CN112402689A - 一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统及其制备方法。该导电神经修复系统包括双载药同轴纳米纤维和中空的聚吡咯/聚乳酸神经导管，其中：所述双载药同轴纳米纤维填充于所述聚吡咯/聚乳酸神经导管内；所述聚吡咯/聚乳酸神经导管中，聚吡咯纳米球均匀分散在聚乳酸中；所述双载药同轴纳米纤维中，以聚乳酸/血管内皮生长因子为壳层，以壳聚糖/芍药苷为芯层。首先制备聚吡咯/聚乳酸薄膜，卷曲成管得聚吡咯/聚乳酸神经导管；然后通过同轴静电纺丝技术得双载药同轴纳米纤维，并将其填充于神经导管中即可。制备方法简单，可操作性强，得到的导电神经修复系统具备优异的生物相容性、机械性能、降解性能和导电性能，应用前景广。

Description

一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统及其制备方法。
背景技术
周围神经分布在人体全身表面，很容易受到伤害。周围神经损伤(PeripheralNerve Injury，PNI)一般不会威胁病人的生命安全，但若不及时采取合适的救治措施，损伤神经远端会形成神经瘤或疤痕组织，阻碍神经再生，导致神经通道中断，引发各种有害后果，如感觉丧失、慢性疼痛、残疾、畸形等，严重影响患者的正常生活和身心健康。损伤的周围神经再生能力有限，尤其当缺损长度大于5mm时，轴突生长难以跨越损伤间隙，神经无法修复。一直以来，自体神经移植被认为是治疗PNI的金标准，但自体神经移植存在供区部位发病、供应有限、二次手术、神经大小不匹配等问题，并且，经自体移植术后，神经功能恢复成功率仅为50％。随着组织工程学领域的进步，采用组织工程学的方法构建神经修复导管成为PNI修复的重要方法之一。
神经导管常用的制备方法包括浇铸成型法、溶液浸渍法、熔融挤出法、铺膜法和静电纺丝法等。铺膜法操作简单，导管大小均一，是实验室制备神经导管的常用方法。静电纺丝技术制备的纤维具有纳米级尺寸，比表面积高，孔隙率大，可模仿天然细胞外基质的结构，而且，电纺是在常温常压下进行的，可以在加工过程中保持生长因子的活性，在神经组织基体修复中取得了良好的效果。
制备神经导管支架常用的材料可分为四类：天然生物材料、合成的不可降解类材料、合成的可降解类材料、由两种或两种以上的不同类型材料组合而成的复合材料等。壳聚糖(Chitosan，CS)是一种天然生物材料，为目前已知的唯一带有正电荷的碱性多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、固有的抗菌性，能支持雪旺细胞的黏附与生长，还能抑制成纤维细胞的生长和瘢痕的形成，并促进内皮细胞的生长。聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种合成的可降解类材料，其无毒、可塑性强、机械性能和生物相容性良好，但降解速率较慢，且降解产物呈酸性，易引发周围组织炎症，一般需要复合其他材料。
功能性电刺激(Functional Electrical Stimulation,FES)在神经功能失调治疗和神经损伤康复中具有重要的作用。电刺激能增强神经细胞的增殖分化能力，促进干细胞向神经元分化，且神经细胞能对电刺激做出直接的反应。电刺激在损伤轴突的修复中扮演重要角色，能促进轴突的再生，隧桥以及突触的形成。将导电高分子材料应用在神经导管中能够帮助神经恢复电刺激性，促进神经再生。聚吡咯(Polypyrrole，PPy)具有良好的导电性能、化学稳定性和生物相容性，在神经修复方面被广泛研究。聚吡咯在人体内无法降解，限制了其在组织工程中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统及其制备方法，该神经损伤修复系统不仅具备优异的生物相容性、机械性能、降解性能和导电性能，内部取向型双载药纳米纤维还能为神经再生提供正确的方向引导，同时双载药的梯度释放又能对神经再生的不同阶段产生促进作用，保证了周围神经再生的速度和质量。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
提供一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统，包括双载药同轴纳米纤维和中空的聚吡咯/聚乳酸神经导管，其中：
所述双载药同轴纳米纤维填充于所述聚吡咯/聚乳酸神经导管内；
所述聚吡咯/聚乳酸神经导管以聚乳酸为基础材料，掺入聚吡咯纳米球，所述聚吡咯纳米球均匀分散在所述聚乳酸中；
所述双载药同轴纳米纤维中，以聚乳酸/血管内皮生长因子为壳层，以壳聚糖/芍药苷为芯层。
按上述方案，所述聚吡咯/聚乳酸神经导管内径为1.5-3mm，外径为2.5-4mm；所述双载药同轴纳米纤维直径为950-1700nm。
按上述方案，聚吡咯纳米球通过在吡咯单体中加入十二烷基硫酸钠(SDS)作为软模板剂，以FeCl3为氧化剂制备得到。
按上述方案，所述聚吡咯/聚乳酸神经导管中，聚吡咯纳米球和聚乳酸质量比为0.03-0.15：1，所述双载药同轴纳米纤维，壳层中血管内皮生长因子和聚乳酸质量比为10-7-10-6：1，芯层中芍药苷和壳聚糖质量比为1：5-10。
按上述方案，所述双载药同轴纳米纤维通过同轴静电纺丝技术制备得到，其中含有聚乳酸和血管内皮生长因子的溶液作为壳层纺丝溶液，含有壳聚糖和芍药苷的溶液作为芯层纺丝溶液。
按上述方案，所述聚乳酸分子量为10～20万，所述壳聚糖粘度为200～400mpa·s。
提供一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备方法，包括以下步骤：
1)聚吡咯/聚乳酸神经导管的制备：取聚乳酸溶于溶剂中得聚乳酸溶液，将聚吡咯纳米球分散在聚乳酸溶液中，搅拌后超声，然后转移至模板中，静置，形成聚吡咯/聚乳酸膜，卷曲成管，即得聚吡咯/聚乳酸神经导管；
2)双载药同轴纳米纤维的制备：将聚乳酸和血管内皮生长因子溶于溶剂中，作为壳层纺丝溶液，将壳聚糖和芍药苷溶于溶剂中，作为芯层纺丝溶液，进行同轴静电纺丝得到双载药同轴纳米纤维；
3)填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备：将步骤2)得到的双载药同轴纳米纤维填充进步骤1)所得的聚吡咯/聚乳酸神经导管中，即得到填充双载药纳米纤维导电神经修复系统。
按上述方案，所述步骤1)中，聚吡咯纳米球制备为：将吡咯(Py)单体加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，搅拌，再加入FeCl3溶液，0-20℃恒温反应8-15h，后处理即得聚吡咯纳米球，其中FeCl3与Py单体摩尔比为0.6-1.2：1，SDS与Py单体摩尔比为0.3-1：1。
按上述方案，所述步骤1)中所述分散聚吡咯搅拌时间为20-40min，超声时间为20-30min。
按上述方案，所述步骤1)中，所述模板为聚四氟乙烯模板。
按上述方案，所述步骤1)中，所述聚吡咯纳米球和聚乳酸质量比为0.03-0.15：1。
按上述方案，所述步骤2)中，聚乳酸和血管内皮生长因子质量比为10-7-10-6：1；芍药苷和壳聚糖质量比为1：5-10。
按上述方案，所述步骤2)中，所述壳层纺丝溶液的溶剂为二氯甲烷；所述芯层纺丝溶液的溶剂为质量分数为1-3％的乙酸溶液。
按上述方案，所述步骤2)中，同轴静电纺丝参数为：芯层纺丝液以0.1-0.2mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.3-0.6mm/min的速度推出，芯层与壳层速率之比保持在1：2-3.5之间，同轴针管与接收板之间施加电压为16-25KV，接收距离为9-15cm，环境温度为20-25℃，相对湿度为25-40％。
血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，能在神经再生过程中起良好的带动和促进作用。芍药苷(Peoniflorin，PF)是白芍、赤芍和牡丹的主要有效成分，具有抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗应激、镇痛、抗肿瘤、抗凋亡、保肝、保护神经、调节免疫、镇静催眠等多种药理作用，在神经保护方面，研究证明，芍药苷对神经元和神经细胞损伤具有明显的保护作用。
本发明提供的周围神经修复系统具有双重结构，包括内部的双载药同轴纳米纤维和外部中空的聚吡咯/聚乳酸神经导管。外部管状结构为神经再生提供了稳定的三维立体结构，同时聚吡咯(PPy)以纳米球的形式均匀分散在聚乳酸(PLA)中，导电性和分散性好，既减少了PPy的用量，又保证了导管适宜的导电性和生物相容性，于此同时，还延长了神经导管导电性的持续时间，有助于神经损伤的修复。内部的双载药同轴纳米纤维为取向型纳米纤维，利于细胞的粘附及生长，并引导轴突沿着纤维方向生长，为神经再生提供正确的方向引导；此外同轴纳米纤维中在壳层负载VEGF，芯层负载PF，因内外位置不同壳层药物比芯层药物释放快，实现了两种药物VEGF和PF的缓慢释放和梯度释放，较快释放的VEGF能在神经修复前期促进微血管的生长，为神经再生提供充足的营养物质支持，而较慢释放的PF，能在神经修复过程中持续促进雪旺细胞的增殖，实现了两种药物对神经再生的协同作用，大大促进神经损伤的修复。
相对于现有效果，本发明的有益效果如下：
1.本发明提供的导电神经修复系统，设计了双重结构，包括内部的双载药同轴纳米纤维和外部中空的聚吡咯/聚乳酸神经导管；外部神经导管提供了稳定的三维结构，且PPy以纳米球的形式存在于神经导管中，既减少了PPy的用量，又保证了导管适宜的导电性和生物相容性，还延长了神经导管导电性的持续时间，有助于神经损伤的修复；而内部取向型双载药纳米纤维还能为神经再生提供正确的方向引导，同时同轴纳米纤维将VEGF置于壳层，PF置于芯层，实现了两种药物的缓慢释放和梯度释放以及两种药物对促进神经再生的协同作用，大大提高了神经修复的速率。
2.本发明通过得到聚吡咯/聚乳酸薄膜，卷曲成管，即得聚吡咯/聚乳酸神经导管；然后通过同轴静电纺丝技术，得到VEGF负载于壳层，PF负载于芯层的双载药同轴纳米纤维，然后将双载药同轴纳米纤维填充于聚吡咯/聚乳酸神经导管中即得导电神经修复系统，制备方法简单，可操作性强，制备得到的导电神经修复系统具备优异的生物相容性、机械性能、降解性能和导电性能，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备流程示意图。
图2为PPy和实施例1制备得到的PPy纳米球的红外图谱。
图3为实施例1制备得到的PPy/PLA膜材(A和B)及导管横视图(C)、纵视图(D)。
图4为实施例1制备得到的PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维扫描电镜(SEM)图。
图5为对照组PLA(VEGF)纳米纤维组和PLA(PF)纳米纤维组与实施例1制备得到的PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维组在56天内的药物累计释放率。
图6为空白组、PLA膜、PLA/PPy膜、PLA/PPy膜+PLA/CS同轴纳米纤维和实施例1制备得到的PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维与RSC96细胞共培养1，3，5天后CCK-8实验结果。
图7为空白组、PLA膜、PLA/PPy膜、PLA/PPy膜+PLA/CS同轴纳米纤维和实施例1制备得到的PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维与PC12细胞共培养1，3，5天后CCK-8实验结果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
如图1所示，本发明提供一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备方法，包括以下步骤：
1)PPy纳米球的制备
称取2.49g十二烷基硫酸钠(SDS)溶于140mL去离子水中，搅拌30min，然后将2mL经过两次减压蒸馏的吡咯(Py)单体加入SDS溶液中，搅拌1h，称取8.58g FeCl3溶于40mL去离子水中，搅拌30min。将FeCl3溶液加入SDS溶液中，恒温10℃反应10h，滤出固态产物，用去离子水清洗，置于60℃真空干燥箱中干燥24h，得到黑色粉末聚吡咯(PPy)纳米球。
2)PPy/PLA神经导管的制备
取1g分子量为15万的聚乳酸(PLA)溶解在10mL二氯甲烷中，搅拌1h直至PLA完全溶解后，称取0.06g PPy纳米球分散在PLA溶液中，搅拌30min后超声30min并重复3次。将混合液转移到聚四氟乙烯模板中，静置，形成PPy/PLA膜，用自制模具卷曲成管，即得PPy/PLA神经导管。
3)双载药同轴纳米纤维的制备
将1g分子量为15万的PLA和0.001mg血管内皮生长因子(VEGF)粉末溶于10mL二氯甲烷中，作为壳层纺丝溶液。将0.5g粘度为200-400mpa·s壳聚糖(CS)和0.1g芍药苷(PF)溶于10mL质量分数为1.5wt％乙酸溶液中，作为芯层纺丝溶液。将芯层和壳层溶液分别置于5mL一次性注射器中，连接好同轴实验装置后，设置芯层溶液以0.15mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.4mm/min的速度推出，同轴针管与接收板之间电压为21KV，接收距离为12cm，环境温度为25℃，相对湿度为30％，进行同轴静电纺丝，即得双载药同轴纳米纤维，记为PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维。
4)填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备
将步骤3)所得的双载药同轴纳米纤维填充进步骤1)所得的PPy/PLA神经导管中，即得到填充双载药纳米纤维导电神经修复系统，记为PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维。
图2为PPy和本实施例步骤1)制备得到的PPy纳米球的红外图谱。图中显示：PPy红外谱图中特征峰3441.95cm-1来自于典型的-N-H-伸缩振动，特征峰1545.37cm-1来自于吡咯环-C-C-的伸缩振动。特征峰1040.35cm-1来自于吡咯单元-C-H-的平面变形振动，特征峰1638.86cm-1来自于吡咯-C-N-的伸缩振动。而在PPy纳米球红外谱图中，相应特征峰都存在，证实了所得产物为导电聚合物PPy。
图3为本实施例步骤2)制备得到的PPy/PLA膜材(A和B)及导管横视图(C)、纵视图(D)，图中显示：神经导管长为12mm、内径为3mm、外径为4mm。
图4为本实施例步骤3)制备得到的PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维SEM图。由SEM图可知，制备的取向型双载药同轴纳米纤维平均直径为1372nm，粗细均匀，方向一致，能够为神经再生提供良好的方向引导和物质支持。
PLA分别负载VEGF或PF得到对应的静电纺丝纳米纤维，作为对照组，分别记为PLA(VEGF)纳米纤维组和PLA(PF)纳米纤维组，与本实施例制备得到的PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维组一起进行测试(对照组与实施例中的药物载药量一致)，得到56天内的药物累计释放率，试验结果如图5所示，结果表明：在同轴纳米纤维中，VEGF的释放速率比PLA(VEGF)纳米纤维组要快，而由于外壳的包裹作用，内芯的PF比PLA(PF)纳米纤维组在前期释放慢。较快释放的VEGF能在神经修复前期促进微血管的生长，为神经再生提供充足的营养物质，而较慢释放的PF，能在神经修复过程中持续促进雪旺细胞的增殖，实现了两种药物对神经再生的协同作用。
分别设置空白组、PLA膜、PLA/PPy膜、PLA/PPy膜+PLA/CS同轴纳米纤维作为对照组，与本实施例制备得到的PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维分别与RSC96细胞共培养1，3，5天，CCK-8实验结果参见图6。其中，参照本实施例的步骤2)将PLA溶解后铺膜即得PLA膜，参照本实施例的步骤3)将PLA壳层溶液和CS芯层溶液中不加药物进行同轴纺丝，即得PLA/CS同轴纳米纤维。结果表明，与空白组相比，PLA膜由于降解呈酸性，对细胞毒性较大，而其他组中，PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维对RSC96细胞生长的促进作用最强。
分别设置空白组、PLA膜、PLA/PPy膜、PLA/PPy膜+PLA/CS同轴纳米纤维作为对照组，与本实施例制备得到的PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维分别与PC12细胞共培养1，3，5天，CCK-8实验结果参见图7。其中，将PLA溶解后铺膜即得PLA膜，PLA壳层溶液和CS芯层溶液中不加药物进行同轴纺丝，即得PLA/CS同轴纳米纤维。结果表明，PLA膜组对细胞毒性较大，其他组中，PLA/PPy膜+PLA(VEGF)/CS(PF)同轴纳米纤维细胞的OD值最大，说明负载的药物对PC12细胞生长具有促进作用。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)中软模板剂SDS的加入量由2.49g变为1.85g。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤2)中PPy纳米球的加入量为0.03g。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤2)中PPy纳米球的加入量为0.09g。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤3)中芯层溶液以0.1mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.3mm/min的速度推出，同轴针管与接收板之间电压为20KV，接收距离为10cm。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种填充双载药纳米纤维导电神经修复系统，其特征在于，包括双载药同轴纳米纤维和中空的聚吡咯/聚乳酸神经导管，其中：
所述双载药同轴纳米纤维填充于所述聚吡咯/聚乳酸神经导管内；
所述聚吡咯/聚乳酸神经导管以聚乳酸为基础材料，掺入聚吡咯纳米球，所述聚吡咯纳米球均匀分散在所述聚乳酸中；
所述双载药同轴纳米纤维中，以聚乳酸/血管内皮生长因子为壳层，以壳聚糖/芍药苷为芯层。
2.根据权利要求1所述的导电神经修复系统，其特征在于，所述聚吡咯/聚乳酸神经导管内径为1.5-3mm，外径为2.5-4mm；所述双载药同轴纳米纤维直径为950-1700nm。
3.根据权利要求1所述的导电神经修复系统，其特征在于，所述聚吡咯/聚乳酸神经导管中，聚吡咯纳米球和聚乳酸质量比为0.03-0.15：1，所述双载药同轴纳米纤维，壳层中血管内皮生长因子和聚乳酸质量比为10-7-10-6：1，芯层中芍药苷和壳聚糖质量比为1：5-10。
4.根据权利要求1所述的导电神经修复系统，其特征在于，所述双载药同轴纳米纤维通过同轴静电纺丝技术制备得到，其中含有聚乳酸和血管内皮生长因子的溶液作为壳层纺丝溶液，含有壳聚糖和芍药苷的溶液作为芯层纺丝溶液。
5.根据权利要求1所述的导电神经修复系统，其特征在于，聚吡咯纳米球通过在吡咯单体中加入十二烷基硫酸钠作为软模板剂，以FeCl3为氧化剂制备得到。
6.一种权利要求1-5任一项所述的填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)聚吡咯/聚乳酸神经导管的制备：取聚乳酸溶于溶剂中得聚乳酸溶液，将聚吡咯纳米球分散在聚乳酸溶液中，搅拌后超声，然后转移至模板中，静置，形成聚吡咯/聚乳酸膜，卷曲成管，即得聚吡咯/聚乳酸神经导管；
2)双载药同轴纳米纤维的制备：将聚乳酸和血管内皮生长因子溶于溶剂中，作为壳层纺丝溶液，将壳聚糖和芍药苷溶于溶剂中，作为芯层纺丝溶液，进行同轴静电纺丝得到双载药同轴纳米纤维；
3)填充双载药纳米纤维导电神经修复系统的制备：将步骤2)得到的双载药同轴纳米纤维填充进步骤1)所得的聚吡咯/聚乳酸神经导管中，即得到填充双载药纳米纤维导电神经修复系统。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，聚吡咯纳米球制备为：将吡咯单体加入十二烷基硫酸钠溶液中，搅拌，再加入FeCl3溶液，0-20℃恒温反应8-15h，后处理即得聚吡咯纳米球，其中FeCl3与吡咯单体摩尔比为0.6-1.2：1，十二烷基硫酸钠与吡咯单体摩尔比为0.3-1：1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述聚吡咯纳米球和聚乳酸质量比为0.03-0.15：1；所述步骤2)中，聚乳酸和血管内皮生长因子质量比为10-7：1-10-6：1；芍药苷和壳聚糖质量比为1：5-10。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述壳层纺丝溶液的溶剂为二氯甲烷；所述芯层纺丝溶液的溶剂为质量分数为1-3％的乙酸溶液。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中所述分散聚吡咯搅拌时间为20-40min，超声时间为20-30min；所述步骤2)中，同轴静电纺丝参数为：芯层纺丝液以0.1-0.2mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.3-0.6mm/min的速度推出，芯层与壳层速率之比保持在1：2-3.5之间，同轴针管与接收板之间施加电压为16-25KV，接收距离为9-15cm，环境温度为20-25℃，相对湿度为25-40％。
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