CN113956509A - 一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法及应用 - Google Patents
一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法及应用，归属于心肌组织工程技术领域。本发明的制备方法包括对明胶进行功能化修饰后，引入鲁米诺在引发剂的作用下，利用温度响应、自由基响应、席夫碱等交联方式制备可注射电传导的水凝胶支架。本发明所制备的水凝胶支架材料在机械强度和电传导性能方面具有优异的可编程行为，可个性化定制，满足不同的生物体需求。本发明制备的水凝胶支架材料从结构、材料和功能上模拟天然心肌组织微环境，利用本发明水凝胶支架的电传导性能，可以有效改善心肌梗死后电信号传导紊乱，恢复其心功能，减少心肌梗死后的并发症，为心肌组织工程修复的开发和应用，提供新的解决方案和治疗策略。
Description
技术领域
本发明属于心脏组织工程领域，具体涉及一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法及应用。
背景技术
心肌梗死后，持续缺血可能导致心肌细胞坏死和受损区域组织纤维化，刺激心室重塑。纤维化的心肌组织难以维持心肌部位的电偶联现象，导致心肌组织部位健康的肌膜和完整的心肌细胞之间缺乏电传导所维持的心室收缩，使得心功能紊乱。因此，旨在通过恢复在梗死区域的电信号传导，将游离心肌细胞与正常的心肌组织进行重新偶联，恢复其重新同步收缩性能，防止不良重塑和心室功能障碍。
对于心肌梗死疾病的治疗，除了利用结合生物材料、细胞和生物活性因子等来创建功能性生物组织的替代物，在形态上可以模拟细胞外基质，便于植入细胞的正常附着、驻留、迁移及增殖用于相应心肌组织的力学微环境之外，也可以在生理条件下，赋予水凝胶支架材料与心肌组织相似导电性能用于恢复心肌梗死区域电传导功能。因此，通过开发新的导电水凝胶支架不仅可以模拟心肌组织微环境，而且也将会对心肌梗死疾病提供新的治疗策略，并在大健康领域具有重要的应用价值。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明提供一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法及应用，本发明通过光引发自由基聚合、引发剂偶联作用，将功能化的明胶材料和鲁米诺聚合交联，形成具有电传导特性的水凝胶支架材料，其合成路径单一、交联方式温和、机械性能可调以及电传导性能良好，可以广泛应用于心肌组织工程等领域。
为实现上述目的，本发明提出以下方案制备导电水凝胶支架材料用于心肌梗死部位应用。
一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌水浴锅搅拌溶解后得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，使用盐酸调整pH值，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；
(2)将明胶溶解在步骤(1)所述的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用磁力搅拌水浴锅加热得到明胶溶液；然后加入甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用透析袋在去离子水中透析除杂，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述双键功能化的明胶材料溶解在光引发剂溶液中，然后加入鲁米诺和引发剂，在紫外光照射下即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。
优选的，步骤(1)所述的反应的时间为2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的溶解温度为20-60℃。
优选的，步骤(1)所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸的摩尔浓度为10-100mM，氯化钠添加的比例为：2-(N-吗啡啉)乙磺酸∶氯化钠＝1-10∶1。
优选的，步骤(1)所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液的pH值为4-6.5，盐酸摩尔浓度为0.1-1.0M。
优选的，其特征在于，步骤(2)所述明胶溶液浓度为5-20％，溶解温度为50-70℃。
优选的，步骤(2)所述甲基丙烯酸的添加量为明胶质量的1-10％，反应温度为50-70℃，反应时间为6-24小时。
优选的，步骤(2)所述双键功能化修饰后明胶材料的透析温度为40-60℃，透析液为去离子水、超纯水以及磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)，透析袋的截留量为1000-14000道尔顿，透析时间1-7天。
优选的，步骤(3)所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢等氧化剂，其引发剂和鲁米诺的比例为20∶1-1∶20，鲁米诺的摩尔浓度为1-100mM。
优选的，其特征在于，步骤(3)所述光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，其光引发剂的浓度为0.5-2％，功能化明胶的溶解浓度为3-20％、溶解温度为37-70℃，紫外光波长为365nm，紫外光照射功率为1-300mW/cm2，紫外光的照射时间为1-60分钟。
本发明还提供由上述方法制得的明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。
本发明还提供由上述方法制得的明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶在心肌组织工程领域中的应用。
所述应用包括：制备可注射电传导水凝胶支架、心肌组织工程材料或心肌梗死部位的治疗。
本发明的有益效果在于：
本发明以安全无毒、生物相容性优异且生物全降解的高分子聚合物材料——明胶为分子骨架，在其高分子侧链修饰光敏基团双键，利用引发剂将鲁米诺氧化聚合形成聚鲁米诺，旨在实现其的导电性能。通过紫外光引发自由基聚合策略，一步交联制备复合水凝胶支架，可以更好弥补传统的聚苯胺类水凝胶材料在酸性条件下导电、生理条件下不导电的缺陷，在导电水凝胶支架、心肌组织工程材料或心肌梗死部位的治疗领域具有重要的临床应用前景。
本发明提出制备可注射水凝胶支架具有临床使用方便、操作简便，便于微创治疗且其自适应性能便于贴合不规则的梗死区域，达到修复与重建的目的
本发明制备方式简单、环保、交联手段温和，且基于鲁米诺材料具有内源性的荧光标记潜力，在心肌梗死治疗过程中可以在不引入外源性荧光标记物的过程中，实现荧光成像的效果。
附图说明
图1是本发明所述明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的扫描电镜图片。
图2是本发明所述明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的流变学测试结果。
图3是本发明所述明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的荧光成像潜力。
图4是本发明所述明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的体外降解示意图。
图5本发明所述明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的细胞毒性示意图。
图6本发明所述明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的心肌修复效果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详述的本发明。
实施例1
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶2，然后使用0.1M盐酸调整pH值为5.0，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将10g明胶溶解在步骤(1)所述的100mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用60℃的磁力搅拌水浴锅加热得到10％的明胶溶液；然后加入1g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度40℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述5％的双键功能化的明胶材料溶解在0.5％的I2959溶液中，溶解温度为37℃，然后加入鲁米诺20mM，调整鲁米诺和过硫酸铵两者比例为20∶1，使用365nm的紫外灯(30mW/cm2)照射5min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。
实施例2
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶5，然后使用0.1M盐酸调整pH值为5.5，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在37℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将10g明胶溶解在步骤(1)所述的200mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用50℃的磁力搅拌水浴锅加热得到5％的明胶溶液；然后加入1g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用7000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度40℃，透析时间3天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述6％的双键功能化的明胶材料溶解在1％的I2959溶液中，溶解温度为37℃，然后加入鲁米诺50mM，调整鲁米诺和过硫酸铵两者比例为5∶1，使用365nm的紫外灯(50mW/cm2)照射15min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。将制备的水凝胶切断、镀金后使用扫描电子显微镜镜(15kV)进行微观形貌表征，本实施例所制备的明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的扫描电镜图片如图1所示。
实施例3
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶10，然后使用0.1M盐酸调整pH值为5.5，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将10g明胶溶解在步骤(1)所述的200mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用50℃的磁力搅拌水浴锅加热得到5％的明胶溶液；然后加入1g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用1000道尔顿的透析袋在PBS中透析除杂，透析温度50℃，透析时间5天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述10％的双键功能化的明胶材料溶解在1％的I2959溶液中，溶解温度为37℃，然后加入鲁米诺100mM，调整鲁米诺和过硫酸铵两者比例为20∶1，使用365nm的紫外灯(300mW/cm2)照射20min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。
实施例4
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶5，然后使用0.1M盐酸调整pH值为5.5，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在37℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将10g明胶溶解在步骤(1)所述的200mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用60℃的磁力搅拌水浴锅加热得到5％的明胶溶液；然后加入5g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用3000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度40℃，透析时间2天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述4％的双键功能化的明胶材料溶解在1.5％的I2959溶液中，溶解温度为37℃，然后加入鲁米诺50mM，调整鲁米诺和过硫酸钾两者比例为1∶5，使用365nm的紫外灯(50mW/cm2)照射30min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。置于流变仪帕尔贴平板中央进行应力应变扫描、频率扫描以及剪切稀化测试，本实施例所制备的明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的流变测试结果如图2所示。
实施例5
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶10，然后使用0.1M盐酸调整pH值为5.0，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在50℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将10g明胶溶解在步骤(1)所述的200mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用50℃的磁力搅拌水浴锅加热得到5％的明胶溶液；然后加入10g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用12000道尔顿的透析袋在PBS中透析除杂，透析温度45℃，透析时间3天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述3％的双键功能化的明胶材料溶解在1％的I2959溶液中，溶解温度为37℃，然后加入鲁米诺50mM，调整鲁米诺和过硫酸铵两者比例为1∶1，使用365nm的紫外灯(30mW/cm2)照射4min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。将所制备的置于流变仪帕尔贴平板中央进行应力应变扫描、频率扫描以及剪切稀化测试，本实施例所制备的明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的荧光成像潜力如图3所示。
实施例6
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶10，然后使用0.1M盐酸调整pH值为6，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在60℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将10g明胶溶解在步骤(1)所述的100mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用50℃的磁力搅拌水浴锅加热得到10％的明胶溶液；然后加入5g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用12000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度50℃，透析时间1天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述3％的双键功能化的明胶材料溶解在1％的I2959溶液中，溶解温度为37℃，然后加入鲁米诺50mM，调整鲁米诺和过硫酸铵两者比例为1∶10，使用365nm的紫外灯(60mW/cm2)照射25min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。将所制备的水凝胶支架置于37℃的模拟体液中进行体外降解评价，结果如图4所示。
实施例7
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶2，然后使用0.05M盐酸调整pH值为5，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在60℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将5g明胶溶解在步骤(1)所述的100mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用60℃的磁力搅拌水浴锅加热得到5％的明胶溶液；然后加入2g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用12000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度50℃，透析时间1天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述3％的双键功能化的明胶材料溶解在1％的I2959溶液中，溶解温度为40℃，然后加入鲁米诺50mM，调整鲁米诺和过硫酸钾两者比例为1∶1，使用365nm的紫外灯(60mW/cm2)照射20min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。将所制备的水凝胶支架使用MTT的测试方法评价其细胞相容性，结果如图5所示。
实施例8
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中得到0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，保证2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的比例为1∶2，然后使用0.05M盐酸调整pH值为5，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所有的溶解步骤均在60℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
(2)将5g明胶溶解在步骤(1)所述的100mL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用60℃的磁力搅拌水浴锅加热得到5％的明胶溶液；然后加入2g甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用12000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度50℃，透析时间1天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述5％的双键功能化的明胶材料溶解在0.5％的I2959溶液中，溶解温度为550℃，然后加入鲁米诺100mM，调整鲁米诺和过硫酸铵两者比例为1∶1，使用365nm的紫外灯(30mW/cm2)照射30min即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。将所制备的水凝胶支架植入小鼠心肌梗死部位进行心脏超声和组织学染色评价，其测试结果如图6所示。
综上表明，我们提供了一种利用光敏基团双键修饰明胶侧链得到功能化基团通过光引发自由基聚合反应并掺杂鲁米诺氧化反应制备明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶支架，不仅具有可调的机械性能，也拥有优良的组织相容性和电传导特性，可有效恢复梗死区域的电传导，提高心肌梗死后的心功能，有望后期在电子皮肤、心肌组织工程支架方面可以广泛应用。
Claims (11)
1.一种明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶的制备方法，其方法特征在于，包括如下步骤：
(1)将2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解在去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌水浴锅搅拌溶解后得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，然后向2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液加入氯化钠溶液确保其完全溶解，使用盐酸调整pH值，得到2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；
(2)将明胶溶解在步骤(1)所述的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，使用磁力搅拌水浴锅加热得到明胶溶液；然后加入甲基丙烯酸酐，待反应结束后，使用透析袋在去离子水中透析除杂，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得双键功能化修饰后明胶材料。
(3)将步骤(2)所述双键功能化的明胶材料溶解在光引发剂溶液中，然后加入鲁米诺和引发剂，在紫外光照射下即得明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸和氯化钠的溶解温度为20-60℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸的摩尔浓度为10-100mM，氯化钠添加的比例为：2-(N-吗啡啉)乙磺酸∶氯化钠＝1-10∶1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液的pH值为4-6.5，盐酸摩尔浓度为0.1-1.0M。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述明胶溶液浓度为5-20％，溶解温度为50-70℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述甲基丙烯酸的添加量为明胶质量的1-10％，反应温度为50-70℃，反应时间为6-24小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述双键功能化修饰后明胶材料的透析温度为40-60℃，透析液为去离子水、超纯水以及磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)，透析袋的截留量为1000-14000道尔顿，透析时间1-7天。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢等氧化剂，其引发剂和鲁米诺的比例为20∶1-1∶20，鲁米诺的摩尔浓度为1-100mM。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，其光引发剂的浓度为0.5-2％，功能化明胶的溶解浓度为3-20％、溶解温度为37-70℃，紫外光波长为365nm，紫外光照射功率为1-300mW/cm2，紫外光的照射时间为1-60分钟。
10.权利要求1-9任意一项所述制备方法制得的明胶偶联的可注射电传导复合水凝胶。
11.权利要求1-10任一所述水凝胶支架在恢复心肌梗死区域的电传导、抑制梗死区域电信号紊乱和心功能障碍、促进心肌组织修复与重塑。
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