CN112190549A - 一种超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶及其制备方法和应用，属于生物医学领域。本发明通过合成壳聚糖‑聚吡咯聚合物，然后与戊二醛交联制备壳聚糖‑聚吡咯纳米凝胶，最后用NaOH溶液处理壳聚糖‑聚吡咯纳米凝胶，得到一系列壳聚糖‑聚吡咯‑羟基纳米凝胶。所制备得到的超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶能够实现pH诱导的表面电荷的快速转换，具有良好的细胞相容性、良好的蛋白抗性、较高的抗癌药物负载效率，具有较好的抗肿瘤能力，有望作为一种安全、有前途的纳米载体来构建低副作用的增强抗肿瘤治疗平台，应用于生物医学领域。

Description

一种超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
纳米医学已经成为一种很有前途的向实体肿瘤输送诊断和治疗药物的手段。但是，给药过程需要经过1)血液循环，2)肿瘤内积聚，3)深入肿瘤组织，4)被癌细胞内化，5)细胞内药物释放等五个步骤，在这一过程中会遇到相当大的生物屏障，因此静脉注射后只有约1％的药物能被输送到靶向肿瘤细胞。这就是为什么许多纳米载体在实验模型中是有效的，但是临床试验的结果却不令人满意。
为了解决上述的生物屏障问题，各种具有不同性质(如粒径、表面电荷和功能修饰)的纳米载体被设计出来。但是现今大多数纳米载体在生物医学应用中仍处于次优状态。通常，具有小尺寸、带正电荷和/或靶向分子的纳米载体由于与细胞膜强烈的特异性相互作用，能够有效地促进肿瘤的穿透和细胞内吞，但它们通常会受到肾脏或网状内皮系统(RES)的快速清除，导致半衰期短，肿瘤内积聚不足。同样，具有大尺寸、中性/负电荷和/或亲水涂层(例如聚乙二醇(PEG)或两性离子)的纳米载体由于具有被动增强的渗透性和滞留(EPR)效应、良好的稳定性和血液循环时间，可有效地积聚到肿瘤中。然而，由于接触到的细胞有限，这些纳米载体的细胞内化的量是非常少的。
近年来，人们开发了两种主要的创新策略来提高纳米载体的传递效率。第一是利用降解酶(如透明质酸酶)调节肿瘤细胞外基质(ECM)，以降低间质流体压力。然而，ECM的不可控制的崩解可能导致各种意想不到的风险(如肌肉骨骼疼痛、促进肿瘤进展甚至转移)。第二是在体内不同微环境下，设计具有大小可切换(大到小)或电荷可逆(中性/负向正)行为的刺激响应性纳米载体，以延长血液循环、增强肿瘤积聚或提高细胞内吞作用，改善肿瘤治疗效果。然而，尺寸或电荷可逆过程通常是通过刺激触发化学键断裂来实现的，这需要数小时，并且在刺激触发过程发生之前，纳米载体可能已经被清除，从而限制了输送和治疗效果。因此，迫切需要开发新型纳米载药载体，以提高体内治疗效果，同时，肿瘤纳米医学面临的新机遇和新挑战要求开发新型超快电荷反转纳米载体，以解决变化过程的及时性问题。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种壳聚糖基纳米凝胶及其制备方法和应用，制备得到的纳米凝胶具有超快电荷可逆性质。
本发明提供一种壳聚糖基纳米凝胶的制备方法，首先合成壳聚糖-聚吡咯聚合物(CH-Py聚合物)，然后与戊二醛交联制备壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶(CH-Py NGs)，最后用NaOH溶液处理壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶，得到壳聚糖-聚吡咯-羟基纳米凝胶(CH-Py-OH NGs)。
优选的，所述制备方法具体步骤包括：
(1)壳聚糖-聚吡咯聚合物的合成：以0.1M醋酸为溶剂，配制并量取10mg/mL的壳聚糖溶液5mL，以1M HCL为溶剂，分别配制并量取20.8mg/mL的吡咯5mL和70.8mg/mL的APS2.5mL并滴加到所述壳聚糖溶液中，在0℃黑暗中搅拌1h，然后在室温下再搅拌24h；添加1MNaOH12.5 mL使反应停止，再添加无水乙醇200ml沉淀混合物，NMP过滤洗涤沉淀3次，再用水洗涤3次；产物在60℃的烘箱中干燥2天，获得壳聚糖-聚吡咯聚合物；
(2)壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶的制备：以1M盐酸为溶剂，配制并量取10mg/mL的CH-Py聚合物1ml和10mg/mL的戊二醛1ml作为水相，以环己烷为溶剂，配制并量取25.8mg/mL的span-80 10ml作为有机相，在冰冷却10分钟的情况下，使用超声波发生器以50％的占空比和40％的输出控制对混合物进行超声波处理，然后在室温下搅拌过夜得到壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶；制备的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶在6000rpm下离心10min纯化，在10ml水中再分散，在一个装有12000-14000MWCO再生纤维素透析膜的袋子中透析3天，得到纯化后的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶；
(3)壳聚糖-聚吡咯-羟基纳米凝胶(CH-Py-OH NGs)的制备：加入不同浓度的NaOH溶液处理壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶24小时，制备得到壳聚糖-聚吡咯-羟基纳米凝胶。
优选的，所述的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶与所述的NaOH溶液浓度比和摩尔比为如下所示的一种：
Figure BDA0002721836690000021
Figure BDA0002721836690000031
优选的，所述的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶与所述的NaOH溶液的浓度比为1:4，摩尔比为1:12.5。
本发明还提供一种如上任一壳聚糖基纳米凝胶的制备方法制备得到的纳米凝胶。
本发明还提供一种按照所述的任一制备方法，所述的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶与所述的NaOH溶液的浓度比为1:4，摩尔比为1:12.5时制备得到的纳米凝胶。
本发明还提供前述壳聚糖基纳米凝胶作为药物载体的应用。
优选的，所述的药物载体承载的药物是治疗癌症的药物。
优选的，所述的药物是阿霉素。
优选的，所述的癌症是卵巢癌。
本发明具有以下技术效果：
本发明提供的超快电荷可逆壳聚糖基纳米凝胶，具有良好的细胞相容性、良好的蛋白抗性、较高的抗癌药物阿霉素(DOX)负载效率，能够促进肿瘤部位的主动转运，通过静电相互作用增强穿透力和细胞内吸收，显著提高抗肿瘤活性，降低RES清除率，延长血液循环，提高肿瘤穿透力，提高细胞内吞和刺激反应性药物释放，有望作为一种安全、有前途的纳米载体应用于生物医学领域。
本发明所述的纳米凝胶由于其表面负电荷能够延长血液循环时间，同时其快速切换的正电荷又能增强肿瘤的积聚、穿透和肿瘤细胞的摄取，促进细胞内吞，快速电荷转换发生在溶液pH从7.4切换到6.5后，该过程仅用了约10s，电荷转换效应长期稳定，其电荷反转特性能够有效地促进细胞吸收和内化，促进药物向细胞核释放，从而在酸性TME条件下达到最佳的抗癌效果。
本发明所述的纳米凝胶能够负载抗癌药物阿霉素(DOX)，取得了较好的抗肿瘤效果，能够在体内对癌症，尤其是卵巢癌进行增强化疗。与现有技术中的其他纳米载体的平均肿瘤聚集率(小于1％)相比，本发明所述的纳米凝胶的肿瘤聚集率显著提高(约4.2％)。其酶反应降解使其具有可控的药物释放行为，并且降解片段很小，可以在体内由肾脏代谢。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CH and CH-Py聚合物的热重曲线。
图2为CH和chpy聚合物分散在含体积分数为2％的CD3COOD分散的重水(D2O)中的核磁共振氢谱。
图3为P NGs的透射电镜图像。
图4CH-Py NGs在水中的水合粒径大小分布。
图5为CH，CH-Py聚合物和P NGs的傅里叶变换红外光谱图。
图6为CH，CH-Py聚合物和P NGs的紫外-可见-近红外光谱图。
图7为在ph7.4和ph6.5条件下，不同NaOH浓度和摩尔比处CH-Py-OH NGs之后的Zeta电势。
图8为P NGs和R NGs在pH 3-11范围内的表面电荷变化趋势。
图9为溶液从pH7.4变为ph6.5后R NGs表面电荷的时间依赖性转化。
图10为R NGs在pH 7.4和pH 6.5条件下随着时间延长表面电荷的变化趋势。
图11为NGs蛋白质抗性和酶降解结果，其中(a)为NGs的蛋白质吸收、抵抗示意图；(b)为不同浓度P NGs、R NGs和N NGs在ph7.4和6.5条件下的蛋白抵抗测定；(c)为在pH值为6.5的溶菌酶溶液中，不同降解时间R NGs的TEM图像；(d)为在pH值为6.5的溶菌酶溶液中，不同降解时间R NGs的大小变化；(e)为在pH7.4或pH6.5条件下，有/无溶菌酶的R NGs/DOX的DOX累积释放量。
图12为在pH 7.4和pH 6.5条件下，磷酸缓冲液、R NGs/DOX以及N NGs/DOX作用4h后，A2780细胞摄取DOX量的流失细胞分析。
图13为细胞相容性和细胞摄取结果，其中(a)为不同浓度的P NGs、R NGs和N NGs处理24小时后的A2780细胞的CCK-8活性测定；(b)为A2780细胞用R NGs/DOX和N NGs/DOX在pH7.4和pH6.5培养基中处理4h后，流式细胞术分析细胞凋亡情况；(c)为A2780细胞用RNGs/DOX和N NGs/DOX在pH7.4和pH6.5培养基中处理不同时间的激光共聚焦图像(×400)。
图14为3D细胞球体的体外渗透及抗癌作用结果，其中(a)为R NGs在肿瘤深部穿透、转胞吞作用和药物释放的示意图。(b)为不同浓度的R NGs/DOX和N NGs/DOX作用下A2780细胞的激光共聚焦图像；(c)为不同浓度的R NGs/DOX和N NGs/DOX作用下A2780细胞的流式荧光摄取量；(d)为ph7.4的条件下用不同浓度的DOX、R NGs/DOX和N NGs/DOX作用下A2780细胞的CCK8增殖实验结果；(e)为ph6.5条件下用不同浓度的DOX、R NGs/DOX和N NGs/DOX作用下A2780细胞的CCK8增殖实验结果。
图15为药代动力学与肿瘤体内蓄积结果，其中(a)为健康小鼠静脉注射R NGs/DOX、N NGs/DOX和游离DOX后DOX的药代动力学；(b)为以裸鼠A2780移植瘤为实验对象，静脉注射R NGs/DOX和N NGs/DOX后不同时间点肿瘤组织中DOX的累积量；(c)(d)(e)为A2780荷瘤裸鼠静脉注射生理盐水、R NGs/DOX、N NGs/DOX和游离DOX([DOX]＝5mg/kg，每个DOX相关组0.2ml生理盐水)后，各组的肿瘤相对体积(c)、裸鼠体重(d)以及生存期(e)；(f)为不同治疗组肿瘤细胞凋亡率的定量分析；(g)为各组肿瘤切片TUNEL染色(×100)。
图16为各治疗组第0天和第21天荷瘤裸鼠的照片。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。对于本发明中的数值范围，应理解为公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
本发明所使用材料中，壳聚糖(190-310kDa)、吡咯、过硫酸铵(APS)、戊二醛(H2O中25％)、环己烷、span 80、盐酸(HCl)、乙酸、氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇、甲基吡咯烷酮(NMP)、十二烷基硫酸钠(SDS)、triton X-100、乙二胺四乙酸(EDTA)、三醋酸EDTA(TAE)、二硫苏糖醇(DTT)、异丙醇、蔗糖、氯仿、异丙醇、乙腈、三氟乙酸(TFA)、溶菌酶和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯市)。盐酸阿霉素(DOX·HCl)由北京华丰药业有限公司(中国北京)供应。从中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所获得了人卵巢癌细胞系A2780。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)从海洋生物技术公司(中国，上海)获得。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)和青霉素链霉素购自杭州基诺生物医药科技有限公司(杭州)。三维培养皿来自微组织(普罗维登斯，RI)。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒从瑞士巴塞尔F.Hoffmann-La-Roche获得。所有实验中使用的水都是使用Milli-Q Plus 185净水系统(Millipore，Bedford，MA)净化的，其电阻率高于18MΩ·cm。再生纤维素透析膜(截留分子量MWCO＝12000-14000)从Thermo Fisher Scientific(宾夕法尼亚州匹兹堡)获得。另外，一般商业途径购买得到的相同产品均具有相同效果。
以下实施例采用单因素方差分析统计方法对实验数据进行评价。选择p值0.05作为统计显著性水平，数据分别用(*)表示p<0.05，(**)表示p<0.01，(***)表示p<0.001。
实施例1超快电荷反转CH-Py-OH NGs的合成与表征
促进纳米载体主动转运到肿瘤部位的一种有效方法是通过阳离子电荷介导的内吞作用和吸附介导的跨细胞作用，在酸性肿瘤微环境中设计具有快速有效阳离子电荷转移功能的NGs是关键。
1.实验步骤
1.1超快电荷反转CH-Py-OH NGs的合成
为了获得具有良好生物相容性的超快pH触发电荷反转NGs，首先通过化学氧化聚合法合成CH-Py聚合物，然后通过反相微乳液法与戊二醛交联制备得到CH-Py NGs(图1)，再用不同浓度比的NaOH溶液处理CH-Py NGs(P NGs)，制备一系列的CH-Py-OH NGs。具体步骤如下所示：
以0.1M醋酸为溶剂，配制并量取10mg/mL的壳聚糖溶液5mL，以1M HCL为溶剂，分别配制并量取20.8mg/mL的吡咯5mL和70.8mg/mL的APS 2.5mL并滴加到所述壳聚糖溶液中，在0℃黑暗中搅拌1h，然后在室温下再搅拌24h；添加1M NaOH12.5mL使反应停止，再添加无水乙醇200ml沉淀混合物，NMP过滤洗涤3次除去未反应的吡咯，再用水洗涤3次除去NMP；产物在60℃的烘箱中干燥2天，获得CH-Py聚合物。
以1M盐酸为溶剂，配制并量取10mg/mL的CH-Py聚合物1ml和10mg/mL的戊二醛作为水相，以环己烷为溶剂，配制并量取25.8mg/mL的span-80 10ml作为有机相，采用反相微乳液法制备了CH-Py NGs。在冰冷却10分钟的情况下，使用超声波发生器以50％的占空比和40％的输出控制对混合物进行超声波处理，然后在室温下搅拌过夜；制备的CH-Py NGs在6000rpm下离心10min纯化，在10ml水中再分散，在一个装有12000-14000MWCO再生纤维素透析膜的袋子中透析3天，得到纯化后的CH-Py NGs。
最后，用不同浓度比的NaOH溶液(1ml)处理CH-Py NGs(1ml)24小时，制备一系列具有不同表面电位的CH-Py-OH NGs(表1)。
表1CH-Py NGs(1mL)与不同浓度的NaOH溶液(1mL)进行配比的配方
Figure BDA0002721836690000071
1.2表征
使用TG 209F1热重分析仪(耐驰仪器有限公司，Selb/Bavaria，Germany)在氮气气氛下以10℃/min的速率将样品从30℃加热至800℃，进行热重分析(TGA)测量。在Brukerav400核磁共振波谱仪上，以含有体积分数为2％的氚代乙酸(Cd3CoOD)的重水为溶剂，采集了1HNMR谱。使用Nicolet Nexus 670FTIR分光光度计(Thermo Nicolet Corporation，Madison，WI)收集傅里叶变换红外(FTIR)光谱。紫外-可见光谱由Lambda 25紫外可见分光光度计(马萨诸塞州波士顿珀金内默)记录。透射电子显微镜(TEM)是使用JEOL2010F分析电子显微镜(JEOL，东京，日本)在200千伏下运行。使用配备标准633nm激光的ZetasizerNano-ZS系统(英国伍斯特郡马尔文)，通过动态光散射(DLS)测量Zeta电位和流体动力学尺寸。
1.3超快电荷反转行为
pH触发的电荷反转CH-Py-OH-4NGs(R NGs)分别在ph7.4和ph6.5的磷酸盐缓冲液中进行。10s后测定NGs的zeta电位，并在ph7.4或ph6.5下连续测定R NGs在15h内的zeta电位。
1.4抗蛋白质吸附性能
在不同最终NG浓度(0.5和1.0mg/mL)下，将原始CH-Py NGs(P NGs)、R NGs和CH-Py-OH-6NG(N NGs)分别与BSA(1mg/mL，pH 7.4或pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中)混合。在37℃下孵育4h后，以13000rpm离心15min。随后，通过BSA吸光度/浓度校准曲线在280nm波长下使用UV-vis光谱测定上清液中的BSA浓度。通过比较孵育/离心前后BSA含量的变化来量化蛋白抗性。
1.5酶响应降解性能
用DLS和TEM研究R NGs在溶菌酶存在下的酶降解行为。将R NGs(0.4mg)与溶于2ml磷酸盐缓冲液(ph6.5)中的溶菌酶(2mg)混合，在不同时间点进行DLS分析和TEM成像。
2.实验结果
2.1合成与表征结果
根据热重分析(TGA)结果(图1)，与CH相比，CH-Py聚合物在200-450℃下的重量损失较少(与CH的降解有关)，在450-800℃下的重量损失增加(与Py的降解有关)，表明CH-Py聚合物已经成功制备。
通过1HNMR表征(图2)，每个CH单元上接枝的Py数计算为1.3。透射电子显微镜(TEM)成像显示，制备的CH-Py NGs(P NGs)平均直径为132.3nm，形态均匀(图3)。
此外，通过动态光散射(DLS)测量，确定P NGs的流体动力学尺寸为206.2nm，大于TEM测量的尺寸(图4)。这应归因于P NGs在水溶液中的溶胀行为。
用傅里叶变换红外光谱(FTIR)对生成的P NGs进行了表征(图5)。与CH相比，在1563cm-1和1465cm-1处的峰值分别与吡咯环的C＝C和C-N不对称和对称伸缩振动有关，而在747cm-1处的峰值则来自于-NH-键，表明CH-Py已成功接枝。
同样，P NGs在1702cm-1处出现的新峰归属于Schiff碱基(-N＝CH-)，这表明壳聚糖胺基与戊二醛醛基之间的交联反应是成功的。此外，通过紫外-可见-近红外光谱(图6)检查了CH-Py NGs的光学性质。显然，与CH相比，CH-Py聚合物和P NGs由于枝接Py而在NIRⅠ和Ⅱ区具有增强的吸收，这表明P NGs可能在近红外激光照射下用于光声成像和光热治疗。
2.2电荷转换结果
为了获得能够显示pH触发电荷从负向正转换的合适的CH-Py-OH NGs，在分别代表生理和肿瘤微环境条件的ph7.4和ph6.5下测量了一系列CH-Py-OH NG的表面电位(图7)。PNGs在ph7.4和ph6.5时均呈正电荷，在血液循环中被RES清除。在用一定量的NaOH溶液处理后，由于OH-在Py环上的选择性吸附，NGs可能带有负电荷。显然，形成的CH-Py-OH-3NGs和CH-Py-OH-4NGs具有从pH7.4到ph6.5的明显电荷转换(从负到正，R NGs)，这一现象归因于Py的质子化。此外，过量NaOH处理后，CH-Py-OH-6NGs(N NGs)的电荷反转能力消失，且在ph7.4～ph6.5之间仍带负电。P NGs和CH-Py-OH-4NGs(R NGs)的表面电位变化可以在更宽的pH范围(3-11)中展现(图8)。接下来，跟踪R NGs的表面电荷转换(图9)。从-11.3mV到+10.4mV的快速电荷转换发生在溶液pH从7.4切换到6.5后，该过程仅用了约10s。最后，在pH7.4和pH 6.5条件下，R NGs的电荷转换效应长期稳定(图10)。结果表明，在ph6.5下，R NGs的表面电荷维持在+11.0mv左右，在ph7.4下维持在-11.54mv。
2.3抗蛋白测试
纳米药物的全身给药需要赋予纳米载体抗血浆蛋白的能力，以降低网状内皮系统RES的清除率，延长血液循环时间。用牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白，分别在pH 7.4和pH6.5条件下模拟血液和肿瘤微环境，检查P NGs、R NGs和N NGs的蛋白质抗性行为(图11a-b)。测定并计算了BSA在NGs上的吸附量。结果表明，在ph7.4和ph6.5条件下，P NGs比R NGs和N NGs具有更高的蛋白质吸附能力(P<0.001)。如预期，带有负表面电荷的R NGs和N NGs在ph7.4时表现出极低的蛋白质吸附(p>0.05)。而在ph6.5条件下，R NGs对蛋白质的吸附量明显高于N NGs(p<0.001)。这应该是由于R NGs的电荷在ph6.5时被触发为正，从而激活了蛋白质的相互作用。这些结果表明，在血液和TME条件下，带有正电荷的P NGs可以很容易地通过强静电相互作用诱导蛋白质吸附，并能被RES快速清除，相反，在血液中带有负表面电荷的R NGs和N NGs都能表现出优良的蛋白质抗性，从而延长血液循环时间。最引人注目的是，具有电荷反转特性的R NGs可能是一种理想的纳米载体，可以延长血液循环时间，促进肿瘤部位的主动转运，通过静电相互作用增强组织穿透力和细胞内吸收。
2.5酶降解性能
对于体内生物医学应用，纳米载体的生物降解对于避免其长期毒性至关重要。众所周知，CH是一种无毒、无溶血和无刺激性的生物大分子，在特定的酶条件下可以通过糖苷键断裂进行生物降解。接下来，在溶菌酶存在下测试R NGs的生物降解性。TEM成像和DLS结果都表明，溶菌酶在ph6.5下可以随时间逐渐降解R NGs(图11c-d)。最初的快速降解存在于最初的20分钟内，随后在24小时内缓慢降解。R NGs的酶反应降解可能使其具有可控的药物释放行为，并且降解片段很小，可以在体内由肾脏代谢。
实施例2药物包封与释放
1.实验步骤
1.1药物的包封与释放
以DOX为模型药物包封P NGs、R NGs和N NGs。为了评估载药效率，将5mg P NGs、RNGs或N NGs和1mg DOX浸泡在5ml水中，在黑暗中搅拌24h。通过离心(11000rpm，10min)去除游离DOX，得到最终的DOX负载NGs。此外，根据标准DOX吸收/浓度校准曲线，在480nm处用UV-vis光谱法测量收集上清液中的游离DOX浓度。DOX装载效率由方程式(1)估算：
载药效率＝(Mo-Mn)/Mo×100％(1)
式中，Mn和Mo分别为上清液DOX质量和初始加入的总DOX质量。
研究了不同pH条件下R NGs/DOX在有/无溶菌酶条件下DOX的释放动力学。将溶于1ml磷酸盐缓冲溶液(pH7.4或pH6.5)中的R NGs/DOX(1mg)置于MWCO为12000-14000的透析袋中，并悬浮在聚乙烯管中相应的缓冲介质(9ml)中。6h后加入溶菌酶，释放系统置于37℃蒸气浴恒温振动器中。在每个预定的时间间隔内，从不同系统中取出1ml的外相缓冲介质，在480nm处用紫外-可见光谱法测量，然后补充相同体积的相应缓冲介质。
2.实验结果
将形成的P NGs、R NGs和N NGs作为纳米载体负载阿霉素DOX，并测量DOX的负载效率(表2)。结果表明，由于P NGs与正电荷之间存在静电斥力，P NGs/DOX的负载效率仅为26.21％.相比之下，R NGs/DOX和N NGs/DOX的负载效率分别高达87.58％和89.63％，这是由于R NGs/N NGs和N NGs/DOX之间的静电相互作用.因此，R NGs和N NGs都是适合DOX高效负载的纳米载体。
表2 P NGs/DOX,R NGs/DOX和N NGs/DOX对DOX的包载率
Figure BDA0002721836690000111
此外，在存在或不存在溶菌酶的情况下，研究了R NGs/DOX在不同pH条件下的DOX释放(图11e)。显然，在ph7.4条件下，R NGs/DOX的DOX释放缓慢，1天后累积释放量仍为17.45％。相比之下，在ph6.5条件下，R NGs/DOX可快速释放DOX，累积释放率达36.53％。pH响应释放可能是由于质子海绵效应，阳离子R NGs和盐酸二恶英在酸性环境下，通过NGs与DOX之间的静电斥力促进DOX的快速释放。由于肿瘤区域(pH6.5)和正常组织(pH7.4)的pH值不同，此种现象有利于抑制癌细胞，而不是正常组织。在ph6.5溶菌酶存在下，R NGs/DOX在ph6.5条件下的DOX释放进一步得到显著促进，由于NGs的降解，累积释放量达到73.22％。这些结果表明R NGs/DOX具有pH/酶双刺激响应的释药性能。
实施例3细胞相容性与细胞内化
1.实验步骤
1.1细胞相容性测定
A2780细胞在37℃和5％CO2条件下，在添加FBS(10％，v/v)和青霉素链霉素(1％，v/v)的DMEM中培养。用不同浓度的P NGs、R NGs和N NGs处理A2780细胞，用CCK-8法检测细胞活力。简单地说，将A2780细胞接种在96孔板中，每孔密度为6×103个细胞，用200μl新鲜培养基培养24小时，然后将每个孔的培养基换成含有P NGs、R NGs或N NGs的新鲜培养基，最终浓度不同(0.05-1mg/mL)。培养24h后，取出培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次。再将含10％CCK-8试剂的DMEM加入每孔200μL，在黑暗中孵育4h。使用Multiscan MK3ELISA阅读器(Thermo Scientific，Logan，UT)测量每个孔的吸光度，并根据文献方法(Targeted Tumor CT Imaging Using Folic Acid-Modified PEGylatedDendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles，C.Peng等，2013)计算细胞活力。
1.2细胞摄取
通过共焦显微镜(德国耶拿卡尔蔡司LSM 700)观察了在pH 6.5或pH 7.4时R NGs/DOX或N NGs/DOX的细胞内摄取。直径14mm的盖玻片用5％盐酸、30％硝酸和75％乙醇预处理，置于24孔培养板中，然后用DMEM浸泡过夜。然后，将A2780细胞接种到密度为3×104个/孔的平板中。培养12h后，弃去各孔培养基，用pH 7.4培养基(或用盐酸调节pH 6.5的培养基)代替含有R NGs或N NGs的培养基，最终NG浓度为10μg/mL，培养1小时或4小时，然后用PBS洗涤A2780细胞，用戊二醛(2.5％)固定15分钟在4℃下，按照标准程序在37℃下用DAPI复染8分钟。最后，用共焦显微镜对细胞进行成像。
此外，通过流式细胞术定量评估R NGs/DOX或N NGs/DOX的细胞内摄取。将A2780细胞接种于12孔细胞培养板中，每孔密度为5×104个细胞，在新鲜DMEM中培养。培养12h后，用pH7.4或pH6.5含有R NGs/DOX或N NGs/DOX的培养基(最终NG浓度为10μg/mL)代替每个孔的培养基。培养4小时后，用PBS洗涤细胞三次，胰蛋白酶化，在PBS中重新悬浮，并使用Becton-Dickinson-Faccan流式细胞仪(新泽西州富兰克林湖)进行分析。
2.实验结果
2.1细胞相容性测试
P NGs、R NGs和N NGs的细胞相容性通过CCK-8检测A2780细胞的活性(图13a)。在1mg/mL的最高浓度下，P NGs处理的细胞活力显著下降至36.81％，表明带正电的P NGs具有细胞毒性。相比之下，R NGs和N NGs处理的细胞活力与PBS对照组相比没有显著变化，在最高浓度(1mg/mL)下，细胞活力可维持在97％以上。这表明R NGs和N NGs具有良好的细胞相容性，有望作为一种安全、有前途的纳米载体应用于生物医学领域。
2.2细胞摄取
为了证明电荷转换可促进细胞内化的假设，我们将A2780细胞与R NGs/DOX或NNGs/DOX在pH 7.4和pH 6.5的培养基中孵育4小时，然后进行流式细胞术分析(图13b和图12)。在ph7.4条件下，R NGs/DOX和N NGs/DOX组的平均荧光强度均较低，且无显著性差异(p>0.05)。然而，在ph6.5条件下，R NGs/DOX组的平均荧光强度明显高于N NGs/DOX组(p<0.001)。这些结果表明，R NGs/DOX由于其在酸性TME下的电荷反转特性，在促进细胞摄取方面表现出显著的优势。阳离子R NGs/DOX能够提高与细胞膜的亲和力以增强细胞摄取。
此外，进行共焦激光扫描显微镜(CLSM)以确认不同pH下的A2780细胞分别在1小时和4小时内R NGs/DOX的细胞内吞作用(图13c)。显然，在培养1h后，与其他组相比，R NGs/DOX能在ph6.5时将更多的DOX转运到A2780细胞中，这是由于细胞内吞作用的增强。此外，RNGs/DOX在pH值为6.5的条件下孵育4h后，由于pH响应性药物释放和质子海绵效应，可以有效地将DOX释放到细胞核中，从而提高抗癌活性(红、蓝荧光重叠)。这些结果表明，R NGs/DOX的电荷反转特性能够有效地促进细胞吸收和内化，促进药物向细胞核释放，从而在酸性TME条件下达到最佳的抗癌效果。
实施例4 3D细胞球体的体外渗透及抗癌作用
1.实验步骤
1.1 3D细胞球的准备
由A2780细胞组成的三维肿瘤球体是由一种“悬滴”技术构建的。简单地，将500μL琼脂糖溶液(2％，w/v，无菌生理盐水)滴入3D培养皿中的模具中。通过吸液管吸出气泡。之后，将固化凝胶从模具中分离出来，放置在12孔板的每个孔中，并用DMEM平衡15分钟以上。然后，将含有5×104个A2780细胞的细胞悬液(190μL)缓慢添加到12孔板的每个孔中。静置10min后，向每个孔中缓慢加入2.5ml新鲜细胞培养基，使细胞聚集生长。当肿瘤球体达到合适的体积时，将浓度为10μg/mL的R NGs/DOX、N NGs/DOX或游离DOX与肿瘤球体孵育不同时间(1-8h)，检测其穿透能力。用PBS仔细冲洗肿瘤球体三次，并根据文献方案(Influence ofsize,crosslinking degree and surface structure of poly(N-vinylcaprolactam)-based microgels on their penetration into multicellular tumor spheroids.ZhangChangchang等，2019)使用共焦显微镜观察。
1.2.体外抗癌作用
为了评价R NGs/DOX或N NGs/DOX的体外抗癌活性，采用CCK-8法检测不同浓度RNGs/DOX或N NGs/DOX处理的A2780细胞的活性。简单地说，A2780细胞以每孔6×103个细胞的密度接种在96孔板中孵育24小时贴壁，然后用含有不同最终DOX浓度(0.1-10μg/mL)的RNGs/DOX、N NGs/DOX或游离DOX-的pH值为7.4的培养基(或HCl调节pH值为6.5的培养基)培养。孵育24h后，在每个孔中加入含CCK-8试剂，然后在黑暗中孵育4h。按上述方法进行CCK-8测定，并计算各样品DOX的半数最大抑制浓度(IC50)。
2.实验结果
纳米载体通过组织间隙穿透肿瘤区域的概念是肿瘤纳米医学的一个重要理论基础。因此，已经探索了几种与使用透明质酸酶或通过特定刺激进行大小切换(大到小)的ECM降解相关的创新策略，以减少穿透障碍并改善纳米载体的运输。然而，最新发现表明，大多数纳米载体通过跨细胞主动转运而非通过组织间隙的被动扩散进入实体肿瘤，这对当前的理论基础提出了质疑和挑战。同样，另一项最新研究证实，通过纳米载体的阳离子化，可以有效地实现跨细胞的主动转运，从而促进跨多个细胞层的深度穿透，从而到达肿瘤远端区域。
因此，在本研究中，探索了R NGs/DOX和N NGs/DOX在3D A2780多细胞球体肿瘤模型(MSTM)中的穿透能力，该模型能更好地模拟肿瘤组织的微环境(图14a-c)。结果表明，随着培养时间的延长，R NGs/DOX和N NGs/DOX处理的MSTM表现出DOX的红色荧光增强，DOX荧光由外围逐渐向内部扩散。虽然R NGs/DOX和N NGs/DOX的大小相似，但在相同的孵育时间点，R NGs/DOX处理的MSTM的DOX荧光强度和穿透深度均显著高于N NGs/DOX处理的MSTM(p<0.01)。这一结果表明，R NGs/DOX在酸性TME下pH响应的超快电荷转换可能有助于增强主动转运从而促进肿瘤的穿透。在8h时，经R NGs/DOX处理的MSTM在全细胞球范围内呈良好的分布，而N NGs/DOX处理的MSTM仅在外周出现荧光。这表明R NGs/DOX比N NGs/DOX具有更好的肿瘤穿透能力，有望提高抗肿瘤的疗效。
在pH7.4和pH6.5的培养基中，用CCK-8法测定用R NGs/DOX和N NGs/DOX处理的A2780细胞的活性，以评估其抗癌效果(图14d-e)。在ph7.4条件下，R NGs/DOX和N NGs/DOX的抗癌效果均呈浓度依赖性的增加趋势，且两者的疗效无显著性差异(p>0.05)。值得注意的是，在相同的DOX浓度下，在ph6.5条件下，R NGs/DOX处理的细胞比用N NGs/DOX处理的细胞活力低得多(p<0.01)。此外，计算并比较所有样品的半最大抑制浓度(IC50)(表3)。在pH6.5条件下，IC50遵循N NGs/DOX(4.80μg/mL)>R NGs/DOX(1.81μg/mL)>游离DOX(0.88μg/mL)的顺序。值得注意的是，R NGs/DOX在ph6.5条件下的IC50值比N NGs/DOX低2.6倍。这些结果表明，R NGs/DOX在酸性TME条件下具有促进细胞内吞和促进药物释放的优势。
表3R NGs/DOX,N NGs/DOX游离DOX在pH 7.4和pH 6.5条件下对A2780作用24h的IC50值
Figure BDA0002721836690000151
实施例5药物动力学与肿瘤体内蓄积
1.实验步骤
1.1药代动力学
所有动物实验均经上海新华医院伦理委员会和国家卫生部政策批准。雌性6周龄BALB/c裸鼠(20～25g)购自上海SLAC实验动物中心(中国上海)。BALB/c裸鼠(每组3只)静脉注射R NGs/DOX、N NGs/DOX或游离DOX(DOX剂量10mg/kg，溶于生理盐水中，每只小鼠接受0.2mL注射量)。根据先前报告的方案(Thermo and pH dual-controlled charge reversalamphiphilic graft copolymer micelles for overcoming drug resistance in cancercells，Zhang Haitao等，2015和Nullifying tumor efflux by prolonged endolysosomevesicles:development of low dose anticancer-carbon nanotube drug，Lee YeonKyung等，2013)测量血液中的DOX浓度，并根据文献方法(PEGylated dendrimer-entrappedgold nanoparticles for in vivo blood pool and tumor imaging by computedtomography，Peng Chen等，2012)进一步计算半衰期(t1/2)。静脉注射后，在指定时间点进行小鼠眼球摘除，采集血样。然后，将血样溶解在裂解缓冲液中(0.5mL，含有1％SDS、1％Triton X-100、40mM TAE、10mM EDTA和10mM DTT)，然后在20℃下用1mL提取液(异丙醇中0.75M HCl)培养过夜。在以15000rpm离心20分钟后，用JASCO FP6600分光光度计(日本东京JASCO国际有限公司)分析上清液的DOX浓度。
2.实验结果
静脉注射后，测定不同时间点的血DOX浓度(图15a)。R NGs/DOX和N NGs/DOX的半衰变时间(t1/2)分别为6.03h和6.20h，是纯DOX(0.28h)的21.5倍和22.1倍。这一结果表明，具有良好蛋白抗性的R NGs/DOX和N NGs/DOX由于表面负电荷，使RES清除率降低，血液循环时间延长，有利于药物纳米载体在肿瘤内的积聚。
静脉注射R NGs/DOX或N NGs/DOX后，进一步测量DOX的时间依赖性肿瘤累积(图15b)。在注射后24h，R NGs/DOX和N NGs/DOX的肿瘤累积量均达到峰值，然后随着代谢过程逐渐减少。更显著的是，在注射后24小时，R NGs/DOX的肿瘤累积量是N NGs/DOX的2.2倍(p<0.001)。令人鼓舞的是，量化计算表明，注射后24小时，注射的R NGs/DOX中约4.2％的DOX积聚在肿瘤组织中，明显高于注射的N NGs/DOX(1.9％)和其他许多纳米载体(低于1％)。这应该归因于NG系统的抗血浆蛋白吸附特性和肿瘤渗透作用降低了RES清除率，延长了血液循环，改善了肿瘤的渗透性，提高了R NGs/DOX的细胞内吞。
实施例6体内抗肿瘤疗效与器官生物安全性
1.实验步骤
1.1体内抗癌作用、肿瘤部位药物富集
将5×106个A2780细胞(悬浮于100μL PBS中)皮下注射于每只荷瘤裸鼠皮下，建立异种移植瘤模型。当肿瘤体积达到约100mm3时，每只荷瘤裸鼠尾静脉注射R NGs/DOX或NNGs/DOX(DOX剂量为5mg/kg，溶于0.2ml生理盐水中)。在预定的时间点，移除肿瘤组织(0.1-0.2g)，然后使用均质器在0.5ml裂解缓冲液(含0.25m蔗糖、40mmTAE和10mmEDTA)中均质。随后，在强涡流下将组织裂解物与100mL10％Triton X-100混合，然后添加1mL提取溶液(异丙醇中的0.75M HCl)。然后，将混合物在20℃下培养过夜。在以15000rpm离心20min后，按照上述程序分析上清液的DOX浓度。
接下来，将携带A2780异种移植瘤的裸鼠随机分为4组(每组n＝5)。荷瘤裸鼠腹腔注射生理盐水2ml。对于R NGs/DOX、N NGs/DOX和游离DOX各组，每只裸鼠每3天静脉注射该制剂(DOX剂量5mg/kg，溶于0.2ml生理盐水)，共21天。每天分别用卡尺和数字天平测量每只裸鼠的肿瘤体积(V)和体重。肿瘤体积按V＝W2×L/2(W和L分别代表肿瘤的宽度和长度)计算。相对肿瘤体积用V/V0表示，其中V0和V分别是不同时间点不同治疗前后的肿瘤体积。肿瘤组织用TUNEL染色，荧光显微镜(Carl-Zeiss，Axio-Vert)观察。
2.实验结果
为了验证R NGs/DOX在体内增强的抗肿瘤效果和明显降低的副作用，分别在生理盐水组、R NGs/DOX、N NGs/DOX和游离DOX组静脉注射(i.v.)后监测肿瘤体积变化、体重和生存率(图15c-e)。在图15c和图16中，与其他组相比，R NGs/DOX组在治疗后21天的相对肿瘤体积最小。R NGs/DOX组抑瘤效果显著高于N NGs/DOX组(p<0.001)和游离DOX组(p<0.01)。这些结果表明，R NGs/DOX确实可以通过该优化给药的方式显著提高抗肿瘤活性，降低RES清除率，延长血液循环，提高肿瘤穿透力，提高细胞内吞和刺激反应性药物释放。
在不同的处理后测量荷瘤裸鼠的体重(图15d)。结果表明，游离DOX组体重较其他组明显降低(p<0.01)，说明自由DOX在全身应用后有副作用。相比之下，R NGs/DOX、N NGs/DOX和生理盐水组的体重无显著差异，表明R NGs和N NGs作为纳米载体都能降低DOX的体内副作用。此外，在60天内测量不同组裸鼠的存活率，以进一步研究抗肿瘤效果(图15e)。60d后，生理盐水组裸鼠全部死亡，R NGs/DOX组存活率达80％，明显高于N NGs/DOX组(20％)和游离DOX组(40％)。结果表明，R NGs/DOX对裸鼠的抑瘤效果最好，能充分延长裸鼠的存活时间。
此外，通过对不同治疗后肿瘤切片的TUNEL染色进一步评价各组在体内的抗肿瘤效果(图15f-g)。与生理盐水组相比(绿色荧光)，R NGs/DOX组可见大量凋亡细胞，明显高于N NGs/DOX和游离DOX组。各组相应的凋亡率分析显示，肿瘤细胞凋亡率依次为R NGs/DOX(56.4％)>游离DOX(29.7％)>N NGs/DOX(21.4％)>生理盐水(8.9％)(图15f)。这些结果再次证明R NGs/DOX具有多种优点，在体内具有良好的抗肿瘤作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种壳聚糖基纳米凝胶的制备方法，其特征在于，首先合成壳聚糖-聚吡咯聚合物，然后与戊二醛交联制备壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶，最后用NaOH溶液处理壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶，得到壳聚糖-聚吡咯-羟基纳米凝胶。
2.如权利要求1所述的壳聚糖基纳米凝胶的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)壳聚糖-聚吡咯聚合物的合成：以0.1M醋酸为溶剂，配制并量取10mg/mL的壳聚糖溶液5mL，以1M HCL为溶剂，分别配制并量取20.8mg/mL的吡咯5mL和70.8mg/mL的APS 2.5mL并滴加到所述壳聚糖溶液中，在0℃黑暗中搅拌1h，然后在室温下再搅拌24h；添加1M NaOH12.5mL使反应停止，再添加无水乙醇200ml沉淀混合物，NMP过滤洗涤沉淀3次，再用水洗涤3次；产物在60℃的烘箱中干燥2天，获得壳聚糖-聚吡咯聚合物；
(2)壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶的制备：以1M盐酸为溶剂，配制并量取10mg/mL的CH-Py聚合物1ml和10mg/mL的戊二醛1ml作为水相，以环己烷为溶剂，配制并量取25.8mg/mL的span-80 10ml作为有机相，在冰冷却10分钟的情况下，使用超声波发生器以50％的占空比和40％的输出控制对混合物进行超声波处理，然后在室温下搅拌过夜得到壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶；制备的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶在6000rpm下离心10min纯化，在10ml水中再分散，在一个装有12000-14000MWCO再生纤维素透析膜的袋子中透析3天，得到纯化后的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶；
(3)壳聚糖-聚吡咯-羟基纳米凝胶的制备：加入不同浓度的NaOH溶液处理壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶24小时，制备得到壳聚糖-聚吡咯-羟基纳米凝胶。
3.如权利要求1-2任一项所述的壳聚糖基纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶与所述的NaOH溶液浓度比和摩尔比为如下所示的一种：
Figure FDA0002721836680000011
4.如权利要求3所述的壳聚糖基纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖-聚吡咯纳米凝胶与所述的NaOH溶液的浓度比为1:4，摩尔比为1:12.5。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的壳聚糖基纳米凝胶的制备方法制备得到的纳米凝胶。
6.一种如权利要求4所述的壳聚糖基纳米凝胶的制备方法制备得到的纳米凝胶。
7.一种权利要求6所述的壳聚糖基纳米凝胶作为药物载体的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物载体承载的药物是治疗癌症的药物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物是阿霉素。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的癌症是卵巢癌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115254059A (zh) * 2022-08-11 2022-11-01 河南省煤炭地质勘察研究总院 一种用于高效去除废水中六价铬离子的壳聚糖/edta/聚吡咯吸附材料及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103757917A (zh) * 2014-01-26 2014-04-30 江汉大学 一种具有电活性的壳聚糖基复合材料的制备方法
US20150366900A1 (en) * 2013-02-05 2015-12-24 University Health Network Conductive biomaterial for enhancement of conduction in vitro and in vivo
CN105617459A (zh) * 2016-03-23 2016-06-01 苏州卫生职业技术学院 一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法
CN106810636A (zh) * 2016-12-29 2017-06-09 华中科技大学 肿瘤微环境智能响应的纳米凝胶及纳米凝胶载药系统
CN107137765A (zh) * 2017-04-24 2017-09-08 武汉理工大学 聚吡咯生物导电水凝胶及其制备方法和应用
CN107715170A (zh) * 2017-11-28 2018-02-23 山西医科大学第医院 一种3d聚吡咯壳聚糖明胶复合电导材料及其制备方法
CN109481393A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 合肥工业大学 一种电荷反转介导的可注射型胶体粒药物凝胶缓释植入剂及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150366900A1 (en) * 2013-02-05 2015-12-24 University Health Network Conductive biomaterial for enhancement of conduction in vitro and in vivo
CN103757917A (zh) * 2014-01-26 2014-04-30 江汉大学 一种具有电活性的壳聚糖基复合材料的制备方法
CN105617459A (zh) * 2016-03-23 2016-06-01 苏州卫生职业技术学院 一种纳米聚吡咯甲壳素神经导管的制备方法
CN106810636A (zh) * 2016-12-29 2017-06-09 华中科技大学 肿瘤微环境智能响应的纳米凝胶及纳米凝胶载药系统
CN107137765A (zh) * 2017-04-24 2017-09-08 武汉理工大学 聚吡咯生物导电水凝胶及其制备方法和应用
CN107715170A (zh) * 2017-11-28 2018-02-23 山西医科大学第医院 一种3d聚吡咯壳聚糖明胶复合电导材料及其制备方法
CN109481393A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 合肥工业大学 一种电荷反转介导的可注射型胶体粒药物凝胶缓释植入剂及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO HUANG 等: "Self-assembly of polypyrrole/chitosan composite hydrogels", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 *
JIAYOU JI 等: "Fabrication of Polypyrrole/Chitosan Nanocomposite Aerogel Monolith for Removal of Cr(VI)", 《J POLYM ENVIRON》 *
X. ZHANG 等: "Surface Electric Properties of Polypyrrole in Aqueous", 《LANGMUIR》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115254059A (zh) * 2022-08-11 2022-11-01 河南省煤炭地质勘察研究总院 一种用于高效去除废水中六价铬离子的壳聚糖/edta/聚吡咯吸附材料及其制备方法
CN115254059B (zh) * 2022-08-11 2023-07-25 河南省煤炭地质勘察研究总院 一种用于高效去除废水中六价铬离子的壳聚糖/edta/聚吡咯吸附材料及其制备方法

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