Ltd. Address before: 030032 Shanxi city of Taiyuan province by the economic and Technological Development Zone No. 18 North Street Patentee before: SHANXI JINBO BIOMEDICAL Co.,Ltd. |