CN115634214A - 一种可注射水凝胶/多酚miRNA载体缓释体系及其制备方法和用途 - Google Patents
一种可注射水凝胶/多酚miRNA载体缓释体系及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可注射水凝胶/多酚miRNA载体缓释体系及其制备方法和用途，属于生物医药领域。本发明首先提供了一种可注射、可自增强、具有pH炎症响应特性的水凝胶，以及一种可以实现抗炎和miRNA递送双重作用的miRNA载体，将可注射水凝胶与多酚纳米颗粒相结合，能够构建一种可注射、自增强、具有pH炎症响应特性、可智能化给药的miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎和促进ECM再生的效果，可有效促进退变髓核再生、修复。本发明为退变髓核修复提供新思路，最终避免手术带来的风险和巨大的经济花费，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可注射水凝胶/多酚miRNA载体缓释体系及其制备方法和用途。
背景技术
随着社会老龄化的不断加重，脊柱退变性疾病(如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症等)发病率不断增高，腰腿痛已成为发病率最高的疼痛性疾病之一。据报道，全球腰腿痛患病率高达12％；一项WHO调查显示，37％的青少年每月会至少出现一次腰痛。脊柱的退变是源于椎间盘的退变(变性、失水)，椎间盘由内部的髓核和周围包围的纤维环组成。随着脊柱退变性疾病的不断进展，常规保守治疗仅能部分缓解临床症状，大部分患者不得不最终接受手术治疗。虽然目前针对脊柱退变性疾病的手术方式众多，并且不断趋近微创化，但无论何种手术方式都无法克服如手术损伤、术后复发、邻近节段退变加速、远期疗效不确切等问题，这无疑给个人和社会带来沉重的经济、社会负担。针对椎间盘退变初期的患者，尤其是仅表现为盘源性腰痛的患者，如果能通过某种方式延缓甚至逆转椎间盘退变进程，将从源头上减少脊柱退变性疾病的发生。随着生物工程技术的发展，通过髓核组织工程技术，实现椎间盘髓核再生、修复已成为可能。
通过构建可以作为细胞和生物大分子(药物、细胞因子、miRNA等)转运载体的髓核替代生物诱导支架材料，结合再生医学为代表的生物医学工程技术，使退变髓核组织再生成为可能。髓核生物医学工程策略的目标是抑制内部炎症反应、促进髓核细胞再生、恢复ECM合成/分解代谢平衡，最终真正恢复椎间盘的生理功能并满足生物力学需求。在这个过程中，髓核替代支架材料的选择处于核心地位。理想的髓核替代支架材料除了具有常规生物材料必须的性能外(如良好的生物安全性和可降解性、与天然髓核相似的生物力学特性、可注射性)，还应能够适应髓核内部微环境变化并智能调控其生物学活性。但是大量研究结果显示，由于椎间盘内组织结构复杂、血供极差、力学环境复杂，现有材料如天然材料：脱细胞基质、藻酸盐、多肽水凝胶，以及人工合成材料：透明质酸、PLGA等，都不能很好地满足体外功能化髓核的构建要求。在国际上，已有大量科学家通过一些包括纤维蛋白凝胶(GelfoamTM)，透明质酸海绵(
HYAFF)以及多肽水凝胶
等在内的可以搭载细胞生长的髓核替代支架材料产品进行临床前期研究，但是仍然没有一款成熟的功能化髓核内药物递送产品应用于临床。
近年来，人们不断的尝试利用微球、纳米胶束、外泌体、脱细胞基质等递药体系作为髓核替代支架材料，但由于缺乏力学属性、制备工艺复杂、原材料昂贵等局限，始终无法满足上述全部需求。水凝胶材料近年来持续受到关注，并广泛应用于各种组织修复领域。可注射水凝胶固有的渗透性、吸水性、可降解性、良好的生物相容性，以及巨大的载药控释能力和力学支撑潜力，在髓核替代支架材料的选择中具有巨大的应用潜力。然而，可注射水凝胶作为药物递送载体应用于椎间盘再生存在注射后水凝胶材料外渗的潜在风险。因此，需要研究一种可注射性好，并且注射后可以自增强的水凝胶。同时，该水凝胶最好能够具有pH和ROS双响应的炎症响应特性，可以迅速对炎症微环境的变化和刺激进行感知和响应，精准可控的将药物释放于疾病部位。
此外，MicroRNA(miRNA)是一类由18-24个核苷酸序列组成的小型非编码RNA，广泛存在于真核生物中，并参与基因调节。成熟的miRNA在细胞质中引导RISC复合体(miRISC)靶向3’-UTR区域中带有部分互补序列的mRNA，导致转录沉默或mRNA降解，进而调控细胞的多种生理活动。miRNA调节失衡在椎间盘退变的发生过程中扮演着重要角色。大量的研究表明，多种miRNAs表达异常将导致髓核内部细胞炎症、ECM降解、髓核细胞凋亡等，并通过不同作用机制加速椎间盘髓核退变。因此，寻找并探索miRNAs作用靶点和规律，并通过miRNAs基因治疗的方法调节髓核细胞功能，在退变椎间盘髓核修复中具有巨大的应用前景。
miRNAs基因治疗可根据miRNAs自身表达情况分为miRNAs缺乏时的miRNA替代疗法以及过表达时的miRNA抑制疗法。然而，无论哪种方法，如何将外源miRNA或miRNA抑制剂精准、稳定的转运到靶区域是miRNA基因治疗退变髓核成败的关键。基于椎间盘内无血管的特殊结构特点，以及miRNAs全身递送的诸多局限(如靶器官外异常聚集、靶器官局部低生物活性及多次用药等)，miRNAs全身递送的方法并不适用于髓核的miRNAs基因治疗。然而，由于椎间盘髓核特殊的封闭结构，单纯局部注射miRNAs又会导致局部浓度过高、转染效率不足、清除率过快等一系列问题。目前miRNA载体又存在装载效率不足、不稳定、制备复杂、生物免疫原性和无法实现智能长效缓释等不足。因此，寻找一种适合椎间盘盘内局部递送miRNAs的转运载体，并结合炎症响应型水凝胶共同构建智能miRNAs递药系统，在退变髓核miRNAs基因治疗中具有重大的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可注射水凝胶/多酚miRNA载体缓释体系及其制备方法和用途。
本发明提供了一种载microRNA的纳米粒子，它是由如下重量配比的原料制备而成：
多酚纳米粒子2～4份、microRNA 1份。
进一步地，前述的纳米粒子是由如下重量配比的原料制备而成：
多酚纳米粒子3份、microRNA 1份。
进一步地，所述多酚纳米粒子是按照如下制备方法制备而成：
(1)称取多酚，并溶解于水溶液中，得多酚溶液；
(2)在多酚溶液中加入氧化剂，得混合溶液；
(3)将步骤(2)混合溶液搅拌，得到多酚纳米粒子；
优选地，
步骤(1)中，所述多酚溶液的浓度为1～5mg/ml；
和/或，步骤(2)中，所述混合溶液中氧化剂的浓度为1～5mM；
和/或，步骤(3)中，所述搅拌为在60～100℃油浴中搅拌10～60min；
更优选地，
步骤(2)中，所述氧化剂为MnSO4或MnCl2。
进一步地，所述多酚为单宁酸；和/或，所述microRNA为antagomir-21。
本发明还提供了前述的纳米粒子的制备方法，它包括如下步骤：
将多酚纳米粒子与microRNA在溶剂中混合搅拌后而得。
本发明还提供了一种水凝胶前驱体，它含有如下重量分数的组分：
丙炔酸改性的聚乙二醇0.1～1份、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖溶液0.1～1份；
优选地，它含有如下重量分数的组分：
丙炔酸改性的聚乙二醇0.1份、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖溶液0.15份。
进一步地，
所述丙炔酸改性的聚乙二醇由聚乙二醇、丙炔酸和对甲苯磺酸一水合物为原料制备而成，所述聚乙二醇、丙炔酸和对甲苯磺酸一水合物的摩尔比为1～10：40～50：1～10；
和/或，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖由甲基丙烯酸缩水甘油酯和羧甲基壳聚糖为原料制备而成，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯和羧甲基壳聚糖的质量比为0.1～1：2；
优选地，
所述丙炔酸改性的聚乙二醇分子的制备方法包括如下步骤：将聚乙二醇、丙炔酸和对甲苯磺酸一水合物溶于有机溶剂中，搅拌并去除水分后，冻干，并重结晶，即得；
和/或，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖的制备方法包括如下步骤：将甲基丙烯酸缩水甘油酯和羧甲基壳聚糖溶于溶剂中，搅拌至无可见CMC液滴，透析、冻干，即得。
进一步地，前述的水凝胶前驱体还含有如下重量份数的组分：
巯基化改性的前述的纳米粒子0.01～0.05份；
优选地，它还含有如下重量份数的组分：
巯基化改性的前述的纳米粒子0.01份。
进一步地，所述巯基化改性的前述的纳米粒子按照如下所述方法制备：
将巯基-聚乙二醇-苯硼酸溶液加入纳米粒子溶液中，搅拌后，即得。
本发明还提供了一种可注射水凝胶，它是由前述的水凝胶前驱体固化反应而成；
优选地，所述固化反应的条件是在20～30℃静置12～24小时。
本发明还提供了前述的可注射水凝胶在制备退变髓核修复材料中的用途。
进一步地，所述退变髓核修复材料是髓核替代材料和/或促髓核再生材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)为了解决髓核替代支架材料的问题，本发明利用胺-炔点击化学反应缓慢的特点，设计了一种具有“注射后原位成胶”特点的水凝胶，该水凝胶以液体的形式注射到椎间盘内部，而后自发再次成胶，这种成胶时间和机械强度可调的水凝胶构建模式，将很好的用于椎间盘再生中，具有防止渗漏及增强脊柱稳定性的作用。同时，研究发现该水凝胶还具有pH响应的炎症响应特性，载药后可根据髓核内部的不同炎症程度释放内部的药物，实现智能给药。
(2)为了解miRNA转运载体的问题，本发明设计了一种多酚纳米颗粒作为载体实现miRNA的装载，从而实现miRNA椎间盘内高效递送，同时，多酚纳米颗粒在实现装载miRNA的同时，本身也有强大的抗氧化潜能，从而实现抗炎+miRNA递送双重作用。
(3)本发明将多酚纳米颗粒装载在可注射水凝胶中，最终构建出一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化给药的椎间盘内miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎抗氧化和促进ECM再生的效果，具有优异的促进退变髓核再生、修复的功效。
综上，本发明首先提供了一种可注射水凝胶，该可注射水凝胶植入退变髓核内部后可以自发的增强自身模量，起到充分填充和避免渗漏的作用，同时该水凝胶具有pH响应的炎症响应特性，载药后可根据髓核内部的不同炎症程度释放内部的药物，实现智能给药。其次，本发明提供了一种可以载miRNA的多酚纳米颗粒，该纳米颗粒可以实现抗炎和miRNA递送双重作用，既具有抗炎作用，又可以促进ECM再生，促进退变髓核修复。本发明将可注射水凝胶与多酚纳米颗粒相结合，最终构建一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化给药的miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎和促进ECM再生的效果，可有效促进退变髓核再生、修复。本发明为退变髓核修复提供新思路，最终避免手术带来的风险和巨大的经济花费，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为TANPs@antagomir-21制备过程中的理化特性研究结果；其中，A为SH/TANPs@antagomir-21合成流程示意图；B为纳米颗粒的SEM扫描结果，比例尺为500nm；C为TANPs的全扫描XPS测量光谱；D为C1s的XPS高分辨率光谱；E为O1S的XPS高分辨率光谱；F为TA和TANPs的FTIR光谱；G为PBS中纳米粒子的粒度分布；H为纳米粒子的大小和zeta电位值，插图显示了不同NPs的丁达尔效应；I为SH/TANPs@ant的TEM和HAADF-STEM图像，比例尺为200nm；J为TANPs、SH-PEG-BA和SH/TANPs的1H NMR谱；K为TANPs、SH-PEG-BA和SH/TANPs的UV-vis吸收图；L为封装在TANPs中的Cy3-antagomir-21引起了Cy3荧光的猝灭；M为电泳迁移率偏移分析研究TANPs与antagomir-21之间的相互作用；图中，*P<0.05。
图2为本发明水凝胶的理化特性研究结果；其中，A为水凝胶合成过程和炎症反应性释放机制的示意图；B为CMC和CMC-GMA的1H NMR谱；C为CMC和CMC-GMA的FTIR光谱；D为DA-PEG的1H NMR光谱；E为DA-PEG的FTIR光谱；F为水凝胶形成过程及其pH响应特性；G为CMC-GMA/DA-PEG水凝胶的SEM图像；H为水凝胶的储存模量(G')和损耗模量(G”)随时间变化流变检测结果；I为不同水凝胶频率扫描结果；J为字母模具内和粗糙橡胶表面的凝胶过程图像；K为注入微针模型的不同水凝胶的图像(通过显微镜拍摄)；L为将前体溶液注入椎间盘内部的示意图以及凝胶化后抗渗漏的效果。
图3为CMC-GMA(3％)(10:1)和CMC-GMA(3％)(10:2)通过1％应变的流变分析，在37℃下不同频率下水凝胶的储存(G’)和损失(G”)模量。
图4为本发明水凝胶的生物相容性、可降解性及基因缓释效果检测结果；其中，A为用水凝胶处理24和48小时后L929细胞的存活率；B为活死染色结果；C为水凝胶溶血试验的溶血率和照片；D为水凝胶清除DPPH的百分比；E为水凝胶在PBS和pH 5.5条件下的体外降解结果以及不同时间的图像；F为在各种条件下从水凝胶中释放antagomir-21的结果；G为pH5.5下不同水凝胶中antagomir-21的释放；H为注射入椎间盘后cy3-antagomir-21水凝胶的实时荧光成像；I为Living Image计算的半定量分析；J为通过Cy3免疫荧光(标尺，20μm)观察不同时间点培养髓核细胞(NPC)的Cy3-antagomir-21转染；K为通过TEM观察NPC中的内化的TANPs(比例尺，1μm)；L为cy3-antagomir-21(荧光观察)和TANPs(明场观察)的合并图像(标尺，20μm)；M为通过RT-PCR检测不同干预后NPCmiRNA-21表达情况；图中，*P<0.05，**P<0.01，ns无显著性差异。
图5为本发明促进髓核细胞ECM再生作用和抗炎作用；A为水凝胶的三维重建共聚焦显微镜图像(标尺，20μm)；B为经水凝胶处理24小时和48小时后，TBHP刺激NPC活性；C为水凝胶处理24h后NPC的活/死染色(标尺，50μm)；D为使用水凝胶处理后，使用qRT-PCR分析ColII、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS4、TNF-α和NF-kB基因表达水平；E为Western blotting检测各组Col II、MMP-13、TNF-α和NF-kB的蛋白表达；F为不同组中代表Western blot强度的热图结果；G为免疫荧光染色检测各组Col II、MMP-13、TNF-α和NF-kB的蛋白表达，DFCH-DA染色后TBHP刺激的NPC中ROS生成的共聚焦图像(比例尺，50μm)；图中，*P<0.05，**P<0.01，ns无显著性差异。
图6为本发明水凝胶对大鼠椎间盘退变治疗效果体内鉴定结果；其中，A为通过建立大鼠椎间盘退变模型，并植入不同水凝胶，4、8周观察退变髓核修复效果示意图；B为术后4、8周X光扫描结果；C为术后4、8周MRI扫描结果；D和E为椎间盘高度指数(DHI)在不同组不同时间点的变化趋势；F为不同治疗组不同时间的MRI分级结果；G为HE染色，番红O-固绿染色及ColII、MMP-13、TNF-α免疫组化染色结果；H为定量观察组织学分级结果；I为不同组免疫组化定量分析结果；图中，*P<0.05，**P<0.01，ns无显著性差异。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
antagomir-21是一种人工合成的miRNA序列，是一种胆固醇修饰的miRNA抑制剂，作为miRNA-21抑制剂，可通过购买市售产品获得，本具体实施方式中使用的antagomir-21是从吉玛基因公司购买的。
本发明中，如果没有特殊说明，所述的溶液均为水溶液。
实施例1、包载多酚纳米颗粒的可注射水凝胶的制备
1、载antagomir-21的单宁酸纳米颗粒(TANP@antagomir-21)的合成单宁酸纳米颗粒(TANPs)的合成
单宁酸纳米粒子(TANPs)的合成：称取单宁酸(TA)并溶解于HEPES缓冲液中(浓度为4mg/ml)，逐滴加入MnSO4溶液并使MnSO4终浓度为2mM，上述混合溶液于60℃油浴中充分搅拌30分钟，离心并冲洗，0.22μm滤头过滤并冻干，制备得到TANPs。
TANPs@antagomir-21的制备：溶解TANPs于水中(6mg/ml)，并吸取100μl逐滴加入150μl antagomir-21溶液(20μM)中，此时，TANPs和antagomir-21的质量比为3:1w/w，再逐滴加入750μl HEPES缓冲液并常温持续搅拌24h，离心后将TANPs@antagomir-21(TANPs@ant)收集备用。
SH/TANPs@antagomir-21制备：将1ml SH-PEG-BA(巯基-聚乙二醇-苯硼酸)溶液(20mg/ml)逐滴缓慢加入9ml TANPs@antagomir-21溶液中(1mg/ml)并剧烈搅拌，超声打散，充分离心过滤后收集SH/TANPs@antagomir-21(SH/TANPs@ant)。
2、CMC-GMA(羧甲基壳聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯)的合成
5ml GMA溶液(424mM)逐滴加入100ml CMC溶液(2％w/v)并50℃水浴充分搅拌6小时，无可见CMC液滴时反应结束，充分透析并冻干收集CMC-GMA。
3、DA-PEG(丙炔酸-聚乙二醇)的合成
将PEG(10.0g，5mmol，分子量为2000)、丙炔酸(3.5g，50mmol)和对甲苯磺酸一水合物(p-TSA)(0.57g，3mmol)溶解于干甲苯(150mL)中。充分搅拌并回流48小时去除多余水分，充分冻干后溶解与水中，使用乙醚沉淀，并用异丙醇重结晶，得到的DA-PEG干燥保存使用。
4、制备装载TANP@antagomir-21的可注射水凝胶体系
500μl DA-PEG溶液(20％w/v)逐滴加入5ml CMC-GMA溶液中(3％w/v)并持续搅拌，此后溶液中逐滴加入200μl SH/TANPs@antagomir-21溶液(5％w/v)制成水凝胶前体溶液。此前体溶液置于容器中静置孵育24小时(37℃)后，自发形成水凝胶。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、TANPs@antagomir-21的理化特性
1、实验方法
采用SEM观察实施例1制备的TANPs@ant和SH/TANPs@ant的形貌；
对实施例1制备的TANPs进行全扫描XPS测量；
对原料TA和实施例1制备的TANPs进行FTIR检测；
将实施例1制备的TANPs、TANPs@ant和SH/TANPs@ant放入PBS中，放置2h后，使用DLS检测纳米颗粒的粒径和Zeta电位，并观察不同粒子的丁达尔效应；
采用TEM和HAADF-STEM观察实施例1制备的SH/TANPs@ant的形貌；
对原料SH-PEG-BA以及实施例1制备的TANPs和SH/TANPs进行核磁共振1H NMR谱检测以及UV-vis吸收检测；
将Cy3连接的antagomir-21按照实施例1所述方法包裹在TANPs内，采用酶标仪检测antagomir-21溶液中Cy3荧光强度，TANPs加入量依次为0mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml增加，观察随TANPs加入量增多，antagomir-21溶液中Cy3的荧光强度，荧光强度逐渐降低，说明Cy3-antagomir-21被包裹入TANPs中。
采用实施例1所述方法，将TANPs和antagomir-21按照不同质量比(0、0.5、1、2、3、5、8、10)制备TANPs@ant，采用电泳迁移率偏移分析研究TANPs@ant中TANPs与antagomir-21之间的相互作用，具体方法如下：
(1)制备1％琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1％琼脂糖凝胶液；
(2)胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子，将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液加入5μlEB(或者其他核酸染料)溶液，混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止；
(3)加样：在点样板上不同比例TANPs@ant样品和上样缓冲液2.5μl的1x loadingbuffer，样本上样7.5μl，混匀后，用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面，注意加样前要先记下加样的顺序；
(4)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压190V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；
(5)观察照相：电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
2、实验结果
TANPs@antagomir-21的理化特性结果如图1所示：
图1B为TANPs@ant和SH/TANPs@ant的SEM图片，该结果说明TANPs@ant为大小均一的球形纳米级结构，被巯基化修饰后，纳米粒子直径稍增大。
图1C、1D和1E为TANPs的XPS测量结果，该结果说明TANPs已成功制备，并且是通过分子自我氧化聚合自组装形成。
图1F为TANPs的FTIR图谱，该结果说明相对于TA分子，TANPs红外扫描出现更明显的C＝O和C＝C，提示TANPs合成成功。
图1G为PBS中各纳米粒子的粒度分布，说明本发明制备的纳米粒子均一性好。
图1H为各纳米粒子的大小和zeta电位值，该结果说明随着TANPs包裹antagomir-21以及巯基化后，其粒子直径逐渐变大，电负性增强。
图1I为SH/TA NPs@ant的TEM和HAADF-STEM图像，该结果说明TANPs粒子成功合成，微观结构为直径150-200nm的纳米球形颗粒。
图1J和1K为TANPs、SH-PEG-BA和SH/TANPs的1H NMR谱和UV-vis吸收图谱，该结果说明SH/TANPs成功制备。
图1L显示封装在TANPs中的Cy3-antagomir-21引起了Cy3荧光的猝灭，该结果说明Cy3-antagomir-21会被TANPs装载，并且表现为浓度依赖性。
图1M说明了当TANPs/antagomir-21的质量比达到3：1时，TANPs装载效率达到饱和，因此制备纳米粒子时TANPs和antagomir-21的质量比为3:1最佳。
试验例2、本发明水凝胶的理化特性
1、实验方法
对原料CMC以及实施例1制备的CMC-GMA和DA-PEG进行核磁共振、FTIR检测。
按照实施例1所述方法将DA-PEG溶液和CMC-GMA溶液混合，不加入SH/TANPs@antagomir-21，静置孵育24小时后形成结构稳定的CMC-GMA/DA-PEG水凝胶(Hydrogel)，然后在对凝胶中加入pH为5的HCl溶液，然后观察水凝胶的状态。
观察上述制备的CMC-GMA/DA-PEG水凝胶的SEM形貌。
将上述水凝胶前驱体分别注射到字母模具内和粗糙橡胶表面上，观察成型后的水凝胶。
将上述水凝胶前驱体注射到微针模型中，使用显微镜拍摄凝胶形貌。
采用实施例1所述方法将DA-PEG溶液和CMC-GMA或CMC溶液混合，不加入SH/TANPs@antagomir-21，静置孵育24小时后形成水凝胶，CMC-GMA或CMC溶液和DA-PEG溶液的体积比分别为10:1和10:2；CMC-GMA的浓度分别为3％、1％和0.3％，CMC的浓度为3％。对各水凝胶进行流变学测试，同时比较各水凝胶的成胶时间。
2、实验结果
水凝胶的理化特性结果如图2所示：
图2B和2C为CMC和CMC-GMA的1H NMR谱和FTIR光谱，该结果说明GMA已成功接枝到CMC侧链。
图2D和2E为DA-PEG的1H NMR谱和FTIR光谱，该结果说明DA-PEG已成功合成。
图2F说明本发明制备的水凝胶具有pH响应性，在炎性pH值环境下可溶解，进一步说明本发明水凝胶作为可以实现智能给药。
图2G为本发明水凝胶的SEM图像，该结果说明水凝胶表现为多孔微观结构，空洞大小均一，维持在100-300um左右。
图2H、2I和图3为流变学测试结果，表1给各水凝胶的成胶时间。该结果说明本发明水凝胶前驱体具有良好的可注射性，形成水凝胶后模量显著增强，具有自增强效应，作为髓核修复材料可以起到充分填充和避免渗漏的作用；同时，通过调节CMC-GMA溶液和DA-PEG溶液的配比可以调控弹性模量和成胶时间。此外，未改性CMC制备的水凝胶模量比GMA改性CMC制备的水凝胶差。
表1.各水凝胶的成胶时间
图2J说明水凝胶注射入椎间盘内部后的示意图，说明以水凝胶前液形式注入椎间盘内部后，水凝胶前液可以很好的填充到水凝胶内部每个角落，逐渐成胶后，可以起到充分填充，并且防止渗漏的作用。
图2K说明与Gelatin-BA/TA水凝胶相比，本水凝胶可以通过“成胶后于注射”模式实现微针模具的充分填充(模拟椎间盘内部微小空隙)。Gelatin-BA/TA水凝胶是拿明胶(Gelatin)接枝苯硼酸(BA)分子后，与单宁酸(TA)溶液自发成胶形成的水凝胶。
上述结果说明本发明水凝胶可以通过液体的形式注射到椎间盘内部，而后自发原位成胶，可防止渗漏、增强脊柱稳定性；同时，本发明水凝胶具有pH响应的炎症响应特性，可实现智能给药。
试验例3、本发明水凝胶的生物相容性、可降解性及基因缓释效果检测
1、实验方法
本试验例中Hydrogel为按照实施例1所述方法将DA-PEG溶液和CMC-GMA溶液混合，不加入SH/TANPs@antagomir-21，静置孵育24小时后形成结构稳定的CMC-GMA/DA-PEG水凝胶(Hydrogel)；Hydrogel/TANPs@ant为实施例1制备得到的载SH/TANPs@antagomir-21的水凝胶。
(1)细胞实验：选择大鼠L929细胞培养验证本发明水凝胶生物相容性，L929细胞与水凝胶浸提液共培养24、48小时后通过CCK-8吸光度计算细胞活性，同时通过活死荧光染色观察细胞存活情况。
(2)溶血实验：稀释大鼠红细胞悬液后，加入不同组冻干水凝胶粉末，并设置PBS溶液及Trizon试剂作为对照组，充分混合2h后，离心，观察红细胞形态，并通过不同组吸光度计算红细胞溶解结果。
(3)清除DPPH：冻干不同组分水凝胶后研磨成粉，100μM DPPH中加入不同组水凝胶并于3ml甲醇中分散，充分搅拌并孵育30分钟，并将样品通过UV-vis紫外光谱仪检测吸光度，计算DPPH清除效率。
(4)pH响应研究：将Hydrogel放在不同溶液中(PBS溶液，pH5.5的HCl溶液)，观察不同时间水凝胶的降解程度。
同时将实施例1制备得到的载SH/TANPs@antagomir-21的水凝胶放在不同溶液中(PBS溶液，pH5.5的HCl溶液，pH5.5的HCl溶液加上100μM的H2O2)，观察不同时间后水凝胶中释放antagomir-21的结果；
(5)水凝胶动物体内实时成像观察：将不同组装载Cy3-antagomir-21的水凝胶(装载游离Cy3-antagomir-21或Cy3-antagomir-21纳米粒子)或PBS溶液分别注入大鼠不同节段椎间盘内部(Co 2/3,4/5,6/7)，分别于不同时间点通过小动物实时荧光仪IVISSpectrum system(PerkinElmer,USA)观察荧光强度。
2、实验结果
本发明水凝胶的生物相容性、可降解性及基因缓释效果检测结果如图4所示。
图4A、4B和4C可知本发明水凝胶具有良好的生物相容性。
图4D为水凝胶清除DPPH的百分比，该结果说明本发明水凝胶本身基本没有抗氧化活性，而包载单宁酸纳米颗粒后水凝胶抗氧化活性显著提高，进一步说明本发明单宁酸纳米颗粒具有良好的抗氧化活性。
图4E、4F和4G可知本发明水凝胶具有良好的pH响应性，在炎性pH值环境下降解速度加快，进一步说明本发明水凝胶作为可以实现智能给药。
图4H和4I为注射入椎间盘后Cy3-antagomir-21水凝胶的实时荧光成像和LivingImage计算的半定量分析结果，这些结果说明水凝胶装载TANPs@ant可以很好的实现antagomir的保护作用及缓释效果。
图4J的结果说明随着时间的延长，转染到细胞内的antagomir-21逐渐增多，转染效率高。
图4K的结果说明细胞TEM显示TANPs转运至细胞内。
图4L的结果说明通过荧光显微镜及明场下观察，可以证实antagomir-21随TANPs一道转运至细胞内。
图4M的结果说明在TANPs的帮助下，antagomir-21转染效率相对于传统antagomir-21高，可以很好的抑制miRNA-21表达。
试验例4、本发明水凝胶的促进髓核细胞ECM再生作用和抗炎作用
1、实验方法
本部分为提取大鼠椎间盘髓核细胞后，通过TBHP(叔丁基过氧化氢)建立体外髓核细胞退变模型，并给与不同治疗，通过PCR，免疫荧光染色及Western blot鉴定ECM合成基因COL II、Aggrecan及ECM分解基因MMP-13、ADAMTS4的表达。
2、实验结果
图5为水凝胶促进髓核细胞ECM再生作用和抗炎作用结果：
图5A说明了TANPs@ant在水凝胶中均匀分布。
图5B说明了TBHP刺激后的髓核细胞在水凝胶共培养后，可以很好的避免因为氧化应激的刺激而产生的自我凋亡。
图5C说明了活死免疫荧光扫描，证实水凝胶共培养后，明显减少了TBHP诱导的死细胞数量。
图5D说明了通过装载TANPs@ant的水凝胶治疗髓核细胞后，ECM再生基因高表达，并充分抑制ECM分解基因的表达。
图5E、5F、5G说明了通过装载TANPs@ant的水凝胶治疗髓核细胞后，ECM再生蛋白高表达，并充分抑制ECM分解蛋白的表达。
上述试验结果说明本发明水凝胶体系可显著促进髓核细胞ECM再生，帮助髓核修复。
试验例5、本发明水凝胶大鼠椎间盘退变治疗效果体内鉴定
1、实验方法
本部分通过对大鼠椎间盘穿刺，建立动物椎间盘退变模型，同时，给予退变椎间盘内进行不同治疗(control正常椎间盘，NC注入PBS治疗，antagomir-21即只注入antagomir-21溶液，TANPs@ant即注入TANPs@ant溶液，及包含TANPs@ant的水凝胶治疗)，分别于4周及8周后通过X线、MRI扫描以及组织学评估(HE染色，番红O-固绿染色，及免疫组化染色)。
2、实验结果
图6为水凝胶大鼠椎间盘退变治疗效果结果：
图6B为术后4、8周X光扫描结果，说明Hydrogel/TANPs@antagomir-21组可以有效恢复椎间隙高度，效果优于使用游离的antagomir-21以及antagomir-21纳米颗粒。
图6C为术后4、8周MRI扫描结果，说明Hydrogel/TANPs@antagomir-21组可以有效增加髓核含水量，恢复髓核MRI信号，修复效果最佳。
图6D和6E为椎间盘高度指数(DHI)在不同组不同时间点的变化趋势，该结果说明通过治疗，hydrogel/TANPs@ant表现出最佳的DHI恢复效果。
图6F为不同治疗组不同时间的MRI分级结果，该结果说明通过治疗，hydrogel/TANPs@ant表现出最佳的MRI分级降低效果。
图6G为HE染色，番红O-固绿染色及ColII、MMP-13、TNF-α免疫荧光染色，说明Hydrogel/TANPs@antagomir-21组退变髓核修复效果最佳。
图6H为定量观察组织学分级，图6I为不同组免疫组化定量分析结果，这些结果也同样说明Hydrogel/TANPs@antagomir-21组退变髓核修复效果最佳。
综上，本发明首先提供了一种可注射水凝胶，该可注射水凝胶植入退变髓核内部后可以自发的增强自身模量，起到充分填充和避免渗漏的作用，同时该水凝胶具有pH响应的炎症响应特性，载药后可根据髓核内部的不同炎症程度释放内部的药物，实现智能给药。其次，本发明提供了一种可以载miRNA的多酚纳米颗粒，该纳米颗粒可以实现抗炎和miRNA递送双重作用，既具有抗炎作用，又可以促进ECM再生，促进退变髓核修复。本发明将可注射水凝胶与多酚纳米颗粒相结合，最终构建一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化给药的miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎和促进ECM再生的效果，可有效促进退变髓核再生、修复。本发明为退变髓核修复提供新思路，最终避免手术带来的风险和巨大的经济花费，具有良好的应用前景。
Claims (12)
1.一种载microRNA的纳米粒子，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：
多酚纳米粒子2～4份、microRNA 1份。
2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：
多酚纳米粒子3份、microRNA 1份。
3.根据权利要求1或2所述的纳米粒子，其特征在于：所述多酚纳米粒子是按照如下制备方法制备而成：
(1)称取多酚，并溶解于水溶液中，得多酚溶液；
(2)在多酚溶液中加入氧化剂，得混合溶液；
(3)将步骤(2)混合溶液搅拌，得到多酚纳米粒子；
优选地，
步骤(1)中，所述多酚溶液的浓度为1～5mg/ml；
和/或，步骤(2)中，所述混合溶液中氧化剂的浓度为1～5mM；
和/或，步骤(3)中，所述搅拌为在60～100℃油浴中搅拌10～60min；
更优选地，
步骤(2)中，所述氧化剂为MnSO4或MnCl2。
4.根据权利要求1或2所述的纳米粒子，其特征在于：所述多酚为单宁酸；和/或，所述microRNA为antagomir-21。
5.权利要求1～4任一项所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将多酚纳米粒子与microRNA在溶剂中混合搅拌后而得。
6.一种水凝胶前驱体，其特征在于：它含有如下重量分数的组分：
丙炔酸改性的聚乙二醇0.1～1份、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖溶液0.1～1份；
优选地，它含有如下重量分数的组分：
丙炔酸改性的聚乙二醇0.1份、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖溶液0.15份。
7.根据权利要求6所述的水凝胶前驱体，其特征在于：
所述丙炔酸改性的聚乙二醇由聚乙二醇、丙炔酸和对甲苯磺酸一水合物为原料制备而成，所述聚乙二醇、丙炔酸和对甲苯磺酸一水合物的摩尔比为1～10：40～50：1～10；
和/或，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖由甲基丙烯酸缩水甘油酯和羧甲基壳聚糖为原料制备而成，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯和羧甲基壳聚糖的质量比为0.1～1：2；
优选地，
所述丙炔酸改性的聚乙二醇分子的制备方法包括如下步骤：将聚乙二醇、丙炔酸和对甲苯磺酸一水合物溶于有机溶剂中，搅拌并去除水分后，冻干，并重结晶，即得；
和/或，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖的制备方法包括如下步骤：将甲基丙烯酸缩水甘油酯和羧甲基壳聚糖溶于溶剂中，搅拌至无可见CMC液滴，透析、冻干，即得。
8.根据权利要求6所述的水凝胶前驱体，其特征在于：它还含有如下重量份数的组分：
巯基化改性的权利要求1～4任一项所述的纳米粒子0.01～0.05份；
优选地，它还含有如下重量份数的组分：
巯基化改性的权利要求1～4任一项所述的纳米粒子0.01份。
9.根据权利要求8所述的水凝胶前驱体，其特征在于：所述巯基化改性的权利要求1～4任一项所述的纳米粒子按照如下所述方法制备：
将巯基-聚乙二醇-苯硼酸溶液加入纳米粒子溶液中，搅拌后，即得。
10.一种可注射水凝胶，其特征在于：它是由权利要求6～9任一项所述的水凝胶前驱体固化反应而成；
优选地，所述固化反应的条件是在20～30℃静置12～24小时。
11.权利要求10所述的可注射水凝胶在制备退变髓核修复材料中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述退变髓核修复材料是髓核替代材料和/或促髓核再生材料。
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| CN109762210A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-05-17 | 西南交通大学 | 一种作电极用的自粘性导电水凝胶的制备方法 |
| CN114605676A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-06-10 | 四川大学华西医院 | 一种退变髓核修复可注射水凝胶及其用途 |
-
2022
- 2022-11-08 CN CN202211392451.5A patent/CN115634214B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103721293A (zh) * | 2013-07-25 | 2014-04-16 | 天津大学 | 活性因子可控释放的光交联多层梯度水凝胶及制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAN LI等: "Injectable hydrogel with MSNs/microRNA-21-5p delivery enables both immunomodification and enhanced angiogenesis for myocardial infarction therapy in pigs", 《SCI ADV .》, vol. 7, no. 9, 24 February 2021 (2021-02-24), pages 6740 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115634214B (zh) | 2024-03-26 |
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