CN105617459A - 一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，步骤如下：将吡咯单体和引发剂滴入乳化剂水溶液中反应，加入丙酮终止反应并洗去引发剂和乳化剂，离心分离出沉淀物纳米聚吡咯；将纳米聚吡咯和壳聚糖分别溶于乙酸中制成纳米聚吡咯乙酸悬浮液和壳聚糖乙酸悬浮液，混合搅拌得到混合悬浮液，注入金属模具中，冻干成形得到半固体凝胶，再与氢氧化钠水溶液中和成形，干燥即得纳米聚吡咯壳聚糖神经导管；将纳米聚吡咯壳聚糖神经导管浸入醋酐甲醇溶液中反应，再浸入氢氧化钠溶液中，再用京尼平交联，接着用双蒸水冲洗，再脱水，干燥即得纳米聚吡咯甲壳素神经导管。本发明制备得到的纳米聚吡咯甲壳素神经导管具备良好的导电性以及可控降解性。

Description

一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法。

背景技术

周围神经缺损的修复是临床治疗的难题之一。目前，公认的最佳治疗方法是自体神经移植修复，这种“拆东墙补西墙”式的手术存在着移植供体来源有限、移植神经直径与受体神经不一致、供区永久性失神经功能障碍、神经瘤形成等诸多弊端。因此，寻找不损害自身、可随缺损长度及粗细裁剪、疗效肯定的自体神经移植替代品便成为基础和临床工作者不断追求的目标。

近年来，随着组织工程学的出现和发展，研制组织工程神经作为神经移植的替代物，已成为神经缺损修复的一个重要研究领域。组织工程的三要素是支架、种子细胞和因子，而构建组织工程神经的材料支架统称为人工神经移植物。早期，人们尝试的人工神经移植物材料以血管、硅胶、聚吡咯、聚四氟乙烯等为主，近来，人们试用于周围神经组织工程的材料以可降解高分子聚合物为主，因其较为明显的可降解优势，因而成为研究焦点，研究较多的主要有胶原、甲壳素、壳聚糖、丝素蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸等。尽管不少材料都显示出了一定程度的对神经缺损的修复作用，有些已经少量成功试用于临床，甚至商品化生产(如用聚乙醇酸制成的Neurotube®；Ⅰ型胶原制成的NeuraGen® )，但到目前为止，尚没有一种人工神经移植物能够得到公认、获得满意临床效果并在临床上广泛应用，说明还都存在着各自不同的缺点。

在组织工程神经蓬勃发展的同时，近年来，术中低频电刺激在神经再生及功能恢复中的作用越来越引起研究者的重视，有学者甚至乐观的认为低频电刺激将成为神经损伤修复领域的令人兴奋的新途径。低频电刺激促进神经再生的作用已被不少研究者在动物神经挤压、横断、缺损模型中得到较好的证实。报道显示，低频电刺激对运动、感觉神经元轴突的再生速度及其再支配靶器官的准确性都有较明显的促进作用；促进再生神经功能的早期恢复；Gordon等还将低频电刺激引入腕管综合征松解手术中，观察到低频电刺激对受压较严重病例的再生神经的传导速度、靶肌肉接受再支配等有较明显的促进作用。

进一步研究发现，上述低频电刺激所表现出的“令人兴奋”的促神经再生作用主要通过以下途径发挥其对神经损伤的促进作用：（1）唤醒更多的神经元启动再生，提高再生率；（2）激活胞内腺苷酸环化酶/cAMP-依赖性蛋白激酶系统，促进损伤神经胞体早期表达系列内源性神经营养因子，早期启动神经再生，缩短整体再生时间；（3）影响电刺激位置(损伤近端)附近非神经细胞，有可能通过促进施万细胞的增值、转型，提供即便是手术或人工导管等人为干预都难以很好解决的轴突延伸定向诱导支持，或促进有PSA表达能力的运动神经元中PSA的高表达，增强定向诱导，提高靶器官支配的精确性等途径，发挥低频电刺激对外周神经再生和功能恢复的积极作用。

当然，在较长距离缺损模型的修复中必然要用到神经移植物，Ahlborn等用的是聚乙烯管，Haastert-Talini等用的是硅胶管，国内学者Huang等用的是聚吡咯/壳聚糖，都得出在使用移植物桥接的基础上引入电刺激比单纯使用神经移植物桥接具有较明显的优势，且移植物中引入导电材料比单纯的非导电材料在电刺激作用下表现出更好的神经再生现象。

综合比较分析前述人工神经移植物材料，甲壳素、壳聚糖相对可能是较为理想的组织工程材料。壳聚糖为甲壳素脱乙酰基所得，溶解性明显高于天然甲壳素，较易加工成形，也已被研究用于制作多种医学生物材料。但是，目前成型的壳聚糖组织工程材料的机械性能较差，尤其是遇到血液后更加明显，另外，壳聚糖的降解速度仍有待进一步提高。

甲壳素为含有氨基多糖的高分子化合物，是地球上仅次于植物纤维素的第二大天然生物资源。作为一种新型天然医用高分子材料,其良好的生物相容性和生物可降解性，使甲壳素在人工皮肤、骨修复材料、创伤敷料、手术缝线和抗凝血材料等方面有广泛应用，其作为组织工程神经支架材料的可行性也已得到初步证实研究表明，与壳聚糖相比，甲壳素有如下几点优势：（1）甲壳素降解速度明显快于壳聚糖。甲壳素在体内可被溶菌酶降解，亦可被脱氨基酶降解，降解成葡萄糖，而被机体吸收。同时，植入体内的甲壳素还可吸引单核细胞将自身吞噬，逐渐解体；（2）甲壳素无毒性、刺激性和免疫原性低，致炎反应也低于壳聚糖；与壳聚糖以及其他高分子材料相比，甲壳素另一个显著的特点在于其能促进肌细胞再生，抑制成纤维细胞的生长，防止瘢痕形成。

但是，天然甲壳素溶解性差，不易加工处理。另外，无论是传统工艺还是近年来提出的浓度递减、分步浸酸浸碱、循环浸酸以及脱蛋白质交叉等新的制备工艺都很难清除原来与甲壳素共存的蛋白质，而当这类含有蛋白质的组织工程材料进入机体后，就必然会引起炎症细胞聚集，导致移植部位发生炎症反应。相比而言，壳聚糖去除共存蛋白质较方便，共存蛋白含量会明显降低。据文献报道，通过壳聚糖选择性乙酰化而成的甲壳素，其力学强度、纯度均得到提高，更重要的是由成形的壳聚糖管乙酰化而成甲壳素管，在制作工艺上，更易加工处理。

目前所研究的可降解材料导电性能皆较差，而导电的材料如聚吡咯、聚四氟乙烯一类的高分子聚合材料，之所以没能成为理想的组织工程神经支架材料，生物降解困难或许是主要原因之一。近来研究认为：（1）纳米技术能显著提高材料的性能，具有独特的效应，如：小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等，对聚吡咯而言，近年来，科研工作者业已开拓了一系列新型合成方法以制备具有不同纳/微米结构的聚吡咯，研究还提示改变聚吡咯的尺寸或通过合成既有共轭结构又有酯键的高聚物有望实现导电高聚物的降解性；（2）导电聚合物材料的表面功能化修饰可以进一步提高导电聚合物的生物降解性、提高其电学和机械性能，有效控制生物活性分子的运动、浓度和形貌。如将导电聚合物与可生物降解的材料偶联或混杂，引入生物分子、化学基团掺杂等，皆可以有效的提高导电聚合物材料的生物降解性。

鉴于以上所述，以及对导电材料聚吡咯、天然可降解高分子聚合物壳聚糖、甲壳素的研究，构建一种新型人工神经移植物—壳聚糖乙酰化甲壳素/纳米聚吡咯复合材料神经导管，以便将来移植应用时能进一步利用低频电刺激发挥其促进神经再生变成可能。

发明内容

解决的技术问题：针对现有的可降解材料导电性能皆较差，导电材料生物降解困难等缺点，本发明提供一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，制备得到的纳米聚吡咯甲壳素神经导管具备良好的导电性以及可控降解性。

技术方案：一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，该方法的制备步骤如下：

（1）纳米聚吡咯的制备：先将乳化剂溶于水中制成乳化剂水溶液，再把吡咯单体和引发剂滴入乳化剂水溶液中，聚合反应24h，加入丙酮终止反应并用去离子水洗去引发剂和乳化剂，接着离心，分离出沉淀物，即为纳米聚吡咯；

（2）纳米聚吡咯壳聚糖神经导管的制备：将（1）制备的纳米聚吡咯溶于乙酸中制成纳米聚吡咯乙酸悬浮液，将壳聚糖溶于乙酸中制成壳聚糖乙酸悬浮液，在60℃下将纳米聚吡咯乙酸悬浮液、壳聚糖乙酸悬浮液混合，搅拌5h，得到混合悬浮液，将混合悬浮液注入金属模具中，冻干成形后，从模具中退出半固体凝胶，再与浓度为5%的氢氧化钠水溶液中和成形，接着在室温下干燥即得纳米聚吡咯壳聚糖神经导管；

（3）纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备：将（2）制备的纳米聚吡咯壳聚糖神经导管浸入浓度为5%的醋酐甲醇溶液中，在室温下进行乙酰化反应4h，再浸入浓度为10%的氢氧化钠溶液中过夜，再用京尼平交联24h，接着用双蒸水冲洗，再脱水，室温干燥24h即得纳米聚吡咯甲壳素神经导管。

上述所述的步骤（1）中的乳化剂为十二烷基苯磺酸，引发剂为三氯化铁。

上述所述的步骤（1）中乳化剂与水的混合比例为40%w/v，吡咯单体、引发剂、乳化剂的摩尔比为1: 3.75: 3.75。

上述所述的步骤（1）中离心的转速为8000rpm。

上述所述的步骤（2）中纳米聚吡咯与乙酸的混合比例为0.5% v/v，壳聚糖与乙酸的混合比例为1% v/v，混合悬浮液中纳米聚吡咯与壳聚糖的重量比为1: 39。

有益效果：本发明提供的一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，具有以下有益效果：

1.本发明的制备方法采用壳聚糖乙酰化制备甲壳素，经过体外实验，生物相容性良好，制成的纳米聚吡咯甲壳素神经导管桥接大鼠坐骨神经缺损，能发挥较好的促神经再生的效果；

2.本发明制备得到的纳米聚吡咯甲壳素神经导管具有良好的生物相容性、可控降解性、良好的可塑性及生物安全性，又具备良好的导电性，并且可通过低频电刺激促进神经再生。

具体实施方式

以下实施例中所使用的吡咯单体、京尼平购自Sigma-Aldrich公司，壳聚糖购自sigma公司，十二烷基苯磺酸购自Aldrich Chemical公司，三氯化铁、丙酮、乙酸、氢氧化钠、醋酐、甲醇购自江苏强盛化工有限公司。

实施例 1

本实施例提供一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，该方法的制备步骤如下：

（1）纳米聚吡咯的制备：先将8g十二烷基苯磺酸溶于20ml去离子水中制成十二烷基苯磺酸水溶液，0.98g三氯化铁滴入十二烷基苯磺酸水溶液中，搅拌成半透明的微乳液系统，将110微升吡咯单体搅拌加入制成的微乳液中，室温下，聚合反应24h，加入丙酮终止反应并用去离子水洗去十二烷基苯磺酸和三氯化铁，接着在转速为8000rpm下离心，分离出沉淀物，即为纳米聚吡咯；

（2）纳米聚吡咯壳聚糖神经导管的制备：将（1）制备的纳米聚吡咯溶于乙酸中制成纳米聚吡咯乙酸悬浮液，将壳聚糖溶于乙酸中制成壳聚糖乙酸悬浮液，在60℃下将纳米聚吡咯乙酸悬浮液、壳聚糖乙酸悬浮液混合，搅拌5h，得到混合悬浮液，将混合悬浮液注入金属模具中，冻干成形后，从模具中退出半固体凝胶，再与浓度为5%的氢氧化钠水溶液中和成形，接着在室温下干燥即得纳米聚吡咯壳聚糖神经导管，其中纳米聚吡咯与乙酸的混合比例为0.5% v/v，壳聚糖与乙酸的混合比例为1% v/v，混合悬浮液中纳米聚吡咯与壳聚糖的重量比为1: 39；

（3）纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备：将（2）制备的纳米聚吡咯壳聚糖神经导管浸入浓度为5%的醋酐甲醇溶液中，在室温下进行乙酰化反应4h，再浸入浓度为10%的氢氧化钠溶液中过夜，再用京尼平交联24h，接着用双蒸水冲洗，再脱水，室温干燥24h即得纳米聚吡咯甲壳素神经导管。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (5)

1.一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，其特征在于该方法的制备步骤如下：

（1）纳米聚吡咯的制备：先将乳化剂溶于水中制成乳化剂水溶液，再把吡咯单体和引发剂滴入乳化剂水溶液中，聚合反应24h，加入丙酮终止反应并用去离子水洗去引发剂和乳化剂，接着离心，分离出沉淀物，即为纳米聚吡咯；

（2）纳米聚吡咯壳聚糖神经导管的制备：将（1）制备的纳米聚吡咯溶于乙酸中制成纳米聚吡咯乙酸悬浮液，将壳聚糖溶于乙酸中制成壳聚糖乙酸悬浮液，在60℃下将纳米聚吡咯乙酸悬浮液、壳聚糖乙酸悬浮液混合，搅拌5h，得到混合悬浮液，将混合悬浮液注入金属模具中，冻干成形后，从模具中退出半固体凝胶，再与浓度为5%的氢氧化钠水溶液中和成形，接着在室温下干燥即得纳米聚吡咯壳聚糖神经导管；

（3）纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备：将（2）制备的纳米聚吡咯壳聚糖神经导管浸入浓度为5%的醋酐甲醇溶液中，在室温下进行乙酰化反应4h，再浸入浓度为10%的氢氧化钠溶液中过夜，再用京尼平交联24h，接着用双蒸水冲洗，再脱水，室温干燥24h即得纳米聚吡咯甲壳素神经导管。

2. 根据权利要求1所述的一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的乳化剂为十二烷基苯磺酸，引发剂为三氯化铁。

3. 根据权利要求1所述的一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中乳化剂与水的混合比例为40%w/v，吡咯单体、引发剂、乳化剂的摩尔比为1: 3.75: 15.45。

4. 根据权利要求1所述的一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中离心的转速为8000rpm。

5. 根据权利要求1所述的一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中纳米聚吡咯与乙酸的混合比例为0.5% v/v，壳聚糖与乙酸的混合比例为1% v/v，混合悬浮液中纳米聚吡咯与壳聚糖的重量比为1: 39。