CN103721293A - 活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶及制备方法。该凝胶结构为三层，每层主要成分由改性明胶和改性羧甲基壳聚糖组成。其制备方法包括：用甲基丙烯酸缩水甘油酯对明胶和羧甲基壳聚糖进行双键改性；以肝素对双键改性的明胶再改性；三种改性明胶和改性羧甲基壳聚糖及交联剂PEGDMA和光引发剂I2959分别配成三种反应液，将三种反应液依次连续注入模具，之后光交联制备活性因子可控释放的多层梯度水凝胶。本发明的优点：制备过程快速，简单，制得的梯度水凝胶能够同时满足组织修复对材料的梯度结构、组成及活性因子可控释放的要求，在梯度分布的关节软骨组织修复方面具有良好的应用前景。

Description

活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶及制备方法

技术领域

 本发明涉及一种活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶及制备方法，属于生物凝胶材料技术领域。

背景技术

关节软骨损伤或功能损失是一类严重影响人类健康的疾病。近年来发展起来的组织工程技术是一种新兴的有希望解决组织和器官修复的有效途径，为关节软骨组织修复带来了曙光。组织工程涉及种子细胞、支架材料及生物信号三个要素。

水凝胶的结构和关节软骨细胞外基质相似，能够为细胞和组织生长提供适宜的环境，是用于软骨组织修复和再生的一类非常重要的生物材料。天然关节软骨的结构呈现高度梯度分布，由表面至骨界面被划分为表层、中层和深层三个区域。不同区域层的力学强度、水含量、糖胺聚糖（GAGs）含量和胶原含量由表层至深层呈梯度分布（Yang PJ, Temenoff JS. Engineering orthopedic tissue interfaces[J]. Tissue Engineering: Part B 2009, 15: 127-141）。因此，制备组成和结构呈连续梯度分布的水凝胶以达到修复关节软骨的研究越来越引起人们的关注。

生物活性因子半衰期短，且在材料中不稳定，容易突释，近年来很多研究致力于实现活性因子的持续控制释放。一种方法就是把活性因子包覆在载体微球中，再复合到聚合体系中，但此种方法活性因子的包封率低，使生长因子利用率下降；另一种有效的方法就是把材料进行肝素化，因为肝素结构中带有羧酸基、磺酸基等基团，具有很强的负电荷性，能够和带正电荷的生物活性因子结合形成复合物，进而减缓活性因子的释放。Lee等通过用肝素修饰支架，实现了活性因子的缓释，避免了直接载入支架中的突释现象(Lee J, Choi W, Tae G, Kim YH, Kang SS, Kim SE, Kim S, Jung Y, Kim SH. Enhanced regeneration of the ligament-

bone interface using a poly(L-lactide-co-e-caprolactone) scaffold with local delivery of cells/BMP-2 using a heparin-based hydrogel [J]. Acta Biomaterial 2011,7: 244-257)。

本发明提出一种活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶的制备方法，在原料上选用明胶/羧甲基壳聚糖两种组分，更好地模拟天然软骨组织胶原/多糖成分，同时对明胶进行肝素修饰，以控制活性因子的突释。通过不同层溶液的梯度实现水凝胶各项性能连续梯度化，满足关节软骨结构呈梯度分布的要求。上述这种水凝胶同时满足修复对材料的结构、组成及活性因子可控释放的要求，目前相关报道较少，在修复活性因子可控释放的呈梯度分布的损伤组织有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶及制备方法。该水凝胶具有良好的生物相容性，且活性因子释放可控；其制备方法过程简单。

本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶，其特征在于：该活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶由下、中、上三层胶质组成，每层厚度为2~4mm，三层厚度均等或不等，每层胶质的主要成分是质量比为(5~10):1的改性的明胶和改性的羧甲基壳聚糖，所述的改性的明胶，是通过甲基丙烯酸缩水甘油酯及肝素对明胶加以改性，改性后的明胶在其氨基上接上双键及肝素；所述的改性的羧甲基壳聚糖，是通过甲基丙烯酸缩水甘油酯对羧甲基壳聚糖加以改性，改性后的羧甲基壳聚糖在其氨基上接上双键；其中，下层（底层）胶质中的改性明胶的双键改性度为40%~50%、肝素接枝量为50μg/mL~60μg/mL，改性的羧甲基壳聚糖的双键改性度为12%；中间层胶质中的改性明胶的双键改性度为25%~40%、肝素接枝量为40μg/mL~50μg/mL，改性的羧甲基壳聚糖的双键改性度为12%；上层（表层）胶质中的改性明胶的双键改性度为15%~25%，肝素接枝量为30μg/mL~40μg/mL，改性的羧甲基壳聚糖的双键改性度为12%。

  上述结构的活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶的制备方法，

mm其特征在于包括以下步骤：

1) 甲基丙烯酸缩水甘油酯改性明胶和改性羧甲基壳聚糖的制备：

用甲基丙烯酸缩水甘油酯分别对明胶和羧甲基壳聚糖进行改性，使其氨基上接上双键，分别得到双键改性度为15%~25%、25%~40%、40%~50%改性的明胶和双键改性度为12%的改性的羧甲基壳聚糖；

    2) 肝素对双键改性明胶的再改性：

  （1）把肝素钠加入2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，配制成质量浓度为5mg/mL的肝素钠溶液，向肝钠溶液中按每升2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液依次加入0.25mol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.25mol的N-羟基琥珀酰亚胺，然后在冰浴里搅拌反应1h，制得肝素钠混合溶液；

  （2）把步骤1）制得的双键改性度为15%~25%、25%~40%和40%~50%的三种明胶分别加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，配制成质量浓度为5mg/mL的三种双键改性明胶溶液，按照体积比1:2，将每一种双键改性明胶溶液与步骤（1）制得的肝素钠混合溶液进行混合，室温下反应24h，分别得到双键改性度为15%~25%、残留氨基上接有肝素量为30μg/mL~ 40μg/mL的改性明胶，和双键改性度为25%~40%、残留氨基上接有肝素量为40μg/mL~50μg/mL的改性明胶，及双键改性度为40%~50%、残留氨基上接有肝素量为50μg/mL~60μg/mL的改性明胶；

3) 活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶的制备：

  （1）将步骤2）制得的每一种改性明胶和步骤1）制备的双键改性度为12%的改性的羧甲基壳聚糖以质量比(5~10):1加入pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量浓度为5%~15%的的磷酸盐缓冲溶液，得到三种改性明胶和改性羧甲基壳聚糖的混合溶液，其中，将双键改性度为15%~25%、残留氨基上接有肝素量为30μg/mL~ 40μg/mL的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖的混合溶液记为G1溶液，将双键改性度为25%~40%、残留氨基上接有肝素量为40μg/mL~50μg/mL的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖的混合溶液记为G2溶液，将双键改性度为40%~50%、残留氨基上接有肝素量为50μg/mL~60μg/mL的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖的混合溶液记为G3溶液；

；别得到（2）按照步骤（1）制得的G1、G2和G3溶液中的改性明胶和改性羧甲基壳聚糖总质量的1~2倍和0.02倍，分别向G1、G2和G3溶液加入交联剂聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959），均匀混合得到G1、G2和G3三种反应液；  

  （3）把步骤（2）制备的三种反应液液按G3、G2和G1顺序连续注入模具，之后在365nm下紫外光照5~35min，得到活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶。

本发明的优点：制备过程快速，简单，通过溶液的梯度制备了多层梯度水凝胶，满足关节软骨结构呈梯度化要求。在原料上选用明胶和羧甲基壳聚糖，更好地模拟天然组织胶原/多糖成分，具有一定的仿生意义。并且对双键改性之后的明胶进行肝素二步改性，避免活性因子在材料中的突释现象，实现活性因子可控释放，提高其半衰期。该水凝胶在梯度分布的关节软骨组织修复方面具有良好的应用前景。

具体实施方式

实施例1：

称取A型明胶10g，溶解于100mL pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液，在50℃下搅拌直至完全溶解。在上述溶液中加入40mL甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），搅拌反应3h。之后乙醇沉淀、透析、冻干，得到双键改性度为23%的改性明胶（Gel-GMA)；

同理，称取A型明胶10g，溶解于100mL pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液，在50℃下搅拌直至完全溶解，分别加入80mL、120mL甲基丙烯酸缩水甘油酯可以得到双键改性度为36%、43%的改性明胶。

称取数均分子量为9000、脱乙酰度为95%的羧甲基壳聚糖1g，溶解于100mL去离子水中，50℃下搅拌直至完全溶解，依次加入5mL三乙胺，15mL甲基丙烯酸缩水甘油酯及5g四丁基溴化铵在室温下反应72h。之后乙醇沉淀、透析、冻干,得到双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖（CS-GMA)；

配制质量浓度为5mg/mL的肝素钠MES溶液10mL，加入EDC·HCl 0.48g和NHS 0.29g，在冰浴里搅拌反应1h以活化肝素；同时配制质量浓度为5mg/mL的上述制备的双键改性度为23%的改性明胶的MES溶液5mL，把此溶液逐滴滴到上述肝素溶液中，室温下搅拌反应24h，之后去离子水透析48h，-42℃冻干48h，得到肝素接枝量为33μg/mL的肝素二步改性明胶。

同理使用双键改性度为36%、43%的改性明胶通过上述反应可制备肝素接枝量为41μg/mL、54μg/mL的肝素二步改性明胶；

    分别称取上述制得的肝素接枝量为33μg/mL、41μg/mL、54μg/mL的改性明胶0.08g，之后均加入改性羧甲基壳聚糖0.01g，溶解于900μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，三种溶液分别命名为G1、G2、G3。配制质量浓度为10%的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959）乙醇溶液，在上述三种溶液中均加入18μL的I2959乙醇溶液和82μL聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，搅拌溶解。之后在模具中快速连续注入一定量的G3、G2和G1溶液，在波长为365nm下紫外光照30min，得到活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶，制得的水凝胶呈圆柱状，直径为8mm，高度为6mm。

实施例2：

明胶的肝素接枝量及羧甲基壳聚糖的双键改性度同实施例1的相同。

   分别称取肝素接枝量为33μg/mL、41μg/mL、54μg/mL的改性明胶0.08g，之后均加入改性羧甲基壳聚糖0.01g，溶解于900μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，三种溶液分别命名为G1、G2、G3。配制质量浓度为10%的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959）乙醇溶液，在上述三种溶液均加入18μL的I2959乙醇溶液和164μL聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，搅拌溶解。之后在模具中快速连续加入一定量的G3、G2和G1溶液，在波长为365nm处紫外光照30min，得到活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶,制得的水凝胶呈圆柱状，直径为8mm，高度为6mm。

实施例3：

明胶的肝素接枝量及羧甲基壳聚糖的双键改性度同实施例1的相同。

   分别称取肝素接枝量为33μg/mL、41μg/mL、54μg/mL的改性明胶0.08g，均加入改性羧甲基壳聚糖0.01g，溶解于600μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，三种溶液分别命名为G1、G2、G3。配制质量浓度为10%的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959）乙醇溶液，在三种溶液中均加入18μL的I2959乙醇溶液和164μL 聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，搅拌溶解。之后在模具中快速连续注入一定量的G3、G2和G1溶液，在波长为365nm处紫外光照30min，得到活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶,制得的水凝胶呈圆柱状，直径为8mm，高度为6mm。

Claims (2)

1.一种活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶，其特征在于：该活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶由下、中、上三层胶质组成，每层厚度为2~4mm，三层厚度均等或不等，每层胶质的主要成分是质量比为(5~10):1的改性的明胶和改性的羧甲基壳聚糖，所述的改性的明胶，是通过甲基丙烯酸缩水甘油酯及肝素对明胶加以改性，改性后的明胶在其氨基上接上双键及肝素；所述的改性的羧甲基壳聚糖，是通过甲基丙烯酸缩水甘油酯对羧甲基壳聚糖加以改性，改性后的羧甲基壳聚糖在其氨基上接上双键；其中，下层胶质中的改性明胶的双键改性度为40%~50%、肝素接枝量为50μg/mL~60μg/mL，改性的羧甲基壳聚糖的双键改性度为12%；中间层胶质中的改性明胶的双键改性度为25%~40%、肝素接枝量为40μg/mL~50μg/mL，改性的羧甲基壳聚糖的双键改性度为12%；上层胶质中的改性明胶的双键改性度为15%~25%、肝素接枝量为30μg/mL~40μg/mL，改性的羧甲基壳聚糖的双键改性度为12%。

2.一种按权利要求1所述的活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶的制备方法，

mm其特征在于包括以下步骤：

1) 甲基丙烯酸缩水甘油酯改性明胶和改性羧甲基壳聚糖的制备：

用甲基丙烯酸缩水甘油酯分别对明胶和羧甲基壳聚糖进行改性，使其氨基上接上双键，分别得到双键改性度为15%~25%、25%~40%、40%~50%的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖；

    2) 肝素对双键改性明胶的再改性：

  （1）把肝素钠加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，配制成质量浓度为5mg/mL的肝素钠溶液，向肝素钠溶液中按每升2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液依次加入0.25mol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.25mol的N-羟基琥珀酰亚胺，然后在冰浴里搅拌反应1h，制得肝素钠混合溶液；

  （2）把步骤1）制得的双键改性度为15%~25%、25%~40%和40%~50%的三种明胶分别加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，配制成质量浓度为5mg/mL的三种双键改性明胶溶液，按照体积比1:2，将每一种双键改性明胶溶液与步骤（1）制得的肝素钠混合溶液进行混合，室温下反应24h，分别得到双键改性度为15%~25%、残留氨基上接有肝素量为30μg/mL~ 40μg/mL的改性明胶，和双键改性度为25%~40%、残留氨基上接有肝素量为40μg/mL~50μg/mL的改性明胶，及双键改性度为40%~50%、残留氨基上接有肝素量为50μg/mL~60μg/mL的改性明胶；

3) 活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶的制备：

  （1）将步骤2）制得的每一种改性明胶和步骤1）制备的双键改性度为12%的改性的羧甲基壳聚糖以质量比(5~10):1加入pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量浓度为5%~15%的磷酸盐缓冲溶液，得到三种改性明胶和改性羧甲基壳聚糖的混合溶液，其中，将双键改性度为15%~25%、残留氨基上接有肝素量为30μg/mL~ 40μg/mL的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖的混合溶液记为G1溶液，将双键改性度为25%~40%、残留氨基上接有肝素量为40μg/mL~50μg/mL的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖的混合溶液记为G2溶液，将双键改性度为40%~50%、残留氨基上接有肝素量为50μg/mL~60μg/mL的改性明胶和双键改性度为12%的改性羧甲基壳聚糖的混合溶液记为G3溶液；

；别得到（2）按照步骤（1）制得的G1、G2和G3溶液中的改性明胶和改性羧甲基壳聚糖总质量的1~2倍和0.02倍，分别向G1、G2和G3溶液加入交联剂聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，均匀混合得到G1、G2和G3三种反应液；  

  （3）把步骤（2）制备的三种反应液液按G3、G2和G1顺序连续注入模具，之后在365nm下紫外光照5~35min，得到活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶。