CN113425899B - 一种导电可降解多功能组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料技术领域，公开了一种导电可降解多功能组织工程支架及其制备方法，其中用于形成导电且可降解的组织工程支架的前驱体，包括二维磷基纳米材料、生物高分子材料和交联剂，其中，生物高分子材料和交联剂用于形成水凝胶支架的框架，二维磷基纳米材料用于负载于水凝胶支架的内部或表面以提高支架的导电性。本发明通过对支架及其前驱体的关键组成进行改进，引入二维磷基纳米材料，与生物高分子材料(如自然界中天然存在的天然高分子材料)配合，参与形成本发明中的导电可降解多功能组织工程支架及其前驱体，得到的组织工程支架具有可导电、可降解的功能，并且能够引导神经再生，极大的促进神经损伤区域的功能恢复。

Description

一种导电可降解多功能组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种导电可降解多功能组织工程支架及其制备方法。
背景技术
随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。由于脊髓损伤所导致的社会经济损失，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。
可植入支架是提供细胞支撑的有效策略。临床上最常用的移植材料是自体神经，但是供体直径细，可取数量极为有限，难以满足临床需求；已知的人工合成支架材料包括胶原蛋白、纤连蛋白、聚乳酸、聚羟基乙酸等材料，但是这些材料的降解速度快且不可控、降解产生酸性有害物质、不导电，也无法满足神经支架基本要求。这些方法的治疗效果都不是很理想，不能完全恢复受损神经的功能，且治疗周期长，治疗成本高。因此，发展一种更加优良的材料和方法便成为医疗研究领域亟待解决的问题。
神经组织支架的目的在于解决组织器官移植供求不平衡之间的矛盾以及更有效的解决损伤修复难题。构建全新的支架代替损伤或者缺损的组织，从而成功解决因为神经损伤移植物缺乏和替代物导致的后遗症等不良后果，是一种有效的方法和根本途径。理想的神经组织支架材料应具有模拟神经组织形状的三维结构，并且要求其满足生物相容性好、高电导率、无抗原性、容易获得且成本低廉等基本条件。这也正是本领域的科研人员长期以来最重要的研究方向之一。
近年来，不少科研机构和企业投入了大量的人力、物力与财力对神经修复材料进行研究。但是已有报道的神经修复策略中缺乏一种理想的神经修复材料，能为神经再生提供最佳的生物学和理化微环境，实现加速促进神经修复的目的。即，需要一种改性的类似神经纤维结构的、细胞相容性好、高电导率的制作神经支架的材料，为神经修复提供更好的解决方案。
目前研究广泛的导电高分子包括：聚苯胺，聚吡咯，聚乙烯二氧噻吩，然而，这些常用的导电高分子材料均不可降解，制约其在生物医学应用。例如，中国专利CN201210231871公开了一种三维仿生电极化梯度孔神经导管的构建及其制备，虽然它也公开了神经导管的制备方法，但仍存在导管不导电的问题；中国专利CN20131045578公开了一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法，虽然它也公开了一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架的制备方法，但仍存在支架不可导电的问题。又例如，中国专利CN201610166842公开了一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，虽然它也公开了导电神经导管的制备方法，但仍存在聚吡咯不可降解的问题。因此，如何提高电活性神经植入材料的降解性能，是其研究和发展的重中之重。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种导电可降解多功能组织工程支架及其制备方法，其中通过对支架及其前驱体的关键组成进行改进，引入二维磷基纳米材料，磷基纳米材料作为新型二维材料，其具有类似石墨烯的结构和生物化学特性，具有导电性和生物降解性能，与生物高分子材料(如自然界中天然存在的天然高分子材料，当然也可以预先对这些天然高分子材料进行改性)配合，参与形成本发明中的导电可降解多功能组织工程支架及其前驱体，得到的组织工程支架具有可导电、可降解的功能，并且能够引导神经再生，极大的促进神经损伤区域的功能恢复。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于形成导电且可降解的组织工程支架的前驱体，其特征在于，该前驱体包括二维磷基纳米材料、生物高分子材料和交联剂，其中，所述生物高分子材料和所述交联剂用于形成水凝胶支架的框架，所述二维磷基纳米材料用于负载于所述水凝胶支架的内部或表面以提高支架的导电性。
按照本发明的又一方面，本发明提供了一种导电且可降解的组织工程支架，其特征在于，是由包括二维磷基纳米材料、生物高分子材料和交联剂在内的原料制成，其中，所述生物高分子材料和所述交联剂用于形成水凝胶支架的框架，所述二维磷基纳米材料用于负载于所述水凝胶支架的内部或表面以提高支架的导电性。
作为本发明的进一步优选，所述二维磷基纳米材料选自：本征或元素掺杂的黑磷纳米片、本征或元素掺杂的硅磷纳米片、本征或元素掺杂的锗磷纳米片。
作为本发明的进一步优选，所述生物高分子材料为透明质酸、壳聚糖、明胶、海藻酸钠中的一种或多种的组合；所述二维磷基纳米材料与所述生物高分子材料的质量比优选为(0.1％～10％)：1；
所述交联剂为辣根过氧化物酶、戊二醛、氯化钙中的一种或多种的组合。
作为本发明的进一步优选，所述生物高分子材料具体为多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)。
按照本发明的另一方面，本发明提供了制备上述前驱体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将二维磷基纳米材料超声分散于第一溶剂中，得到分散液A；
(2)将生物高分子材料溶解于第二溶剂中，得到溶液B；
(3)将所述分散液A与所述溶液B混合，然后超声处理，得到分散均匀的混合溶液C；
(4)在所述步骤(3)得到的所述混合溶液C中加入交联剂后，即可得到用于形成导电且可降解的组织工程支架的前驱体。
按照本发明的再一方面，本发明提供了制备上述导电且可降解的组织工程支架的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将二维磷基纳米材料超声分散于第一溶剂中，得到分散液A；
(2)将生物高分子材料溶解于第二溶剂中，得到溶液B；
(3)将所述分散液A与所述溶液B混合，然后超声处理，得到分散均匀的混合溶液C；
(4)在所述步骤(3)得到的所述混合溶液C中加入交联剂后注入模具或待修复的目标区域内固化成型，即可得到导电且可降解的组织工程支架。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述二维磷基纳米材料是按以下方法制备得到的：
将磷基块状晶体夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的四正丁基硫酸氢铵(TBA·HSO4)作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状晶体30min，然后进行水浴超声处理，接着进行第一次离心并取上清液，得到二维磷基纳米材料的悬浮液；然后对所述二维磷基纳米材料的悬浮液进行第二次离心并取沉淀，即可得到二维磷基纳米材料；
其中，所述磷基块状晶体具体为本征或元素掺杂的黑磷块状晶体、本征或元素掺杂的硅磷块状晶体、本征或元素掺杂的锗磷块状晶体；
所述磷基块状晶体与所述电解质溶液的用量比为10mg：15mL；超声处理的时间为1-2h；所述第一次离心的转速为1500-3000rpm，离心时间为10-20min；所述第二次离心的转速为5000-8000rpm，离心时间为10-20min。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述第一溶剂为去离子水、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种或多种组合；
所述步骤(2)中，所述第二溶剂为去离子水或体积百分浓度为1％的醋酸水溶液。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述溶液B具体为多巴胺修饰的透明质酸溶液；优选的，该多巴胺修饰的透明质酸溶液是按以下方法制备得到的：
将透明质酸(HA)溶解去离子水中，得到浓度为0.004g/mL～0.01g/mL的透明质酸溶液；接着，将该透明质酸溶液的pH值调节至5.0～6.0，然后再向其中加入EDC、NHS和多巴胺(DA)，使EDC的浓度为14mol/L～35mol/L，NHS的浓度为14mol/L～35mol/L，多巴胺(DA)的浓度为14mol/L～50mol/L；接着室温搅拌过夜，然后将得到的反应物经过8000kD-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后即可得到接枝多巴胺的透明质酸(HA-DA)，也即多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)；最后，将所述多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)分散于去离子水中即可得到多巴胺修饰的透明质酸溶液；
更优选的，所述多巴胺修饰的透明质酸溶液中多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)的质量百分浓度为2～3％。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得以下有益效果：
(1)本发明率先将二维磷基纳米材料引入到神经生物医用材料领域中。二维磷基纳米材料，如黑磷(BP)、硅磷(SiP，SiP2，SiP3)、锗磷(GeP，GeP3，GeP5)和元素掺杂黑磷、硅磷、锗磷，具有导电性和生物可降解性能，是一种新型电活性纳米材料，这类二维磷基纳米材料的开发为解决电活性生物医用材料不可降解的难题提供新的技术思路。这些二维磷基纳米材料具有导电、可降解的特点，相较于块体材料，具有比表面积大，在水凝胶支架中分散性好，能在水凝胶支架中桥接相连成导电通路从而提高支架的导电性等优点；相较于其他纳米材料，如二维石墨烯、一维碳纳米管、0维金纳米颗粒，本发明之所以采用二维磷基纳米材料是因为磷基材料具有生物可降解性能，可以提高复合支架生物应用的安全性。
(2)二维磷基纳米材料，如黑磷(BP)、硅磷(SiP，SiP2，SiP3)、锗磷(GeP，GeP3，GeP5)和元素掺杂黑磷、硅磷、锗磷，具有生物可降解性能，降解后释放出磷、硅元素是人体内存在的元素，可以参与机体代谢活动；锗元素也通过动物实验证明是无毒的，具有良好的生物安全性。
(3)本发明实施例通过大鼠全横断脊髓损伤模型发现上述导电可降解组织工程支架除了作为支架引导神经再生的作用，移植支架材料后脊髓损伤部位的胶质瘢痕相关的标志物GFAP明显减少，这说明新型导电可降解组织工程支架除了为神经再生提供支撑和方向上的引导外，还可以明显抑制胶质瘢痕的形成。同时，在该研究中，我们还发现，通过新型导电可降解组织工程支架移植到脊髓损伤区域后能够改善大鼠后肢恢复行走能力和电生理信号的传输。
本发明利用可降解导电二维磷基纳米材料，如黑磷(BP)、硅磷(SiP，SiP2，SiP3)、锗磷(GeP，GeP3，GeP5)和元素掺杂黑磷、硅磷、锗磷，制备导电可降解组织工程支架及其前驱体，得到的导电可降解组织工程支架，负载有磷基纳米材料，支架框架对应由生物高分子材料通过交联剂交联得到的凝胶状支架框架，该导电可降解组织工程支架能够：促进神经元延伸；促进神经元形成；促进神经元存活；促进神经元分化；促进神经突出形成；促进神经干细胞增殖；促进神经干细胞分化；修复脊髓损伤；促进脊髓损伤的神经再生；促进脊髓损伤后的恢复。本发明对于中枢神经、外周神经和心肌组织损伤修复具有重大的应用价值。
该导电可降解组织工程支架可进一步用于制备具有如下(1)、(2)、(3)、(4)和(5)功能中至少一种功能的产品：(1)修复脊髓损伤(即，修复中枢神经损伤)；(2)促进神经再生；(3)减少脊髓神经损伤部位胶质细胞增生；(4)引导受损神经纤维的有序再生；(5)引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。
本发明主要解决目前导电支架不可降解的难题，利用二维磷基纳米材料与生物高分子材料的配合得到兼具导电性及可降解特性的多功能组织工程支架及其前驱体。相较于块体磷基材料，本发明采用二维磷基纳米材料(二维磷基纳米材料例如可以通过电化学插层及超声结合的方法将块体磷基材料剥离成为二维磷基纳米片)，可以提高磷基纳米材料的比表面积、并有助于提高其在水凝胶支架中分散性，提高其在水凝胶支架中桥接相连的程度从而提高支架的导电性能。本发明的磷基纳米复合支架还具有生物可降解性能，相较于现有技术中的导电支架大大提升了可降解特性(例如，现有技术主要是在支架材料中复合纳米石墨烯，碳纳米管以及金属纳米颗粒等，但是这些导电支架均是不可降解的)。
综上所述，本发明结合磷基纳米材料和生物高分子材料有望开发出新型导电可降解支架修复脊髓损伤，为神经修复提供更好的解决方案，该新型导电可降解组织工程支架在未来临床脊髓损伤修复的应用具有重要的现实指导意义。
附图说明
图1是实施例1中BP纳米片透射电镜形貌图。图中标尺代表1μm。
图2是实施例1中复合水凝胶支架多孔结构图。图中标尺代表200μm。
图3是实施例4中SiP纳米片透射电镜形貌图。图中标尺代表500nm。
图4是实施例4中复合水凝胶支架多孔结构图。图中标尺代表200μm。
图5是实施例7中GeP纳米片透射电镜形貌图。图中标尺代表1μm。
图6是实施例7中复合水凝胶支架多孔结构图。图中标尺代表200μm。
图7是实施例10中导电可降解多功能组织工程支架电导率。图7中，“HA-DA”对应单纯HA-DA形成的水凝胶支架对照组，“HA-DA/BP”对应BP纳米片溶液与HA-DA混合形成的水凝胶支架，“HA-DA/SiP”对应SiP纳米片溶液与HA-DA混合形成的水凝胶支架，“HA-DA/GeP”对应GeP纳米片溶液与HA-DA混合形成的水凝胶支架。
图8是实施例11中导电可降解多功能组织工程支架上神经干细胞黏附形态图；其中，图8中的(a)对应HA-DA，图8中的(b)对应HA-DA/GeP。图8中的(a)与图8中的(b)，放大倍率相同，图中标尺代表100μm。
图9是实施例12中导电可降解多功能组织工程支架上分化的神经干细胞。
图10是实施例13中导电可降解多功能组织工程支架修复脊髓损伤后的大鼠后肢运动功能BBB评分图。图10中，“Sham”对应正常大鼠组，“SCI”对应脊髓损伤大鼠组，“HA-DA”对应使用单纯HA-DA形成的水凝胶支架，“HA-DA/GeP”对应使用GeP纳米片溶液与HA-DA混合形成的水凝胶支架。
图11是实施例13中导电可降解多功能组织工程支架修复脊髓损伤后的大鼠后肢运动功能恢复迈步行走图；其中，图11中的(a)对应HA-DA，图11中的(b)对应HA-DA/GeP。
图12是实施例13中导电可降解多功能组织工程支架材料及对照组(单纯HA-DA支架材料)、空白对照组(SCI组)修复的大鼠脊髓切片免疫荧光图。图12中，A1、A2、A3、A4均对应SCI组，B1、B2、B3、B4均对应使用单纯HA-DA支架材料组，C1、C2、C3、C4均对应使用导电可降解多功能组织工程支架材料组。另外，A1、B1、C1均对应Tuj1/GFAP/DAPI(标尺均代表1mm)，A2、B2、C2为A1、B1、C1损伤区域的局部放大示意图(标尺均代表100μm)；A3、B3、C3均对应NF200/MAP2/DAPI(标尺均代表1mm)，A4、B4、C4为A3、B3、C3损伤区域的局部放大示意图(标尺均代表100μm)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下面以燕山大学提供的块状晶体BP、SiP、GeP分别为原料，对本发明进行详细介绍。
实施例1导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(BP)
称取10mg块状晶体BP(当块体原料过大时，可以采用打磨等常规处理，以控制质量)，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的四正丁基硫酸氢铵(TBA·HSO4)作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行水浴超声处理1h，然后进行1500rpm离心20min并取上清液，得到二维BP纳米片的悬浮液；将二维BP纳米片的悬浮液进行5000rpm离心20min并取沉淀，得到二维BP纳米片；
将二维BP纳米片超声分散于少量无水乙醇中，无水乙醇的加入量可覆盖二维BP纳米片沉淀即可，得到分散液A。BP纳米片透射电镜形貌如图1所示。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在200ml去离子水中，调节pH到5.0后，缓慢加入7mol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和7mol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和7mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出产物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的BP@HA-DA混合溶液(即，混合溶液C)，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架(交联成形既可以通过注入模具中固化成型，也可以通过注射到病灶部位等待修复的目标区域凝胶成型)；其中，二维BP纳米片与HA-DA的质量比为0.5％：1。复合水凝胶支架多孔结构如图2所示。
实施例2导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(BP)
称取10mg块状晶体BP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理1.5h，然后进行2000rpm离心15min并取上清液，得到二维BP纳米片的悬浮液；将二维BP纳米片的悬浮液进行7000rpm离心15min并取沉淀，得到二维BP纳米片；
将二维BP纳米片超声分散于少量无水乙醇中，无水乙醇的加入量可覆盖二维BP纳米片沉淀即可，得到分散液A。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在200ml去离子水中，调节pH到5.5后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和8mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出产物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的BP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维BP纳米片与HA-DA的质量比为0.1％：1。
实施例3导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(BP)
称取10mg块状晶体BP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理2h，然后进行3000rpm离心10min并取上清液，得到二维BP纳米片的悬浮液；将二维BP纳米片的悬浮液进行8000rpm离心10min并取沉淀，得到二维BP纳米片；
将二维BP纳米片超声分散于少量无水乙醇中，无水乙醇的加入量可覆盖二维BP纳米片沉淀即可，得到分散液A。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在200ml去离子水中，调节pH到6.0后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和10mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出产物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的BP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维BP纳米片与HA-DA的质量比为1.0％：1。
实施例4导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(SiP)
称取10mg块状晶体SiP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理1h，然后进行1500rpm离心20min并取上清液，得到二维SiP纳米片的悬浮液；将二维SiP纳米片的悬浮液进行5000rpm离心20min并取沉淀，得到二维SiP纳米片；
将二维SiP纳米片超声分散于少量无水乙醇中，无水乙醇的加入量可覆盖二维SiP纳米片沉淀即可，得到分散液A。SiP纳米片透射电镜形貌如图3所示。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在200ml去离子水中，调节pH到5.0后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和7mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出反应物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的SiP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维SiP纳米片与HA-DA的质量比为0.5％：1。复合水凝胶支架多孔结构如图4所示。
实施例5导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(SiP)
称取10mg块状晶体SiP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理1.5h，然后进行2500rpm离心15min并取上清液，得到二维SiP纳米片的悬浮液；将二维SiP纳米片的悬浮液进行7000rpm离心15min并取沉淀，得到二维SiP纳米片；
将二维SiP纳米片超声分散于少量无水乙醇中，无水乙醇的加入量可覆盖二维SiP纳米片沉淀即可，得到分散液A。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在400ml去离子水中，调节pH到5.5后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和8mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出反应物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的SiP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维SiP纳米片与HA-DA的质量比为0.1％：1。
实施例6导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(SiP)
称取10mg块状晶体SiP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理2h，然后进行3000rpm离心10min并取上清液，得到二维SiP纳米片的悬浮液；将二维SiP纳米片的悬浮液进行8000rpm离心10min并取沉淀，得到二维SiP纳米片；
将二维SiP纳米片超声分散于少量无水乙醇中，无水乙醇的加入量可覆盖二维SiP纳米片沉淀即可，得到分散液A。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在500ml去离子水中，调节pH到6.0后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和10mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出反应物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的SiP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维SiP纳米片与HA-DA的质量比为1.0％：1。
实施例7导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(GeP)
称取10mg块状晶体GeP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理1h，然后进行1500rpm离心20min并取上清液，得到二维GeP纳米片的悬浮液；将二维GeP纳米片的悬浮液进行5000rpm离心20min并取沉淀，得到二维GeP纳米片；
将二维GeP纳米片超声分散于少量去离子水中，去离子水的加入量可覆盖二维GeP纳米片沉淀即可，得到分散液A。GeP纳米片透射电镜形貌如图5所示。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在200ml去离子水中，调节pH到5.0后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和7mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出反应物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的GeP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维GeP纳米片与HA-DA的质量比为0.5％：1。复合水凝胶支架多孔结构如图6所示。
实施例8导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(GeP)
称取10mg块状晶体GeP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理1.5h，然后进行2000rpm离心15min并取上清液，得到二维GeP纳米片的悬浮液；将二维GeP纳米片的悬浮液进行7000rpm离心15min并取沉淀，得到二维GeP纳米片；
将二维GeP纳米片超声分散于少量去离子水中，去离子水的加入量可覆盖二维GeP纳米片沉淀即可，得到分散液A。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在400ml去离子水中，调节pH到5.5后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和8mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出反应物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的GeP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维GeP纳米片与HA-DA的质量比为0.1％：1。
实施例9导电可降解多功能组织工程支架的制备
1.二维磷基纳米片的制备(GeP)
称取10mg块状晶体GeP，夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，15mL碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的TBA·HSO4作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状30min后进行冰水浴超声处理2h，然后进行3000rpm离心10min并取上清液，得到二维GeP纳米片的悬浮液；将二维GeP纳米片的悬浮液进行8000rpm离心10min并取沉淀，得到二维GeP纳米片；
将二维GeP纳米片超声分散于少量去离子水中，去离子水的加入量可覆盖二维GeP纳米片沉淀即可，得到分散液A。
2.高分子材料透明质酸溶液的制备
称取2g透明质酸(HA)溶解在500ml去离子水中，调节pH到6.0后，缓慢加入7molEDC和7mol NHS和10mol多巴胺(DA)，室温搅拌过夜，取出反应物经过8000-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后得到接枝DA的透明质酸(HA-DA)，HA-DA溶解到去离子水中配成质量浓度为3％的HA-DA水溶液，即为溶液B。
3.复合支架的制备
将上述分散液A和溶液B互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的GeP@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，二维GeP纳米片与HA-DA的质量比为1.0％：1。
实施例10导电可降解多功能组织工程支架电导率测试，具体实施步骤：
将上述各种磷基纳米片溶液(实施例1中的BP，实施例4中的SiP，实施例7中的GeP)与质量浓度为3％的HA-DA溶液互溶，混合均匀后进行水浴超声处理，得到分散均匀的磷基纳米片@HA-DA混合溶液，加入交联剂辣根过氧化物酶后注入24孔细胞培养板模具中，室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架；其中，确保二维磷基纳米片与HA-DA的质量比为0.5％：1。单纯的质量浓度为3％的HA-DA溶液加入交联剂辣根过氧化物酶后注入24孔细胞培养板模具中，室温放置数分钟即可交联形成复合水凝胶支架作为对照支架组HA-DA；将24孔细胞培养板中的水凝胶支架取出，用四探针阻抗分析仪测试其电导率。新型导电可降解组织工程支架电导率如图7所示。
实施例11导电可降解多功能组织工程支架促进体外神经元的细胞黏附性实验，具体实施步骤：
将实施例7得到的导电可降解多功能组织工程支架制备成直径为8mm，厚度为2mm的圆形薄片，以单纯HA-DA形成的水凝胶支架作为对照组，采用75％酒精溶液浸泡12h，磷酸缓冲盐溶液(PBS)浸泡2h，体积百分数10％双抗溶液浸泡12h，PBS浸泡2h的流程进行灭菌操作，将原代神经干细胞(NSC)以5×105NSCs密度接种于支架材料表面，在37℃，体积百分数5％CO2条件下培养7天，将样品取出用PBS冲洗，加入质量百分数4％多聚甲醛室温下固定15分钟。然后用体积百分数0.5％Triton/PBS溶液室温透化处理细胞5min。PBS再清洗细胞3次后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI(100ng/mL)和异硫氰酸荧光素FITC标记的鬼笔环肽(100nM)分别对细胞核和骨架进行染色。PBS清洗去染色液后，激光共聚焦显微镜拍照观察。图8为导电可降解多功能组织工程支架上神经干细胞的黏附形态图。结果表明：神经干细胞能够较好的在导电可降解多功能组织工程支架上胞黏附生长。
实施例12导电可降解多功能组织工程支架促进体外神经元的细胞分化实验，具体实施步骤：
将实施例3得到的导电可降解多功能组织工程支架制备成直径为8mm，厚度为2mm的圆形薄片，以单纯HA-DA形成的水凝胶支架对照组，采用75％酒精溶液浸泡12h，PBS浸泡2h，10％双抗溶液浸泡12h，PBS浸泡2h的流程进行灭菌操作，将5×105NSCs接种于支架材料表面，在37℃，5％CO2条件下培养7天，将样品取出用PBS冲洗，加入4％多聚甲醛室温下固定15分钟。用PBS洗涤三次后，将固定好的细胞/材料在0.1％TritonX-100中在室温孵育15分钟进行破膜。用1％牛血清蛋白(BSA)溶液在室温封闭2小时后，加入一抗(Tuj 1，稀释倍数为1：1000；GFAP，稀释倍数为1：1000)4℃下过夜中。用PBS洗涤三次后，将样品置于含5％胎牛血清的二抗山羊抗小鼠IgG Alexa-Fluor 488(稀释倍数为1：500)和驴抗兔IgG AlexaFluor 594(稀释倍数为1：800)中避光条件下孵育2小时。洗去多余二抗后使用Hoechst33342对细胞核进行染色5min，PBS漂洗三次，加入甘油封片，使用激光共焦显微镜进行观察和拍照。图9为导电可降解多功能组织工程支架上分化的神经干细胞。结果表明：导电可降解多功能组织工程支架能够促进神经干细胞分化。
实施例13用导电可降解多功能组织工程支架治疗2mm大鼠T9脊髓全横断损伤：
动物实验用成年SD大鼠(220-250g)，购买自湖北省实验动物中心。手术前使用水合氯醛麻醉剂进行腹腔注射。待麻醉后，将小鼠背处毛发减掉并用碘伏消毒，用手术剪依次剪开背部皮肤和筋膜，分离肌肉，咬除T8和T9段椎骨以暴露出脊髓。在显微镜下用显微剪刀切除右侧2mm长脊髓，构建全切脊髓损伤的模型，使用棉花止血后，将实施例7新型导电可降解组织工程支架注射植入损伤部位。将肌肉和皮肤缝合。所有缝合操作均在体视显微镜下完成。术后小鼠恢复正常后，放于笼中饲养并进行日常观察。
运动功能评分：
大鼠后肢运动功能恢复采用BBB评分规则来进行评价，术后每周进行一次评分，直到第6周。将小鼠置于一空旷场地进行评定，每一次，每只动物待其适应后开始连续行走时，两位对分组设计不知情的观察者观察5分钟后开始进行评分。图10为大鼠后肢运动功能恢复的BBB评分图，图11为典型的大鼠后肢运动功能恢复后迈步行走图。
运动功能评分结果显示：从术后第一周开始，移植新型导电可降解组织工程支架材料组的大鼠较对照组大鼠均具有显著性改善，此外，自第4周开始，移植新型导电可降解组织工程支架材料组的大鼠较单纯移植HA-DA支架材料组的犬表现出行为学优势，部分大鼠能够偶尔后肢称重站立并能迈步行走。上述结果表明，移植新型导电可降解组织工程支架材料修复治疗策略能显著改善脊髓全横断后大鼠的运动功能恢复。
组织学观察：
术后6周，我们对犬脊髓切片进行新生神经元标志物Tuj-1，星型胶质细胞标志物GFAP,神经纤维丝NF200以及成熟神经元标志物MAP2的免疫荧光染色以确定再生进入损伤区的神经前体细胞及神经元的数量和密度；
具体染色方法：浸泡在多聚甲醛中的脊髓组织先用PBS清洗3次，每次2h。再以质量百分数15％，20％，30％蔗糖溶液梯度脱水，在恒冷箱冷冻切片机进行脊髓横行连续切片，厚度15μm，进行免疫荧光染色。染色在室温下湿盒内进行，步骤如下:
1.切片用PBS清洗3次，每次5min；
2.在体积百分数10％山羊血清中孵育30min以封闭非特异结合位点；
3.分别先后加一抗Anti-Tuj 1(稀释倍数1:200)，Anti-GFAP(稀释倍数1:200)双染和Anti-NF200，Anti-MAP2双染孵育过夜；
4.使用PBS清洗3次，每次5min；
5.分别加二抗山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(稀释倍数1:500)和驴抗兔IgGAlexa Fluor 594(稀释倍数1:800)孵育1h。
6.使用PBS清洗3次，每次5min；
7.加入Hoechst 33342溶液避光状态下染核5min；
8.使用PBS清洗3次，每次5min；
9.使用甘油封片，使用激光共聚焦观察及拍照。
图12为导电可降解多功能组织工程支架材料修复的大鼠脊髓切片免疫荧光图。
结果显示：移植导电可降解多功能组织工程支架材料组的大鼠长入损伤区内的新生的神经元(Tuj1)、成熟的神经元细胞(MAP2)以及神经纤维丝(NF200)的数量明显高于移植单纯HA-DA支架材料组及空白对照组(SCI组)，说明导电可降解组织工程支架材料能更好的引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。
上述实施例仅为示例，二维磷基纳米材料可在黑磷(BP)、硅磷(SiP，SiP2，SiP3)、锗磷(GeP，GeP3，GeP5)和元素掺杂黑磷、硅磷、锗磷中灵活选取(掺杂元素的具体种类及掺杂量，均可根据实际需求，灵活调整)。除特别说明外，上述实施例中所使用的各种试剂均为市售商品，如市售的天然高分子材料等。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于形成导电且可降解的组织工程支架的前驱体，其特征在于，该前驱体包括二维磷基纳米材料、生物高分子材料和交联剂，其中，所述生物高分子材料和所述交联剂用于形成水凝胶支架的框架，所述二维磷基纳米材料用于负载于所述水凝胶支架的内部或表面以提高支架的导电性，所述二维磷基纳米材料具体为本征或元素掺杂的锗磷纳米片。
2.一种导电且可降解的组织工程支架，其特征在于，是由包括二维磷基纳米材料、生物高分子材料和交联剂在内的原料制成，其中，所述生物高分子材料和所述交联剂用于形成水凝胶支架的框架，所述二维磷基纳米材料用于负载于所述水凝胶支架的内部或表面以提高支架的导电性，所述二维磷基纳米材料具体为本征或元素掺杂的锗磷纳米片。
3.如权利要求1所述前驱体或如权利要求2所述支架，其特征在于，所述生物高分子材料为透明质酸、壳聚糖、明胶、海藻酸钠中的一种或多种的组合；
所述交联剂为辣根过氧化物酶、戊二醛、氯化钙中的一种或多种的组合。
4.如权利要求1所述前驱体或如权利要求2所述支架，其特征在于，所述二维磷基纳米材料与所述生物高分子材料的质量比为(0.1％～10％)：1。
5.如权利要求1所述前驱体或如权利要求2所述支架，其特征在于，所述生物高分子材料具体为多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)。
6.制备如权利要求1所述前驱体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将二维磷基纳米材料超声分散于第一溶剂中，得到分散液A；
(2)将生物高分子材料溶解于第二溶剂中，得到溶液B；
(3)将所述分散液A与所述溶液B混合，然后超声处理，得到分散均匀的混合溶液C；
(4)在所述步骤(3)得到的所述混合溶液C中加入交联剂后，即可得到用于形成导电且可降解的组织工程支架的前驱体。
7.制备如权利要求2所述导电且可降解的组织工程支架的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将二维磷基纳米材料超声分散于第一溶剂中，得到分散液A；
(2)将生物高分子材料溶解于第二溶剂中，得到溶液B；
(3)将所述分散液A与所述溶液B混合，然后超声处理，得到分散均匀的混合溶液C；
(4)在所述步骤(3)得到的所述混合溶液C中加入交联剂后注入模具或待修复的目标区域内固化成型，即可得到导电且可降解的组织工程支架。
8.如权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述二维磷基纳米材料是按以下方法制备得到的：
将磷基块状晶体夹于电极夹上作为阴极，铂片为阳极，碳酸丙烯酯溶解0.01mol/L的四正丁基硫酸氢铵(TBA·HSO4)作为电解质溶液，通过电化学工作站施加-5V电压剥离磷基块状晶体30min，然后进行水浴超声处理，接着进行第一次离心并取上清液，得到二维磷基纳米材料的悬浮液；然后对所述二维磷基纳米材料的悬浮液进行第二次离心并取沉淀，即可得到二维磷基纳米材料；
其中，所述磷基块状晶体具体为本征或元素掺杂的锗磷块状晶体；
所述磷基块状晶体与所述电解质溶液的用量比为10mg：15mL；超声处理的时间为1-2h；所述第一次离心的转速为1500-3000rpm，离心时间为10-20min；所述第二次离心的转速为5000-8000rpm，离心时间为10-20min。
9.如权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第一溶剂为去离子水、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种或多种组合；
所述步骤(2)中，所述第二溶剂为去离子水或体积百分浓度为1％的醋酸水溶液。
10.如权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述溶液B具体为多巴胺修饰的透明质酸溶液；该多巴胺修饰的透明质酸溶液是按以下方法制备得到的：
将透明质酸(HA)溶解去离子水中，得到浓度为0.004g/mL～0.01g/mL的透明质酸溶液；接着，将该透明质酸溶液的pH值调节至5.0～6.0，然后再向其中加入EDC、NHS和多巴胺(DA)，使EDC的浓度为14mol/L～35mol/L，NHS的浓度为14mol/L～35mol/L，多巴胺(DA)的浓度为14mol/L～50mol/L；接着室温搅拌过夜，然后将得到的反应物经过8000kD-12000kD的透析袋透析，冷冻干燥后即可得到接枝多巴胺的透明质酸(HA-DA)，也即多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)；最后，将所述多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)分散于去离子水中即可得到多巴胺修饰的透明质酸溶液。
11.如权利要求10所述方法，其特征在于，所述多巴胺修饰的透明质酸溶液中多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)的质量百分浓度为2～3％。
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