CN101914484A - 一种温度敏感型肝细胞培养支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种温度敏感型肝细胞培养支架材料及其制备方法；本发明涉及一种智能型组织工程支架材料及技术，特别涉及一种温度敏感型肝细胞培养支架材料以及方法技术。本发明材料具有如下特性：37℃时表面相对疏水，适于细胞黏附/铺展和增殖，但在32℃下呈现亲水性，细胞自动从表面脱附。细胞培养支架材料制备方法包括以下步骤：(1)表面清洗；(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)；(4)TCPS表面的糖化修饰。本发明增强支架材料的生物相容性和细胞结合位点，增加细胞在材料表面的吸附率，得到适用于肝组织工程的智能型支架材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种智能型组织工程支架材料及技术，特别涉及一种温度敏感型肝细胞培养支架材料以及方法技术。
背景技术
我国是肝病的高发区，其中重型肝炎/肝衰竭是病情最重、死亡率最高的肝脏疾病之一。治疗重型肝炎/肝衰竭的三种常用方法为内科治疗、肝移植和人工代用品治疗。由于肝供体的缺乏及手术费用的昂贵，在我国肝移植难以得到普遍应用，而人工代用品由于不能完全替代人体器官的所有功能，不能根据人体自身要求进行相应的自动调节，所以不能治愈疾病，只能暂时缓解症状或者短期延续病人的生命。组织工程概念的提出，为解决这一难题提供了宝贵的理论依据。
组织工程学的方法是：将特定的组织细胞“种植”于一种生物相容性良好、可被人体逐步降解吸收的生物材料(组织工程材料)上，形成细胞-生物材料复合物；生物材料为细胞的增长繁殖提供三维空间和营养代谢环境；随着材料的降解和细胞的繁殖，形成新的具有与自身功能和形态相应的组织或器官；这种具有生命力的活体组织或器官能对病损组织或器官进行结构、形态和功能的重建，并达到永久替代。其中生物材料在组织工程中占据非常重要的地位，它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且还决定着移植后能否与机体很好的适应、结合和修复，是限制组织工程能否真正应用于临床的一个关键因素。
目前组织工程支架材料有两类：一类是天然基质材料，如胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖等，它们均具有较好的生物相容性，但所形成的支架材料稳定性和机械性能较差；一类是合成高分子聚合物，如聚ε-己内酯乙烷基乙烯基磷酸盐共聚物(PCLEEP)、聚乙酰内酯(PVLA)、聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)等，它们具有良好的力学性能和生物降解性能，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。为了解决以上材料问题，当前的研究多采用复合修饰和改性的方法，用于扬长避短，以获得一种良好的生物材料。如马祖伟，高长友等发表的文章：I型胶原在聚-L-乳酸(PLLA)表面的化学接枝和涂层及其对软骨细胞生长的促进作用；杂志为.高等学校化学学报(2004，25(4)：749-752)。采用接枝一涂层技术，在聚-L-乳酸(PLLA)膜表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)，利用水溶性碳化二亚胺作为缩合剂，使表面的羧基和胶原分子中的氨基发生缩合反应，从而将I型胶原接枝在PLLA表面，并对软骨细胞在其表面的生长行为进行了研究，结果表明，改性表面有效地提高了细胞在材料表面的粘附、增殖和铺展。浦鸣，计剑等发表的文章反应性梳状聚乙二醇改性聚酯薄膜表面及其内皮细胞相容性的研究。杂志为高等学校化学学报(2006，27(5)：951-955)。将高密度梳状PEG(CPEG)端羟基转化为反应活性较高的醛基，通过表面接枝方法对氨基化的聚酯膜进行表面改性，用整合素配体多肽片段(RGD)和氨基酸修饰CPEG，获得了细胞相容性优良的功能化仿生表面。
半乳糖由于具有与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行特异性结合的功能，多被引入材料以增加肝细胞的粘附率。Inn-kyu Kang等发表的文章：Grafting oflactose-carring styrene onto polystyrene dishes using plasma glow discharge and theirinteraction with hepatocytes.杂志为：J.Mater.Sci.：Mater.M(2003，14：611-616)通过辉光放电等离子体方法将半乳糖基苯乙烯类化合物(VLA)接枝到聚苯乙烯板表面，并对肝细胞在此载体表面的培养情况作了研究。Yoon等发表的文章Surfaceimmobilization of galactose onto aliphatic biodegradable polymers for hepatocyte culture.杂志为Biotechnol Bioeng(2002，78：1-10)将半乳糖引入聚乳酸乙醇酸(PLGA)膜，将之用于肝细胞培养研究，结果表明，随膜表面半乳糖浓度的增加，肝细胞的吸附能力和活性增强。Higashiyama等发表的文章：Mixed-ligand modificationofpolyamidoa mine dendrimers to develop an effective scaffold for maintenance ofhepatocyte spheroids.杂志为J.Biomed.Mater.Res(2003，64A：475-82)将果糖和半乳糖的复合配体修饰到聚苯乙烯表面，制备了能保持肝细胞球形结构的改性表面。卓仁禧等发表了文章：Immobilization of galactose ligands on acrylic acidgraft-copolymerized poly(ethylene terephthalate)film and its application to hepatocyteculture.杂志为Biomacromolecules(2003，4：157-165)将半乳糖修饰到PET表面，研究了肝细胞在此改性表面的吸附能力和细胞功能等。
关于肝组织工程支架材料方面虽然取得很多有意义的研究成果，但按照传统的组织工程方法，当细胞在体外培养扩增后形成细胞片层或组织，要连同支架材料一起移植入主体，这样会引起很多复杂的问题：(1)支架材料在体内降解后，其先前所占据的空间会被细胞外基质充满，从而使细胞不能紧密聚集，肝脏是一种细胞紧密聚集的器官，这样就使移植入主体的细胞在体内的生长不能很好的模拟本体组织；(2)对于较大的结构，在支架材料周围，移植细胞会健康成长且与本体组织很相似，但由于是被动传输，营养物质的输送和代谢废物的排出较慢，导致结构中心部位的细胞活性丧失，从而形成一个坏死的中心；(3)一些支架材料，如聚乳酸(PLA)、甲壳素等的降解产物的酸碱会对细胞产生一定的毒性；(4)一些支架材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙酸醇(PGA)等，降解成小分子碎片，会引起主体内巨噬细胞、嗜中性粒细胞的聚集，这些免疫细胞也会吞噬植入细胞。【Okano T.，et al..Biomaterials，2005，26：415-6422.】这些问题的存在，大大限制了组织工程的发展。
高分子材料表面改性方法包括：化学法、辐射接枝法、等离子体方法、紫外光固定法，其中化学法接枝工艺复杂，试剂浪费大，有的试剂还有毒，而且反应时间长；辐射接枝法会将放射性引入反应体系；等离子体方法需要真空、高温条件，需要设备复杂，投资成本高。
采用紫外光固定法对高聚物表面接枝改性的研究很多，但大多为对聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、涤纶(PET)等的改性，如李斌，周晓工等的文章：聚丙烯表面接枝PNIPAAm膜I.光接枝反应和表面形态结构研究，杂志为高分子学报(2002，6：780-785)。通过紫外光照射法在聚丙烯薄膜上接枝PNIPAAm，研究了不同反应条件对接枝反应的影响。金朝锋申屠宝卿等的文章：高密度聚乙烯表面光接枝丙烯酸行为研究，杂志为化学反应工程与工艺(2004，20(2)：146-150)，通过紫外光照，在高密度聚乙烯表面接枝丙烯酸，研究了光照时间、单体浓度、光敏剂浓度等因素对其接枝率和接枝效率的影响。而以紫外光固定法将异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)接枝到聚苯乙烯表面，且用于组织工程，几乎未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种温敏型肝细胞培养支架材料及其制备方法。
本发明的温敏型肝细胞培养支架材料，含有N-异丙基丙烯酰胺，在聚苯乙烯细胞培养板上接枝N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)，丙烯酸的羧基通过缩合连接胺基乳糖酸(L-NH2)的胺基。
本发明温敏型肝细胞培养支架材料具有如下特性：37℃时表面相对疏水，适于细胞黏附/铺展和增殖，但在32℃下呈现亲水性，细胞自动从表面脱附。
本发明的温敏型肝细胞培养支架材料，以紫外光固定化法在聚苯乙烯细胞培养板上接枝N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)，然后以Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和EDC·HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为活化剂和羧合剂，使胺基乳糖酸(L-NH2)的胺基与丙烯酸的羧基发生缩合作用，将具有肝细胞特异结合作用的L-NH2键合到聚苯乙烯细胞培养板表面。
本发明温敏型肝细胞培养支架材料制备方法包括以下步骤：
(1)表面清洗：将聚苯乙烯细胞培养板(TCPS)用无水乙醇冲洗，蒸馏水冲洗数遍，55-65℃真空干燥备用。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)溶于二甲基亚砜(DMSO)，再加入蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入上述反应液中，通N215分钟密封，高压汞灯处理，然后依次以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将乳糖酸(LA)和乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中，温度为70～80℃反应2～4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物胺基乳糖酸真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将胺基乳糖酸(L-NH2)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝6.0～9.4的磷酸盐缓冲溶液；将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡1～3d，每天向反应体系加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)；以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
所述步骤(1)中聚苯乙烯细胞培养板(TCPS)为1cm×1cm或其他规格的表面积；
所述步骤(2)中N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸摩尔比为1∶0.1～1，NIPAAm和丙烯酸在DMSO中的混合浓度为10～20wt％；
所述步骤(2)中蒽醌-2-磺酸钠与N-异丙基丙烯酰胺的摩尔比为0.1∶1；
所述步骤(2)中高压汞灯处理条件为所述高压汞灯λ＝360nm，功率为200W～1000W，照射0.5h～4.5h，高压汞灯距离样品30～40cm，反应液深度为1～2cm；
所述步骤(2)中无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，用以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物；
所述步骤(3)中乳糖酸和乙二胺质量比为1∶4～6，乳糖酸和乙二胺在DMSO中混合浓度为0.5～1g/ml；
所述步骤(4)中将胺基乳糖酸与N-羟基硫代琥珀酰亚胺质量比为1∶1，胺基乳糖酸与N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合溶液浓度为0.5mg/ml～2mg/ml。
所述步骤(4)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)每天添加浓度为10～30mg/ml。
有益效果：
本发明利用温度敏感性材料N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)的温度响应性，得到完整的细胞片层或组织，将细胞片层或组织植入体内，不必将支架材料一同植入体内，这样就可以避免主体对支架材料性能的限制。NIPAAm的化学结构中具有亲水基团和疏水基团，其水溶液的最低临界温度(Lower critical solution temperature，LCST)为32℃。当温度低于32℃时，PNIPAAm高分子链伸展，亲水基团暴露，表现亲水性；当温度高于32℃时，PNIPAAm高分子链收缩，疏水基团暴露，表现疏水性。将PNIPAAm修饰到聚苯乙烯细胞培养板(TCPS)表面，37℃时表面相对疏水，适于细胞黏附/铺展和增殖，但在32℃下呈现亲水性，细胞自动从表面脱附，用此温度响应细胞培养板可回收溶合细胞片层，不影响细胞与细胞间的连接和沉积，避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤，得到了完整的细胞片层，此二维细胞片层可直接转移至受损部位，无需将材料植入主体，这样就避免了对支架材料免疫学等方面的要求。
本发明所设计的温敏型肝细胞培养支架材料具有良好的综合性能，一方面由于L-NH2中存在半乳糖基，半乳糖具有与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行特异性结合的功能，它的引入增强了肝细胞在材料表面的吸附力，从而促进肝细胞在材料表面的增殖分化；另一方面，温敏性材料NIPAAm的引入，实现了细胞脱附智能化，通过控制环境温度，达到了细胞的自然脱附，可以得到完整的细胞片层，避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤，同时由于可将得到的细胞片层直接植入主体，不必连同支架材料植入主体，从而避免了支架材料必须可生物降解以及主体对材料的免疫学等方面的限制。由于所述的良好综合特性，本发明温敏型肝细胞培养支架材料在组织工程支架材料、细胞培养基质材料等方面可以得到广泛应用。
本发明通过紫外光照射方法对TCPS进行温敏改性，以蒽醌-2-磺酸钠(AQS)作光敏剂，AQS吸收光能后，成为激发态分子，它可以夺取TCPS大分子链上的氢，产生大分子自由基，大分子自由基攻击不饱和单体NIPAAm(N-异丙基丙烯酰胺)和AAc，引发接枝聚合.AAc通过紫外光照接枝到TCPS表面，使其表面产生羧基，然后以Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和EDC·HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)作活化剂和羧合剂，与L-NH2的胺基反应，得糖化温敏改性表面。选择乳糖酸作为引入半乳糖基配体是因为乳糖酸成本合理，毒性低，生物相容性良好；将丙烯酸作为含羧基成分引入，以便完成表面的糖化改性，是因为丙烯酸在光引发条件下容易形成自由基，可促进光化反应的进行，且成本低廉，属于常规药品，反应残余物容易去除。
本发明将与肝细胞具有特异结合性的半乳糖与NIPAAm共同修饰到TCPS表面，增强支架材料的生物相容性和细胞结合位点，增加细胞在材料表面的吸附率，得到一种新型适用于肝组织工程的智能型支架材料。
紫外光接枝方法采用高压汞灯或石英汞灯作为引发源，不需要特殊设备，投资成本低，工艺方法简单，技术要求不太苛刻，反应易于控制，可操作性强，适用范围广、安全，易在工业生产中普及应用。
具体实施方式：以下给出本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制.
实施例1：
(1)表面清洗：将切割成1cm×1cm的聚苯乙烯细胞培养板(TCPS)样品，用无水乙醇冲洗，除去表面的杂质，再用蒸馏水冲洗数遍，60℃真空干燥备用。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.01mol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，1000W)照射0.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将2g乳糖酸(LA)和10g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于20ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为70℃时反应2h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将3mg L-NH2和3mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝8.0的3mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡3d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例2：
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.001mol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，1000W)照射3h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将3g乳糖酸(LA)和18g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于30ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为80℃时反应4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将3mg L-NH2和3mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝9.4的3mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡3d，每天向反应体系加入60mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例3：
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.005mol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，1000W)照射0.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将2g乳糖酸(LA)和8g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于20ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为70℃时反应4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将1mg L-NH2和1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝6.0的2mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡3d，每天向反应体系加入20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例4
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01molN-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.01mol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亚砜(DMSO)，，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，1000W)照射3h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将2g乳糖酸(LA)和8g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于20ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为80℃时反应2h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将1mg L-NH2和1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝8.0的2mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡3d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例5
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.001mol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，200W)照射4.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将3g乳糖酸(LA)和15g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于30ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为80℃时反应2h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将2mg L-NH2和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝7.4的1mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡3d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例6：
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.005mol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，200W)照射4.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将3g乳糖酸(LA)和12g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于30ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为70℃时反应4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将2mg L-NH2和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝9.4的1mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡3d，每天向反应体系加入20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例7：
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.01mol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，1000W)照射4.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将2g乳糖酸(LA)和12g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于20ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为70℃时反应2h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将3mg L-NH2和3mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝7.4的3mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡1d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例8
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.001mol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，1000W)照射0.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将3g乳糖酸(LA)和18g 乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于30ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为70℃时反应2h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将1mg L-NH2和1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝8.0的2mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡1d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例9
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.01mol丙烯酸(AAc)溶于13.6mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，200W)照射0.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将2g乳糖酸(LA)和10g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于20ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为80℃时反应4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将2mg L-NH2和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝9.4的1mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡1d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
实施例10
(1)表面清洗：同实例1(1)。
(2)TCPS表面的温敏羧基化修饰：将0.01mol N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和0.001mol丙烯酸(AAc)溶于6.8mL二甲基亚砜(DMSO)，再加入0.001mol蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入所述反应液中，通N2 15min密封，以高压汞灯(λ＝360nm，200W)照射4.5h，高压汞灯距离样品40cm，反应液深度为1cm.光照接枝完毕后，以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥1d，得TCPS温敏羧基化表面TCPS-NIPA-AAc。
(3)制备胺基乳糖酸(L-NH2)：将3g乳糖酸(LA)和12g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分别溶于30ml二甲基亚砜(DMSO)中，在温度为80℃时反应4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物L-NH2真空干燥。
(4)TCPS表面的糖化修饰：将1mg L-NH2和1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶于pH＝6.0的1mL磷酸盐缓冲溶液，将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡1d，每天向反应体系加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)。反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
Claims (8)
1.一种温度敏感型肝细胞培养支架材料，含有N-异丙基丙烯酰胺，其特征在于聚苯乙烯细胞培养板上接枝N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸，丙烯酸的羧基通过缩合连接胺基乳糖酸的胺基；所述肝细胞培养支架材料具有如下特性：37℃时表面相对疏水，适于细胞黏附/铺展和增殖，但在32℃下呈现亲水性，细胞自动从表面脱附。
2.一种如权利要求1所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)表面清洗：将聚苯乙烯细胞培养板用无水乙醇冲洗，蒸馏水冲洗，55-65℃真空干燥；
(2)聚苯乙烯细胞培养板表面的温敏羧基化修饰：将NIPAAm和AAc溶于DMSO，再加入蒽醌-2-磺酸钠，滴入几滴异丙醇；将处理好的TCPS样品放入上述反应液中，通N215分钟密封，高压汞灯处理，然后依次以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，真空干燥1d，得聚苯乙烯细胞培养板温敏羧基化表面产物(TCPS-NIPA-AAc)；
(3)制备胺基乳糖酸：将乳糖酸和乙二胺分别溶于DMSO中，温度70～80℃反应2～4h，将混合物溶液倾入氯仿中沉析，然后将产物胺基乳糖酸真空干燥。
(4)聚苯乙烯细胞培养板表面的糖化修饰：将胺基乳糖酸和溶于pH＝6.0～9.4的磷酸盐缓冲溶液；将TCPS-NIPA-AAc样品放入其中，置于摇床上室温下震荡1～3d，反应体系中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得目标肝细胞培养支架材料。
3.一种如权利要求1或2所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中NIPAAm与AAc摩尔比为1∶0.1～1，NIPAAm和AAc在DMSO中的混合浓度为10～20wt％。
4.一种如权利要求2所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中蒽醌-2-磺酸钠与NIPAAm的摩尔比为0.1∶1。
5.一种如权利要求2所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中高压汞灯处理条件如下：高压汞灯λ＝360nm，功率为200W～1000W，照射0.5h～4.5h，高压汞灯距离样品30～40cm，反应液深度为1～2cm。
6.一种如权利要求2所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中乳糖酸和乙二胺质量比为1∶4～6，乳糖酸和乙二胺在DMSO中混合浓度为0.5～1g/ml。
7.一种如权利要求2所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述所述步骤(4)中将胺基乳糖酸与N-羟基硫代琥珀酰亚胺质量比为1∶1，胺基乳糖酸与N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合浓度为0.5mg/ml～2mg/ml。
8.一种如权利要求2所述的温度敏感型肝细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述所述步骤(4)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐每天添加浓度为10～30mg/ml。
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