CN109821061A - 一种以胶原纺丝和透明质酸为基材的粘附性仿生凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以胶原纺丝和透明质酸为基材的粘附性仿生凝胶，属于生物材料技术领域。本发明基于分子仿生学原理，以透明质酸和纺丝胶原蛋白作为主要材料，开发了一种新型、安全有效的复合材料凝胶给药系统。本发明构建的Col‑HA新型仿生水凝胶，具有高度的生物相容性，良好的皮肤粘附性，适宜的机械强度和吸水性能。

Description

一种以胶原纺丝和透明质酸为基材的粘附性仿生凝胶

技术领域

本发明涉及一种以胶原纺丝和透明质酸为基材的粘附性仿生凝胶，属于生物材料技术领域。

背景技术

临床上，急性和慢性创面的治疗存在一定的困难和不足，目前，经过科学工作者的不断努力，创面治疗方面的研究已有积极进展。其中，水凝胶是一种新颖而有效的治疗方式，其性质贴近细胞外基质，具有三维立体空间结构，透气性好，有优良的生物相容性，能提供给伤口湿润的修复环境，不易与伤口发生黏连，能够减轻换药时给患者带来的痛苦等，因此，在急慢性创面的治疗中，水凝胶类伤口敷料得到了越来越多的应用。

水凝胶根据制备的材料可以分为天然高分子水凝胶和合成型高分子水凝胶两类。其中，天然高分子材料广泛存在于动、植物体内，无毒无刺激性，生物相容性良好。很多天然高分子都是细胞外基质的主要成分，具有调控细胞分裂、粘附、分化和迁移的功能，因此适用于伤口敷料的制备。

胶原蛋白(Collagen，Col)，尤其是I型胶原蛋白，是人体内含量最多(25-30％)的蛋白质，广泛分布于皮肤、肌腱和骨组织中。胶原与细胞的增殖、分化、迁移，细胞间信号的传递，组织的形成，关节的润滑、血液的凝固等都密切相关。胶原蛋白无毒、无刺激性，与人体组织的相容性良好，同时能促进细胞增殖，降解产物可被人体吸收，因此，其在组织工程支架材料和人工皮肤制备等方面具有广阔的应用价值。但是，单纯的胶原支架机械性能不足、降解速率较快，这在一定程度上限制了其应用。因此，常将胶原进行改性处理，或与其他高分子材料联合使用。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种天然的糖胺多糖，存在于关节软骨及关节腔液中。HA作为医用材料及药物载体具有很多独特的优点，如具有高度的粘弹性、良好的生物相容性、可生物降解性等。HA在细胞外基质中普遍存在，可以调节细胞外液的化学组成、润滑和促进创伤愈合，但是，HA易溶于水且吸收迅速，在组织中停留时间短等性质限制了其在生物材料领域的应用。因此，在保证生物活性和非炎性反应的同时，对HA进行化学修饰能够更好地发挥其作用。

发明内容

为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种改进的仿生凝胶材料及其制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种制备纺丝胶原-透明质酸相结合的具有粘附性的仿生凝胶的方法，所述方法是(1)通过化学交联将有序排列的纺丝胶原纤维固定排列取向并增强机械强度；(2)将交联后的纺丝胶原纤维巯基化；(3)采用多巴胺修饰透明质酸，对修饰后的透明质酸进行巯基化；(4)将巯基化的纺丝胶原和透明质酸通过聚乙二醇二丙烯酸酯进行交联，得到以胶原和透明质酸修饰物为基材的具有粘附性的仿生凝胶。

在本发明的一种实施方式中，所述纺丝胶原纤维是通过湿法纺丝技术得到的，所述湿法纺丝具体是：制备胶原原液，将原液从喷丝孔中压出形成细流，原液细流通过凝固浴后形成纺丝纤维，纤维卷装后进行清洗、消毒和干燥。

在本发明的一种实施方式中，所述交联剂包括但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇酯、三聚氰酸三烯丙酯(TAC)。

在本发明的一种实施方式中，所述巯基化试剂包括但不限于L-半胱胺盐酸盐、3，3-二巯基二丙酸酰肼。

在本发明的一种实施方式中，多巴胺的加入使凝胶具有粘附性。

在本发明的一种实施方式中，所述纺丝胶原在巯基化之前，在含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的乙醇-水溶液中交联。

在本发明的一种实施方式中，所述巯基化是采用L-半胱胺盐酸盐，在pH5～6，室温，氮气保护条件下进行巯基化，然后加入二硫苏糖醇在pH8～9进行还原，防止二硫键的形成。

在本发明的一种实施方式中，所述包括如下步骤：纺丝胶原纤维上的羧基经活化后，与L-半胱胺盐酸盐上的氨基反应，使得胶原纤维被修饰上巯基；将多巴胺、L-半胱胺盐酸盐通过化学键分别连接到HA上；再采用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)作为交联剂与巯基反应，将胶原与透明质酸相连。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：

(1)将纺丝胶原加入含有EDC/NHS的乙醇-水溶液中室温避光反应15h，然后取出胶原丝反复用乙醇和水冲洗数次；

(2)将步骤(1)制备的胶原丝与终浓度2～8mg/mL半胱胺盐酸盐在PBS溶液中氮气保护下反应15～20h，然后调节反应溶液pH至8～9，加入终浓度4～8mg/mL的二硫苏糖醇，反应过夜，获得巯基化的纺丝胶原；

(3)将HA与多巴胺按摩尔比1:2的比例混合，在pH4～5的环境中，在氮气保护下反应过夜，再于pH5-7的环境中透析纯化3～4天，获得透明质酸-多巴胺复合物；

(4)将透明质酸-多巴胺复合物浸泡于pH5～6、终浓度为10～15mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液中，室温下避光搅拌4h；依次以pH 4～5的HC1溶液、1％NaCl(w/v)溶液和pH 5～6的HCl溶液避光透析3天，冷冻干燥，得到巯基化的透明质酸-多巴胺复合物(透明质酸修饰物)。

本发明的第二个目的是提供所述方法制备的纺丝胶原-透明质酸仿生凝胶。

本发明还要求保护所述仿生凝胶在医药领域制备产品方面的应用。

有益效果：本发明的方法制备的凝胶具有如下优点：

(1)从凝胶材料的构建来看，①仿生材料选用纺丝胶原纤维、透明质酸、多巴胺等人体均含有的物质，具有高度的生物相容性；②充分结合每种类型材料的优点，改善胶原纤维材料降解快的问题，改善透明质酸材料机械强度弱的问题；③材料选择仿贻贝的性质，极大地提高水凝胶的粘附性，以解决现有水凝胶大多存在粘附性差的问题。通过上述材料的构建，达到了提高现有剂型顺应性的目标。

(2)本发明通过对胶原纤维和透明质酸的化学修饰，得到胶原纤维巯基取代度为10-20％，透明质酸第一步修饰后多巴胺取代度为10-20％，第二步修饰后巯基取代度为2-10％，由胶原纤维和经多巴胺修饰后的透明质酸交联获得的凝胶能够达到理想的机械强度和粘附性能，弹性模量达到5-7KPa，粘性模量达到0.6-1.1KPa，粘性趋势随角频率的增大而减小，最高为51360Pa·S，最低为68Pa·S。

附图说明

图1为经过交联和巯基化的纺丝胶原纤维图；

图2为纺丝胶原-透明质酸修饰物复合凝胶图；

图3为凝胶的储存模量(G’)及损耗模量(G”)；其中，3％HA+Col为3％透明质酸修饰物水溶液与胶原丝交联形成的凝胶；5％HA+Col为5％透明质酸修饰物水溶液与胶原丝交联形成的凝胶；3％HA为3％透明质酸修饰物水溶液自身交联形成的凝胶；5％HA为5％透明质酸修饰物水溶液自身交联形成的凝胶；

图4为凝胶的粘度-角频率曲线；其中，3％HA+Col为3％透明质酸修饰物水溶液与胶原丝交联形成的凝胶；5％HA+Col为5％透明质酸修饰物水溶液与胶原丝交联形成的凝胶；3％HA为3％透明质酸修饰物水溶液自身交联形成的凝胶；5％HA为5％透明质酸修饰物水溶液自身交联形成的凝胶；

图5为5％HA+Col水凝胶(a)、5％HA水凝胶(b)的显微图；

图6为水凝胶在SEM电镜下的视图，其中，(a)、(b)分别为放大2000、800倍视图下的5％HA+Col水凝胶；(c)为放大2000倍视图下的5％HA水凝胶；

图7为0-60min水溶胀实验数据；其中，3％HA+Col为3％透明质酸修饰物水溶液与胶原丝交联形成的凝胶；5％HA+Col为5％透明质酸修饰物水溶液与胶原丝交联形成的凝胶；3％HA为3％透明质酸修饰物水溶液自身交联形成的凝胶；5％HA为5％透明质酸修饰物水溶液自身交联形成的凝胶；

图8为凝胶在0-12h水溶胀实验结果。

具体实施方式(引用文献)

Ellman法检测胶原纺丝中的巯基含量参照论文：Xu G,Wang X,Deng C,etal.Injectable biodegradable hybrid hydrogels based on thiolated collagen andoligo(acryloyl carbonate)–poly(ethylene glycol)–oligo(acryloyl carbonate)copolymer for functional cardiac regeneration[J].Acta Biomaterialia,2015,15:55-64.公开的方法；

紫外吸光光度法测定多巴胺的取代度：参照论文：崔国廉,但年华,但卫华.基于多巴胺的黏合水凝胶的制备及表征[J].高等学校化学学报,2017,38(2):318-325.公开的方法；

Ellman法测HAD-SH中巯基的取代度：参照论文：Xu G,Wang X,Deng C,etal.Injectable biodegradable hybrid hydrogels based on thiolated collagen andoligo(acryloyl carbonate)–poly(ethylene glycol)–oligo(acryloyl carbonate)copolymer for functional cardiac regeneration[J].Acta Biomaterialia,2015,15:55-64.中公开的方法；

溶胀率计算参照论文：Chen J,Yuan J,Wu Y,et al.Fabrication of tough poly(ethylene glycol)/collagen double network hydrogels for tissue engineering[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A,2017,106(1):192.公开的方法；

溶胀率SR(％)由下式确定,其中W₀为水凝胶的初始冷冻干燥质量：W_t为吸水溶胀后的凝胶质量

实施例1胶原纤维的交联

将1g纺丝胶原纤维(M＝300KDa)以相同的排列取向固定在长方形塑料片上，浸于含50mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸的60％乙醇-水溶液中，室温下浸泡30min，加入14mmol/L的EDC和NHS，室温下反应12-24h，用95％乙醇清洗材料20-30min，重复三次，再分别用0.1mol/L的Na₂HPO₄和1mol/L的NaCl溶液清洗，用蒸馏水清洗数次，冻干，即得。

实施例2胶原纤维的巯基化

将实施例1交联后的胶原纤维浸泡在含有8mg/mL EDC和4.8mg/mL NHS的PBS缓冲溶液(pH＝7.5)中，搅拌反应30min后，加入终浓度为8mg/ml的半胱胺盐酸盐，氮气保护下于摇床中(100rpm)反应16-24h，然后将体系pH调至8.5，用终浓度为5mg/mL的二硫苏糖醇还原12h，反应结束后用大量清水清洗数次，冻干得到巯基化的胶原纤维Col-SH(如图1所示)。

纺丝胶原纤维上巯基的定量检测：为了定量胶原上巯基的取代度，首先建立了巯基的标准曲线，A＝1.9972C-0.0093，R²＝0.9989(A为吸光度；C为巯基的浓度(mmol/L))

采用Ellman检测方法，通过紫外分光光度计测得样品溶液吸光度A，通过计算得到胶原纤维上巯基的取代度，公式如下：

Mcol：胶原纤维的摩尔质量；

V：加入的Tris-HCL缓冲液的体积(L)；

X：胶原纤维的质量(g)；

检测结果显示，巯基取代度为16.5％。

实施例3透明质酸-多巴胺的合成

将HA(2.5g，200KDa)溶解在200mL脱气去离子水中，然后加入终浓度为12mg/mLEDC和7.2mg/mL NHS，搅拌30min后，再加入终浓度为12mg/mL的多巴胺盐酸盐，调节溶液pH在4-5之间，氮气保护下反应过夜。然后在酸性条件下(pH＝5-7)透析纯化四天，冷冻干燥，得到白色蓬松的固体透明质酸-多巴胺复合物(HAD)，储存于-20℃待用。

透明质酸上多巴胺的取代度测定：采用紫外分光光度法定量检测透明质酸上多巴胺的取代度。首先对透明质酸-多巴胺进行全波长范围扫描，结果显示在280nm处有最大吸收，所以选取280nm为检测波长。建立了多巴胺的标准曲线A＝19.244C-0.1114，R²＝0.9996(A为吸光度，C为多巴胺的浓度(mg/mL))

测得样品的吸光度A，通过计算得到透明质酸上多巴胺的取代度，公式如下：

M：透明质酸的摩尔质量；

V：溶解透明质酸的溶液体积(L)；

X：冻干透明质酸的质量(g)；

M1：多巴胺的摩尔质量；

检测结果为，多巴胺的取代度为19.4％。

实施例4HAD复合物的巯基化

将实施例3制备的HAD(2.5g，200KDa)溶解在200mL去离子水中。然后将终浓度12mg/mL EDC和7.2mg/mL NHS缓慢加入到去离子水中，调节溶液pH为5.5，在室温下避光搅拌45min。然后将11mg/mL半胱胺盐酸盐加入反应体系中，室温下避光搅拌4h。依次以pH5.0HC1溶液、含1％(w/v)NaCl的溶液和pH 5.0HCl溶液避光透析3天，冷冻干燥，得到巯基化的HAD(HAD-SH)。

采用Ellman定量检测HAD-SH中巯基的取代度，先对HAD-SH进行了全波长范围的扫描，在410nm处有最大吸收，选择410nm为检测波长。利用标准曲线法，首先建立巯基的标准曲线A＝1.9972C-0.0093，R²＝0.9989(A为吸光度，C为巯基的浓度(mmol/L))

检测样品的吸光度A，通过计算得到HAD复合物上巯基的取代度，公式如下：

M：透明质酸的摩尔质量；

V：溶解透明质酸的溶液体积(L)；

X：冻干透明质酸的质量(g)；

检测结果为巯基取代度为9.8％。

实施例5HA-Col凝胶的制备

取适量冻干的HAD-SH溶解于水，配置成质量分数为3％和5％(g/100mL)的溶液备用。剪取30mg实施例2制备的胶原纤维(Col-SH)平铺在方形模具(2.5×2.5cm)中，取上述HAD-SH溶液1g倒入方形模具中，再加入150-200μL的PEGDA交联剂，充分交联形成凝胶(如图2所示)，冻干备用。

实施例6HA凝胶的制备

参照实施例5的方式制备单纯的HA凝胶，区别在于，不添加胶原纤维。

实施例7不同凝胶的性能检测

凝胶流变测试：将凝胶制备成边长10mm，高1-2mm的正方形薄片，充分溶胀，用旋转流变仪进行应变扫描，选择合适的线性范围，确定扫描应变。再在剪切模式下进行动态频率扫描，扫描范围为0.1～100rad/s，所有测试均在常温条件下进行。

如图3可知，湿态凝胶在0.1-100rad/s范围内，储存模量(G’)始终比损耗模量(G”)大一个数量级，并且没有频率依赖性，说明凝胶内部结构稳定，以弹性为主，弹性模量高于1KPa。胶原纤维-透明质酸交联复合材料凝胶的储存模量(G’)比单纯HA材料凝胶高2-3倍，显示加入胶原纤维后凝胶的弹性变大，固体性质更明显；不同浓度的HA对凝胶的粘弹性有显著影响，5％HA+Col的G’约高于3％HA+Col 2-3倍，单纯的HA凝胶也表现出相同趋势。以上结果表明胶原纤维的加入有助于提高凝胶的弹性和强度，HA浓度增大凝胶的弹性增强。另外，如图4，在0.1-100rad/s范围内，凝胶的粘度趋势为5％HA+Col＞3％HA+Col＞5％HA＞3％HA，说明Col的加入能够提高凝胶的粘度，且HA浓度越大，粘性越强。

在40×10放大倍数的显微镜下，5％HA+Col凝胶、5％HA凝胶冷冻干燥后的形貌如图5所示。含有纺丝胶原纤维的HA+Col凝胶中纤维有序排列，凝胶内部交联均匀且致密；未含纺丝胶原纤维的HA凝胶具有多孔隙，表面凹凸不平；单纯的HA凝胶中，巯基化的HA与PEGDA双键反应形成交联的网络结构。与加入纺丝胶原纤维的水凝胶相比，单纯的HA凝胶中没有胶原纤维作为骨架支撑。

对获得的仿生凝胶进行结构形貌的研究，如图6所示，由SEM电镜图可知，纺丝胶原纤维与透明质酸之间发生交联，且两项分布均匀。透明质酸具有褶皱型的网状结构，纺丝胶原纤维分散其中如条状骨架，HA+Col复合凝胶具有致密的网络结构和纤维骨架。而HA凝胶仅有褶皱型的网状结构。

对制备获得的仿生凝胶的溶胀性能进行测试：在室温下，将3％HA+Col、5％HA+Col、3％HA、5％HA四组水凝胶分别浸入pH＝7.4的PBS中，在规定时间内(1min、5min、10min、15min、30min、60min、1h、3h、6h、12h)检测凝胶的重量W_t。结果如图7所示，四组水凝胶中，由3％HA与5％HA形成的水凝胶在60min之内溶胀率上升较快，其中3％HA水凝胶的溶胀率最大达到521％，5％HA的溶胀率最大达到238％，相比较，3％HA+Col溶胀率最大达到189％，5％HA+Col溶胀率最大达到185％。

如图8，在含有胶原纤维的两组水凝胶中，由3％HA+Col形成的水凝胶与5％HA+Col形成的水凝胶溶胀率的发展趋势基本一致。在50min内，溶胀率上升较快，50min后，溶胀率上升变慢，趋于平缓。不含纺丝胶原纤维的水凝胶在12小时内已经完全溶胀，并伴随着交联的松解，出现分解为小块而溶于水中的现象，而加入了胶原纤维的水凝胶依然维持着较稳定的溶胀率，结构完整。

对比例1

具体实施方式同实施例2，区别在于，胶原纤维在5‰的戊二醛的乙醇溶液中避光交联5h，然后以水溶液为介质进行巯基化，制备获得巯基含量为1.26％的胶原纤维(Col-SH)，与实施例2制备的Col-SH相比，巯基化程度低，交联成凝胶的速度较慢。

对比例2

具体实施方式同实施例3，区别在于，多巴胺的用量为6mg/mL，制备获得的HAD中多巴胺取代度仅8.9％，制备获得的凝胶粘附性不佳。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备仿生凝胶的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将有序排列的纺丝胶原纤维进行化学交联；(2)将交联后的纺丝胶原纤维巯基化；(3)采用多巴胺修饰透明质酸，对修饰后的透明质酸进行巯基化；(4)将巯基化的纺丝胶原和透明质酸交联，得到以胶原和透明质酸修饰物为基材的具有粘附性的仿生凝胶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纺丝胶原纤维是通过湿法纺丝技术得到的，所述湿法纺丝具体是：制备胶原原液，将原液从喷丝孔中压出形成细流，原液细流通过凝固浴后形成纺丝纤维，纤维卷装后进行清洗、消毒和干燥。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂包括但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇酯或三聚氰酸三烯丙酯。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巯基化试剂包括但不限于半胱胺盐酸盐或3，3-二巯基二丙酸酰肼。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纺丝胶原在巯基化之前，在含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NSH)的乙醇-水溶液中交联。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述巯基化是采用L-半胱胺盐酸盐，在pH5～6，20～25℃，氮气保护条件下进行巯基化，再加入二硫苏糖醇在pH 8～9进行还原。

7.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将纺丝胶原纤维上的羧基活化后，与L-半胱胺盐酸盐上的氨基反应，使胶原纤维被修饰上巯基；将多巴胺、L-半胱胺盐酸盐通过化学键分别连接到HA上；采用聚乙二醇二丙烯酸酯作为交联剂与巯基反应，将胶原与透明质酸相连。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：

(1)将纺丝胶原浸入含有EDC/NHS的乙醇-水溶液中室温避光反应15～24h，然后取出胶原丝反复用乙醇和水冲洗数次；

(2)将步骤(1)制备的纺丝胶原与终浓度2～8mg/mL半胱胺盐酸盐在氮气保护下反应15～20h，调节反应溶液pH至8～9，加入终浓度4～8mg/mL的二硫苏糖醇，反应过夜，获得巯基化的纺丝胶原；

(3)将HA与多巴胺按摩尔比1:1、1:2或1:3的比例混合，在pH4～5的环境中，在氮气保护下反应过夜，再于pH5～7的环境中透析纯化3～4天，获得透明质酸-多巴胺复合物；

(4)将透明质酸-多巴胺复合物浸泡于pH5～6、终浓度为10～15mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液中，室温下避光搅拌4～8h；依次于pH 4～5的HC1溶液、NaCl溶液和pH 5～6的HCl溶液避光透析3～4天，冷冻干燥。

9.应用权利要求1～8任一方法制备的纺丝胶原-透明质酸仿生凝胶。

10.权利要求9所述的仿生凝胶在医药领域制备产品方面的应用。