CN104056300B - 一种多糖-多巴胺复合生物胶及应用 - Google Patents
一种多糖-多巴胺复合生物胶及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多糖-多巴胺复合生物胶及应用，所述生物胶按如下方法制备：在惰性气体氛围中，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠溶于pH值5～6的MES缓冲液，制成EDC混合液，然后将该EDC混合液加入多糖溶液中，在20～30℃反应0.5～1小时，再加入多巴胺溶液，20～30℃继续反应1～4小时，反应物以蒸馏水为透析液透析1～3天，取截留液冷冻干燥，获得多糖-多巴胺复合生物胶；本发明修饰方法简便有效，可增加软骨组织的表面粘性，减少治疗药物或植入细胞的流失，促进软骨损伤的修复。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种生物胶，特别涉及一种可直接粘附于受损软骨表面，促进其他生物活性物质或细胞粘附的生物胶的制备以及其在软骨表面的涂覆方法。
(二)背景技术
软骨由软骨细胞产生的一种特殊的细胞外基质构成，无血液供应，其组成成分主要有透明质酸、硫酸软骨素、II型胶原等。而软骨细胞通常处于骨软骨交界处，数量有限且因细胞外基质的限制，迁移能力很弱。由于软骨的这些特征，导致其在损伤后较难治愈。近年来发展出的“自体软骨细胞移植”(ACI)技术，即提取患者体内的健康软骨细胞经体外培养大量扩增后植入病变区修复病变软骨，其有疗效率在70～85％。但在软骨浅层损伤的治疗中，由于原生软骨表面较差的细胞粘附能力，若直接将种子细胞注射入损伤处，会导致种子细胞大量流失。随着组织工程的发展，多种支架被研发，其可为种子细胞提供良好的生存环境，促进组织修复。但在软骨浅表层损伤中，支架也难以与周围的组织良好的整合，从而导致新生组织与原组织分离，严重影响修复效果。因此，对于浅表层软骨损伤的修复，需要研发一种新的材料，能良好连接软骨组织与植入细胞或生物活性分子。
在此，本发明提供了一种生物相容性良好的生物胶对软骨表面进行改性，增加其对于细胞或其他生物活性分子的粘附能力，从而有效提高修复效果。该生物胶使用软骨细胞外基质中的主要组成成分硫酸软骨素或透明质酸作为主要原料，通过接枝多巴胺增加其组织粘性。硫酸软骨素与透明质酸均为天然多糖，均具有良好的生物相容性、生物可降解性、吸收水分和养分的能力、促进软骨细胞增殖等特性；而多巴胺分子中的儿茶酚基团与氨基团易发生氧化而自聚，可在几乎任何材料表面形成紧密附着的聚多巴胺涂层；同时，其也是体内神经递质的一种，具有良好的生物相容性。因此，可以利用多巴胺的组织粘性制备适用于软骨组织的生物胶，修复浅表层软骨损伤。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种多糖-多巴胺复合生物胶及修复浅表层软骨缺损中的应用，具体是通过化学合成方法成功地在多糖分子上修饰多巴胺，制备出多糖-多巴胺复合物这一新型生物胶，利用多巴胺氧化自聚合性质，在软骨表面形成一层多糖-多巴胺涂层，改善软骨表面细胞及生物活性分子粘附能力差的问题，同时保持软骨表面原有的结构，可有效提高浅表层软骨缺损的修复能力。
本发明采用的技术方案是：
本发明的目的是一种多糖-多巴胺复合生物胶，所述生物胶按如下方法制备(制备过程始终处于惰性气体氛围中)：(1)在惰性气体氛围中，将多糖溶于pH值5～6的MES(吗啉乙磺酸)缓冲液中制成多糖溶液；所述多糖为硫酸软骨素钠盐或透明质酸钠；(2)在惰性气体氛围中，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺钠(sulfo-NHS)溶于pH值5～6的MES缓冲液制成EDC混合液，然后将该EDC混合液加入步骤(1)制备的多糖溶液中，在20～30℃反应0.5～1小时，再向反应液中加入多巴胺溶液，20～30℃继续反应1～4小时，反应物以蒸馏水为透析液，在透析袋中透析1～3天，取截留液冷冻干燥，获得多糖-多巴胺复合生物胶；所述多巴胺溶液是将多巴胺溶于pH值5～6的MES缓冲液制成，所述多糖溶液的用量以多糖质量计，所述多糖与EDC和sulfo-NHS投料质量比为1：0.8～3：0.8～3，所述多巴胺溶液用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量之比为1：0.8～3；所述MES缓冲液的用量对本发明没有影响，通常优选所述EDC混合液体积是多糖溶液体积的1/40～1/100倍，所述多巴胺溶液体积是多糖溶液体积的1/40～1/100倍。
进一步，所述步骤(1)将多糖溶于pH值5～6的MES缓冲液中制成终浓度1～10mg/mL(优选2.5～5mg/mL)的多糖溶液。
进一步，所述步骤(2)所述透析袋的截留分子量为3000～3500或8000～14000。
进一步，所述步骤(2)所述冷冻干燥条件为压力0～20Pa，温度-105～-110℃，时间48～72小时，优选10Pa，温度-105～-110℃，时间48～72小时。
进一步，所述步骤(1)和步骤(2)所述惰性气体均为氮气或氦气，优选氮气。
进一步，步骤(2)所述多糖与EDC和sulfo-NHS投料质量比为1：1～2：1～2(更优选1:1.1:1.2)，所述多巴胺溶液的用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量比为1：1～2(优选1:1.1)。
本发明还提供一种所述多糖-多巴胺复合生物胶在制备表面改性软骨中的应用，所述的应用为：将多糖-多巴胺复合生物胶溶于pH值7.2～7.4的PBS缓冲液中，制成多糖-多巴胺复合生物胶溶液，加入催化剂，混合成生物胶溶液，将生物胶溶液注射到软骨表面至完全覆盖，并于20～30℃放置10～60min，用PBS缓冲液冲洗软骨，即得到表面改性的软骨；所述的多糖-多巴胺生物胶溶液浓度为0.5～25mg/mL；所述催化剂为高碘酸钠溶液或质量浓度1～3％的过氧化氢水溶液，所述高碘酸钠溶液是由5～8mg/mL高碘酸钠水溶液与0.4mol/L的NaOH水溶液以体积比50:1～200:1(优选100:1)混合制成；所述催化剂的体积与多糖-多巴胺复合生物胶溶液体积比为1：100～200。
进一步，将生物胶溶液注射到软骨表面的注射量为50～100μL/cm2。
本发明所述MES缓冲液是指：MES溶于蒸馏水，浓度为0.1M，用1M盐酸或1M氢氧化钠调节pH至5～6。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：采用天然软骨中存在的多糖作为生物胶的主要成分之一，通过修饰多巴胺这一生物活性分子达到增加组织粘性的效果，较含氰基丙烯酸盐的粘合剂、白蛋白-戊二醛粘合剂、纤维蛋白胶粘合剂有更好的生物相容性与生物安全性。该修饰方法简便有效，可增加软骨组织的表面粘性，减少治疗药物或植入细胞的流失，促进软骨损伤的修复。
所述含氰基丙烯酸盐的粘合剂参见文献1-3：
文献1.Leahey,A.B.,Gottsch,J.D.&Stark,W.J.ClinicalexperiencewithN-butylcyanoacrylate(Nexacryl)tissueadhesive.Ophthalmology100,173–180(1993).
文献2.Singer,A.J.etal.Prospective,randomized,controlledtrialoftissueadhesive(2-octylcyanoacrylate)versusstandardwoundclosuretechniquesforlacerationrepair.Stonybrookoctylcyanoacrylatestudygroup.Acad.Emerg.Med.5,94–99(1998).
文献3.Woodward,S.C.etal.Histotoxicityofcyanoacrylatetissueadhesiveintherat.Ann.Surg.162,113–122(1965).
所述白蛋白-戊二醛粘合剂参见文献4-5：
文献4.Herget,G.W.etal.Experimentaluseofanalbumin-glutaraldehydetissueadhesiveforsealingpulmonaryparenchymaandbronchialanastomoses.Eur.J.Cardiothorac.Surg.19,4–9(2001).
文献5.Menon,N.G.,Downing,S.,Goldberg,N.H.&Silverman,R.P.Seromapreventionusinganalbumin-glutaraldehyde-basedtissueadhesiveintheratmastectomymodel.Ann.Plast.Surg.50,639–643(2003).
所述纤维蛋白胶粘合剂参见文献6-8：
文献6.Kjaergard,H.K.,Weis-Fogh,U.S.,Sorensen,H.,Thiis,J.&Rygg,I.Autologousfibringlue–preparationandclinicaluseinthoracicsurgery.Eur.J.Cardiothorac.Surg.6,52–54(1992)discussion54.
文献7.Owen,R.J.etal.Percutaneousablationofaninternaliliacaneurysmusingtissueadhesive.Cardiovasc.Intervent.Radiol.23,389–391(2000).
文献8.Dunn,C.J.&Goa,K.L.Fibrinsealant:Areviewofitsuseinsurgeryandendoscopy.Drugs58,863–886(1999).
(四)附图说明
图1为实施例1硫酸软骨素-多巴胺的1H核磁共振(1HNMR)表征图，曲线a为硫酸软骨素-多巴胺表征图谱，曲线b为硫酸软骨素图谱。
图2为实施例1软骨片扫描电镜照片，A为表面未涂覆生物胶的软骨片，B为涂覆生物胶后的软骨片。
图3为实施例1软骨细胞在软骨表面的贴壁生长的荧光照片，A为未涂覆生物胶软骨片，B为涂覆生物胶的软骨片。
图4为实施例1软骨细胞在软骨表面增殖的定量检测结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：硫酸软骨素-多巴胺复合生物胶及应用
(1)制备硫酸软骨素-多巴胺复合生物胶：在氮气环境中，将200mg硫酸软骨素钠盐(即硫酸软骨素，购自sigma)加入40mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)中，搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。在氮气环境中，将218mgEDC，247mgsulfo-NHS溶于1mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)，完全溶解后，制成EDC混合液；然后在氮气环境中，将EDC混合液加入多糖溶液中，25℃下搅拌反应30min。将216.2mg多巴胺溶于1mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)，加入上述反应液中，25℃、氮气条件下反应120min。将反应后的产物取出，置于透析袋(MWCO3500)中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥(48小时，10Pa，-108℃)，得到硫酸软骨素-多巴胺生物胶203mg，并于4℃避光保存。
硫酸软骨素-多巴胺生物胶的表征：将0.05g硫酸软骨素-多巴胺生物胶溶于5mLD2O，完全溶解后，转入石英核磁管中，于25℃进行1HNMR表征，以硫酸软骨素作为对照，见图1所示，6.5～7.0ppm处新增的峰证明多巴胺被连接到硫酸软骨素表面。
(2)配制催化剂：将83.3mg高碘酸钠溶于10mL蒸馏水中，取1mL，与0.01mL0.4M氢氧化钠水溶液混合。20～25℃避光保存。
(3)软骨表面涂覆硫酸软骨素-多巴胺生物胶：将1mg硫酸软骨素-多巴胺生物胶溶于2mLPBS缓冲液(pH值为7.2，0.15M)中，加入0.01mL催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100μL移液枪取25μL生物胶注射液，加至0.25cm2软骨片表面至完全覆盖，室温下保持30min，再用2mLPBS(pH值为7.2，0.15M)冲洗软骨片3次，每次5min，即得到表面改性的软骨片。同样条件下以未涂覆生物胶的软骨片为对照。
使用扫描电子显微镜(SEM)观察表面改性前后软骨表面结构，观察生物胶对软骨表面形貌的影响。将涂覆或未涂覆生物胶的软骨切片(5mm×5mm×0.2mm，长×宽×厚度)于15～35℃，真空干燥(10～20Pa)48～72小时，然后用扫描电子显微镜观察表面形貌。结果见图2所示，从图中可见两者的表面形貌无显著区别，说明该生物胶不会影响软骨原有的形貌结构。
表面细胞粘附能力检测：将5mL软骨细胞悬液与10μLDiI染料(2.5mg/mL)混匀，置于37℃培养箱中孵育半小时，然后800rpm离心5min去除染液，用5mLPBS洗2次，用F12/DMEM(1:1)培养基(含10％胎牛血清与1％青霉素-链霉素)重悬，调节浓度至10000个/mL。将细胞接种至涂覆及未涂覆生物胶的软骨切片(7mm×7mm×1mm)表面，培养6小时，去掉培养液，每个切片用1mLPBS洗3次，每次2min，用荧光显微镜(OLYMPUS)于546nm波长处观察细胞在两种表面的粘附情况。结果见图3所示，可见在涂覆生物胶后的软骨表面细胞数显著增加，说明该生物胶可有效改善浅表层软骨损伤治疗中细胞流失的问题。
表面软骨细胞增殖能力检测：将软骨细胞悬液用F12/DMEM(1:1)培养基(含1％青霉素/链霉素)调节浓度至10000个/mL。将0.5mL细胞悬液接种至涂覆及未涂覆生物胶的软骨切片(7mm×7mm×1mm)表面，于37℃培养箱中培养。分别在培养1天、4天、7天时，每片加入0.05mLCCK-8溶液，继续培养3小时，后吸取培养液，用酶标仪测量溶液在450nm处的吸光值。结果见图4所示，可见涂覆生物胶不会影响软骨细胞的活性，在培养第四天与第七天时，涂覆生物胶的软骨表面细胞活性显著高于未涂覆的软骨表面，说明该生物胶具有良好的生物相容性。通过表面形貌观察及细胞粘附、增殖实验可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构与生物相容性。
软骨片的制备：新鲜的猪关节软骨，除去周围组织，用手术刀切成约1cm×1cm大小块状，然后使用冰冻切片机沿横切面切成1mm薄片，最后用手术刀修整四周边缘，得到不同尺寸的软骨切片。
F12/DMEM培养基终浓度组成为：F12培养基(购自Gibco)与DMEM高糖培养基(购自Gibco)按体积比1：1混合，添加10％胎牛血清与1％青霉素-链霉素。
实施例2：硫酸软骨素-多巴胺生物胶
(1)制备硫酸软骨素-多巴胺生物胶：200mg硫酸软骨素加入40mLMES缓冲液(0.1M，pH5.9)中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将218mgEDC，247mgsulfo-NHS溶于1mLMES缓冲液(0.1M，pH5.9)，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温、氮气条件下反应30min。将216.2mg多巴胺溶于1mLMES缓冲液，加入上述反应溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应60min。将反应后的产物取出，置于透析袋(MWCO3500)中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥(48小时，10Pa，-108℃)，得到硫酸软骨素-多巴胺生物胶冻192mg，并于4℃避光保存。
(2)配制催化剂：将质量浓度30％过氧化氢用蒸馏水稀释至质量浓度3％。
(3)软骨表面涂覆硫酸软骨素-多巴胺生物胶：将2mg硫酸软骨素-多巴胺溶于2mLPBS缓冲液(pH值为7.2，0.15M)中，加入0.02mL催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100μL移液枪取100μL生物胶注射液，加至1cm2软骨片(制备同实施例1)表面至完全覆盖，室温(25℃)下保持30min，再用5mLPBS冲洗软骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物胶的软骨片。后通过表面形貌观察及细胞粘附实验(方法同实施例1)可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。
实施例3：透明质酸钠-多巴胺生物胶
(1)制备透明质酸钠-多巴胺生物胶：400mg透明质酸钠加入80mLMES缓冲液(0.1M，pH5.9)中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将437mgEDC，495mgsulfo-NHS溶于2mLMES缓冲液(0.1M，pH5.9)，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应30min。将432mg多巴胺溶于2mLMES缓冲液(0.1M，pH5.9)，加入上述反应溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应60min。将反应后的产物取出，置于透析袋(MWCO8000～14000)中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥(72小时，10Pa，-108℃)，得到透明质酸钠-多巴胺生物胶411mg，并于4℃避光保存。
(2)配制催化剂：将83.3mg高碘酸钠溶于10mL蒸馏水中，取1mL，与0.01mL0.4M氢氧化钠溶液混合。20～25℃避光保存。
(3)软骨表面涂覆透明质酸钠-多巴胺生物胶：将25mg透明质酸钠-多巴胺溶于1mLPBS缓冲液(pH值为7.2，0.15M)中，加入5μL催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100μL移液枪取25μL生物胶注射液，加至0.25cm2软骨片(同实施例1)表面至完全覆盖，室温(25℃)下保持20min，再用2mLPBS冲洗软骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物胶的软骨片(即表面改性软骨)。通过表面形貌观察及细胞粘附实验(同实施例1)可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。
实施例4：
(1)制备透明质酸-多巴胺生物胶：200mg透明质酸钠加入80mLMES缓冲液(0.1M，pH5.9)中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，获得多糖溶液。将218mgEDC，247mgsulfo-NHS溶于2mLMES缓冲液，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应30min。将216.2mg多巴胺溶于2mLMES缓冲液，加入上述反应溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应60min。将反应后的产物取出，置于透析袋(MWCO8000～14000)中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥(48小时，10Pa，-108℃)，得到透明质酸-多巴胺生物胶209mg，并于4℃避光保存。
(2)配制催化剂：将83.3mg高碘酸钠溶于10mL蒸馏水中，取1mL，与0.01mL0.4M氢氧化钠溶液混合。20～25℃避光保存。
(3)软骨表面涂覆透明质酸-多巴胺生物胶：将10mg透明质酸-多巴胺溶于1mLPBS缓冲液中，加入5μL催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100μL移液枪取25μL生物胶注射液，加至0.25cm2软骨片表面至完全覆盖，室温(25℃)下保持20min，再用2mLPBS冲洗软骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物胶的软骨片。通过表面形貌观察及细胞粘附实验(同实施例1)可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。
实施例5：
(1)制备透明质酸-多巴胺生物胶：200mg透明质酸钠加入80mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将218mgEDC，247mgsulfo-NHS溶于2mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应30min。将216.2mg多巴胺溶于2mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)，加入上述反应溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应120min。将反应后的产物取出，置于透析袋(MWCO8000～14000)中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥(48小时，10Pa，-108℃)，得到透明质酸-多巴胺生物胶214mg，并于4℃避光保存。
(2)配制催化剂：将质量浓度30％过氧化氢用蒸馏水稀释至质量浓度3％。
(3)软骨表面涂覆透明质酸-多巴胺生物胶：将20mg透明质酸-多巴胺溶于1mLPBS缓冲液(pH值为7.2，0.15M)中，加入10μL催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100μL移液枪取50μL生物胶注射液，加至1cm2软骨片(同实施例1)表面至完全覆盖，室温(25℃)下保持60min，再用5mLPBS冲洗软骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物胶的软骨片。通过表面形貌观察及细胞粘附实验(同实施例1)可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。
实施例6：
(1)制备透明质酸-多巴胺生物胶：240mg透明质酸钠加入80mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将460mgEDC，521.19mgsulfo-NHS溶于2mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应30min。将720mg多巴胺溶于2mLMES缓冲液(0.1M，pH5.5)，加入上述反应溶液中，室温(25℃)、氮气条件下反应120min。将反应后的产物取出，置于透析袋(MWCO8000～14000)中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥(48小时，10Pa，-108℃)，得到透明质酸-多巴胺生物胶292mg，并于4℃避光保存。
(2)配制催化剂：将83.3mg高碘酸钠溶于10mL蒸馏水中，取1mL，与0.01mL0.4M氢氧化钠溶液混合。20～25℃避光保存。
(3)软骨表面涂覆透明质酸-多巴胺生物胶：将20mg透明质酸-多巴胺溶于1mLPBS缓冲液(pH值为7.2，0.15M)中，加入10μL催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100μL移液枪取100μL生物胶注射液，加至1cm2软骨片(同实施例1)表面至完全覆盖，室温(25℃)下保持60min，再用5mLPBS冲洗软骨片3次，每次5min，即得到涂覆生物胶的软骨片。通过表面形貌观察及细胞粘附实验(同实施例1)可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。
Claims (6)
1.一种多糖-多巴胺复合生物胶，其特征在于所述生物胶按如下方法制备：(1)在惰性气体氛围中，将多糖溶于pH值5～6的MES缓冲液中制成多糖溶液；所述多糖为硫酸软骨素钠盐或透明质酸钠；(2)在惰性气体氛围中，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠溶于pH值5～6的MES缓冲液，制成EDC混合液，然后将该EDC混合液加入步骤(1)制备的多糖溶液中，在20～30℃反应0.5～1小时，再加入多巴胺溶液，20～30℃继续反应1～4小时，反应物以蒸馏水为透析液透析1～3天，取截留液冷冻干燥，获得多糖-多巴胺复合生物胶；所述冷冻干燥条件为压强0～20Pa，温度-105～-110℃，时间48～72小时；所述多巴胺溶液是将多巴胺溶于pH值5～6的MES缓冲液制成，所述多糖溶液的用量以多糖质量计，所述多糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠投料质量比为1：0.8～3：0.8～3，所述多巴胺溶液用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量比为1：0.8～3。
2.如权利要求1所述多糖-多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤(1)将多糖溶于pH值5～6的MES缓冲液中制成终浓度1～10mg/mL的多糖溶液。
3.如权利要求1所述多糖-多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤(2)所述透析在截留分子量为3000～3500或8000～14000的透析袋中进行。
4.如权利要求1所述多糖-多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤(1)和步骤(2)所述惰性气体均为氮气或氦气。
5.如权利要求1所述多糖-多巴胺复合生物胶，其特征在于步骤(2)所述多糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠投料质量比为1：1～2：1～2，所述多巴胺溶液的用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量比为1：1～2。
6.一种权利要求1所述多糖-多巴胺复合生物胶在制备表面改性软骨药物中的应用，其特征在于所述表面改性软骨药物的制备方法为：将多糖-多巴胺复合生物胶溶于pH值7.2～7.4的PBS缓冲液中，制成多糖-多巴胺复合生物胶溶液，加入催化剂，混合，即得到表面改性软骨药物；所述的多糖-多巴胺复合生物胶溶液浓度为0.5～25mg/mL；所述催化剂为高碘酸钠溶液或质量浓度1～3％的过氧化氢水溶液，所述高碘酸钠溶液是由5～8mg/mL高碘酸钠水溶液与0.4mol/L的NaOH水溶液以体积比50:1～200:1混合制成；所述催化剂的体积用量与多糖-多巴胺复合生物胶溶液体积比为1：100～200。
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