CN111569160A - 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法，制备方法包括：(1)活化基底材料；(2)将活化后的基底材料置于含氨基化合物的溶液中进行反应，得氨基化的基底材料；(3)将氨基化的基底材料置于聚阴电解质溶液中进行反应，然后用去离子水清洗；(4)将步骤(3)所得物置于聚阳电解质溶液中进行反应，然后用去离子水清洗；(5)室温下，以步骤(2)所得物为底物，重复步骤(3)‑步骤(4)3‑15次，制得。本发明制得的多功能支架涂层可有效提升血管支架材料等生物材料抗凝血、快速内皮化性能，潜在降低目前支架材料存在的晚期血栓、再狭窄问题。

Description

基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法。
背景技术
随着人们生活压力增大，作息与饮食的不规律，我国心血管疾病致死占比已经超过40％，已然超过肿瘤成为疾病导致死亡的第一杀手，威胁着人类的生命安全。一直以来，心血管材料面临着抗凝血、内皮化不完全的重大问题，具有优异的表面抗凝血性能、加速原位内皮化是血液接触材料成功的关键。微创、高效、安全的支架植入术已成为治疗心血管疾病的主要手段。目前临床上大规模使用的药物涂层金属血管支架起到的是一个永久支撑的作用，却因异物的植入引起血栓和再狭窄问题，同时其药物涂层抑制内膜生长的同时也抑制了内皮生长。而全降解血管支架设计中通常沿用已有药物洗脱支架的涂层设计策略，现有支架涂层常常在阻碍内膜过度增生同时又妨碍内皮的全面功能与结构再生，因此仍然有可能导致由于内皮覆盖层再生不足导致的晚期血栓发生的潜在可能。现在通过对载药涂层进行进一步的优化或表面改性，提高抗凝血性的同时加速血管内皮化完成，是实现血管组织结构与功能完美再生的必备条件之一。但未见将重组人源胶原蛋白用于构建多功能涂层支架涂层的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法，可有效提升血管支架材料等生物材料抗凝血、快速内皮化性能，潜在降低目前支架材料存在的晚期血栓、再狭窄问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将基底材料置于活化剂溶液中反应，得活化后的基底材料；
(2)将活化后的基底材料置于含氨基化合物的溶液中进行反应，得氨基化的基底材料；
(3)将氨基化的基底材料置于聚阴电解质溶液中进行反应，然后用去离子水清洗；
(4)将步骤(3)所得物置于聚阳电解质溶液中进行反应，然后用去离子水清洗；其中，聚阳电解质溶液为重组人源胶原蛋白溶液；
(5)室温下，以步骤(2)所得物为底物，重复步骤(3)-步骤(4)3-15次，制得。该步骤中，重组人源胶原蛋白以层层组装方式引入到涂层中，进一步提升聚阴电解质的组装量，进而达到涂层的抗凝血性能和快速内皮化性能。
进一步地，步骤(1)中将基底材料置于0.5-10mg/ml的活化剂溶液中，于室温下反应30min-4h，然后清洗3-5次，得活化后的基底材料；活化剂为EDC/NHS体系或盐酸多巴胺。
进一步地，活化剂为EDC/NHS体系时，活化过程为：将基底材料置于含0.5-10mg/mlEDC的MES缓冲溶液中浸泡10min-2h，然后转入0.5-10mg/ml NHS溶液中活化处理30min-2h；优选：将基底材料在浓度为1mg/ml的EDC的MES缓冲液中浸泡15min，然后转入浓度为1.5mg/ml NHS溶液，活化1h。
进一步地，步骤(2)中将活化后的基底材料置于5-20mg/ml含氨基化合物的溶液中，室温反应2-4h；其中，氨基化合物为携带有多个伯氨基基团的物质，包括但不限于聚乙烯亚胺、羧甲基壳聚糖、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、聚乙二胺等。
进一步地，步骤(3)具体过程为：将氨基化的基底材料置于0.1-5mg/ml，pH值为2-9的聚阴电解质中，于室温下反应5min-1h后，用去离子水清洗3～5次。优选：将氨基化的基底材料置于0.5mg/ml，pH值为5的聚阴电解质中，于室温下反应20min后，用去离子水清洗3～5次。
进一步地，步骤(3)中聚阴电解质为硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、肝素、聚谷氨酸或脱氧核糖核酸。
进一步地，步骤(4)具体过程为：将步骤(3)所得物置于0.1-5mg/ml，pH值为2-9的聚阳电解质中，于室温下反应5min-1h后，用去离子水清洗3～5次。优选：将步骤(3)所得物置于0.5mg/ml，pH值为5的聚阳电解质中，于室温下反应30min后，用去离子水清洗3～5次。
进一步地，步骤(4)中重组人源胶原蛋白一级结构为不含O(羟脯氨酸)，并且兼顾细胞黏附特性，优选为包含细胞黏附功能的GER片段，但不含与血小板表面α2β1整合素特异性结合的GFOGER片段。
进一步地，重组人源胶原蛋白的氨基酸序列的核心序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP，还可以对核心序列进行修饰，修饰位置及基团包括但不限于巯基末端、双键末端、甲基丙烯酸酯。
进一步地，基底材料为金属基生物材料或高分子基生物材料。
金属基生物材料包括但不限于镁及其合金、铁及其合金、不锈钢、镍钛合金、钴铬合金、钛及其合金；
高分子基生物材料包括但不限于壳聚糖、聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、硅橡胶、涤纶、乙交酯-丙交酯或聚三亚甲基碳酸酯。
本发明提供的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法，具有以下有益效果：
本发明先通过活化剂对基底材料进行活化，使基底材料表面引入羧基、醛基、羟基等各种官能团，得活化后的基底材料，将活化后的基底材料置于含氨基化合物的溶液中，活化后的基底材料表面的羧基、醛基与氨基形成共价键、氢键，使得基底材料表面携带氨基官能团，得氨基化的基底材料，将氨基化的基底材料置于聚阴电解质中，聚阴电解质所带有的羧基和羟基通过静电作用、少量的共价键和氢键与氨基作用固定在氨基化的基底材料表面，然后置于聚阳电解质中，聚阳电解质与聚阴电解质通过静电作用，使其聚阳电解质附着在基底材料上，优选聚阳电解质为重组人源胶原蛋白溶液，重组人源胶原蛋白与聚阴电解质所带有的羧基和羟基形成共价键和氢键，从而提高重组人源胶原蛋白在材料表面的稳定性。最后利用层层自组装方式将聚阴电解质和聚阳电解质依次交替沉积到氨基化的基底材料上实现原位修饰血管支架。
本申请中聚阳电解质为具有抗凝血性能的重组人源胶原蛋白，其具有高内皮细胞亲和力，其序列设计避开了血小板结合位点的新型胶原蛋白结构，是一种可用于心血管材料改性的定制化胶原材料，其意义体现在重组人源胶原蛋白不仅免疫排异极低，抗凝血性能也非常显著。传统的胶原蛋白是多种类型胶原的混合物，难以去除结构中含O的残基，导致血小板凝结DNA片段进而导致免疫反应的动物氨基酸基团难以完全切除。本发明设计的重组人源胶原蛋白一级结构中就不含O，不会出现上述问题。
附图说明
图1为实施例4制得的多功能支架涂层和对照组的血小板黏附实验SEM图。
图2为实施例5制得的多功能支架涂层和对照组的内皮细胞荧光染色图。
具体实施方式
实施例1
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将预处理后的钴铬合金材料在浓度为0.5mg/ml的EDC的MES缓冲液中处理30min，随后转移至0.5mg/ml的NHS溶液中活化30min；
(2)将步骤(1)所得产物置于浓度为5mg/ml，pH值为8的聚乙烯亚胺溶液中，于室温下反应2h；
(3)将步骤(2)所得的产物置于0.1mg/ml，pH值为3的硫酸软骨素溶液中，于室温下反应5min；
(4)将步骤(3)所得的产物置于0.1mg/ml，pH值为3的重组Ⅲ型人源胶原蛋白溶液中，于室温下反应5min，其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)室温下，以步骤(2)所得产物为底物，分别重复步骤(3)-(4)所述操作3次得到目标涂层。
实施例2
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将预处理后的钴铬合金材料在浓度为5mg/ml的EDC的MES缓冲液中处理2h，随后转移至5mg/ml的NHS溶液中活化2h；
(2)将步骤(1)所得产物置于浓度为10mg/ml，pH值为8的多聚赖氨酸溶液中，于室温下反应2h；
(3)将步骤(2)所得的产物置于2mg/ml，pH值为4的硫酸软骨素溶液中，于室温下反应30min；
(4)将步骤(3)所得的产物置于2mg/ml，pH值为4的重组Ⅲ型人源胶原蛋白溶液中，于室温下反应30min，其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)室温下，以步骤(2)所得产物为底物，分别重复步骤(3)-(4)所述操作6次得到目标涂层。
实施例3
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将预处理后的壳聚糖材料置于2mg/ml的盐酸多巴胺(DPA)溶液中，于室温下反应2h；
(2)将步骤(1)所得产物置于浓度为10mg/ml，pH值为7.4的聚乙二胺溶液中，于室温下反应3h；
(3)将步骤(2)所得的产物置于2mg/ml，pH值为6的肝素溶液中，于室温下反应30min；
(4)将步骤(3)所得的产物置于2mg/ml，pH值为6的重组Ⅲ型人源胶原蛋白溶液中，于室温下反应30min；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)室温下，以步骤(2)所得产物为底物，分别重复步骤(3)-(4)所述操作10次得到目标涂层。
实施例4
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乳酸材料置于4mg/ml的盐酸多巴胺溶液中，于室温下反应30min；
(2)将步骤(1)所得产物置于浓度为5mg/ml，pH值为7的多聚赖氨酸中，于室温下反应2h；
(3)将步骤(2)所得的产物置于5mg/ml，pH值为4的透明质酸溶液中，于室温下反应10min；
(4)将步骤(3)所得的产物置于5mg/ml，pH值为7的重组Ⅲ型人源胶原蛋白溶液中，于室温下反应30min；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)室温下，以步骤(2)所得产物为底物，分别重复步骤(3)-(4)所述操作15次得到目标涂层。
实施例5
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乳酸材料在浓度为1mg/ml的EDC的MES缓冲液中浸泡15min，然后转移至浓度为1.5mg/ml NHS溶液中，活化1h；
(2)将步骤(1)所得产物置于浓度为10mg/ml，pH值为7.4的羧甲基壳聚糖溶液中，于室温下反应3h；
(3)将步骤(2)所得的产物置于1mg/ml，pH值为6的透明质酸溶液中，于室温下反应20min；
(4)将步骤(3)所得的产物置于1mg/ml，pH值为6的重组Ⅲ型人源胶原蛋白溶液中，于室温下反应30min；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)室温下，以步骤(4)所得产物为底物，分别重复步骤(3)-(4)所述操作6次得到目标涂层。
实施例6
一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将预处理后的镁合金材料置于5mg/ml的盐酸多巴胺溶液中，于室温下反应1h；
(2)将步骤(1)所得产物置于浓度为10mg/ml，pH值为7.4的多聚精氨酸溶液中，于室温下反应30min；
(3)将步骤(2)所得的产物置于2mg/ml，pH值为5的聚谷氨酸溶液中，于室温下反应40min；
(4)将步骤(3)所得的产物置于2mg/ml，pH值为5的重组Ⅲ型人源胶原蛋白溶液中，于室温下反应30min，其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
(5)室温下，以步骤(2)所得产物为底物，分别重复步骤(3)-(4)所述操作10次可得目标涂层。
试验例
1、血小板黏附实验
将实施例4制得的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层与富含血小板的血浆混合，孵育1h，以PLA基材作为对照组，通过扫描电镜观察血小板在多功能支架涂层和PLA基材上的黏附情况，结果见图1。
由图1可知，对照组PLA基材表面有大量的血小板粘附且激活程度高，而多功能支架涂层表面基本没有血小板的粘附与激活，由此说明本发明制得的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层具有优异的抗凝血功能。
2、内皮细胞黏附实验
将实施例4制得的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层与内皮细胞共培养，以PLA基材作为对照组，观察多功能支架涂层和PLA基材表面内皮细胞的生长情况，结果见图2。
图2中左图为对照组，右图为实验组。由图2可知，多功能支架涂层可有效促进内皮细胞的黏附和生长。

Claims (10)

1.一种基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基底材料置于活化剂溶液中反应，得活化后的基底材料；
(2)将活化后的基底材料置于含氨基化合物的溶液中进行反应，得氨基化的基底材料；
(3)将氨基化的基底材料置于聚阴电解质溶液中进行反应，然后用去离子水清洗；
(4)将步骤(3)所得物置于聚阳电解质溶液中进行反应，然后用去离子水清洗；其中，聚阳电解质溶液为重组人源胶原蛋白溶液；
(5)室温下，以步骤(2)所得物为底物，重复步骤(3)-步骤(4)3-15次，制得。
2.根据权利要求1所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，步骤(1)中活化剂为EDC/NHS体系或盐酸多巴胺。
3.根据权利要求1所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，步骤(2)中氨基化合物为携带有多个伯氨基基团的物质。
4.根据权利要求1所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体过程为：将氨基化的基底材料置于0.1-5mg/ml，pH值为2-9的聚阴电解质中，于室温下反应5min-1h后，用去离子水清洗3～5次。
5.根据权利要求1或4所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，步骤(3)中聚阴电解质为硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、肝素、聚谷氨酸或脱氧核糖核酸。
6.根据权利要求1所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体过程为：将步骤(3)所得物置于0.1-5mg/ml，pH值为2-9的聚阳电解质中，于室温下反应5min-1h后，用去离子水清洗3～5次。
7.根据权利要求1或6所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，步骤(4)中重组人源胶原蛋白一级结构为不含羟脯氨酸，并且兼顾细胞黏附特性的胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，重组人源胶原蛋白的氨基酸序列中包含GER片段，但不含GFOGER片段。
9.根据权利要求8所述的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层的制备方法，其特征在于，重组人源胶原蛋白核心序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。
10.采用权利要求1-9任一项所述的方法制得的基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层。
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