CN108192427B - 多巴胺-透明质酸涂层材料、制备方法及其在促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用 - Google Patents

多巴胺-透明质酸涂层材料、制备方法及其在促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用 Download PDF

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Abstract

一种多巴胺‑透明质酸涂层材料、制备方法及其在促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用，属于牙髓再生技术领域。是以透明质酸、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺酯、盐酸多巴胺为原材料，按摩尔比1～10：2：2：1依次加入到去离子水中，混合均匀；然后在氮气保护下室温搅拌，用盐酸或氢氧化钠调节使其pH＝4～5，维持pH值不变反应2～5小时，再于室温下反应过夜；最后将得到的反应溶液在酸性去离子水环境中透析纯化3～5天；收集产物，真空冷冻干燥48～96h，所得白色絮状接枝产物，即为多巴胺‑透明质酸复合材料。通过改变原材料投料摩尔比例、产物浓度以调控涂层厚度，涂层材料能够有效促进牙髓干细胞特异性粘附根管壁。

Description

多巴胺-透明质酸涂层材料、制备方法及其在促进牙髓干细胞 特异性粘附牙本质方面的应用
技术领域
本发明属于牙髓再生技术领域，具体涉及一种多巴胺-透明质酸涂层材料、制备方法及其在促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用。
背景技术
牙髓感染、外伤及某些颌面外科手术需要等要求去除感染的牙髓组织，而丧失生活牙髓导致牙体硬组织因失去营养而出现感觉异常、牙体变色、变脆、牙劈裂，甚至折断或牙拔除等，传统牙髓治疗的并发症严重危害患者的口腔功能、容貌美观和身心健康。因此，牙髓再生成为具有光明应用前景的牙髓治疗方法，众多学者竞相致力于牙髓再生相关研究，也成为口腔医学和组织工程领域的研究热点。目前，牙髓再生研究取得了长足进展，然而，仍面临诸多挑战，其中，根管治疗使根管壁牙本质结构和形态破坏，这不利于牙髓再生种子细胞粘附根管，进而严重阻碍了细胞的增殖、分化及其生物学功能，结果再生牙髓样组织不能充满根管，而且成牙本质细胞分化和功能不强。可见，牙髓再生的种子细胞高效粘附根管壁牙本质是牙髓再生的瓶颈。
为实现牙髓再生目标，国内外学者进行了大量的研究工作。例如有研究者利用组织细胞归巢(Cell homing)或移植人脱落乳牙干细胞(Stem cells from humanexfoliated deciduous，SHED)、牙髓干细胞(Dental pulp stem cells，DPSC)、人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)作为种子细胞，应用TGF-β1、BMP-2、bFGF、VEGF、PDGF、NGF和BMP7等生长因子，以富血小板血浆(Platelet–rich plasma，PRP)、蚕丝蛋白、PLLA微球、透明质酸凝胶或胶原凝胶等作为支架进行了全长牙根(或片段)的牙髓再生研究，可形成牙髓样组织并有成牙本质细胞分化，但是，成牙本质细胞层和牙本质形成不良，牙髓-牙本质复合体再生效果欠佳，再生牙髓样组织特别是由DPSC等种子细胞分化的成牙本质细胞与根管壁牙本质结合不牢，最终阻碍了牙髓再生的发展。
我们受海洋生物贻贝牢固黏附于礁石而不被海浪冲刷脱落现象的启发，经过研究和查阅文献，发现贻贝通过足腺细胞分泌含贻贝黏附蛋白的黏液，后者具有高韧性、高强度和强黏附性，可与玻璃、金属、陶瓷和聚合物等多种基底材料表面形成相互作用。据报道，贻贝足丝所分泌的蛋白中至少有5种黏附蛋白含有大量多巴，且足丝黏附蛋白黏附能力随多巴含量增加而增强。现已证实多巴的邻苯二酚基团在该类材料的表面黏附性能中起到重要作用，邻苯二酚基团可通过形成可逆或不可逆非共价键黏附于湿润的金属表面或有机材料表面。含有邻苯二酚的多巴衍生物也具有与多巴相似的强黏附性，可实现金属/金属氧化物表面的吸附。目前，多巴衍生物多巴胺(dopamine)因其优良的黏附性能备受关注，常应用于多种材料的表面改性。据报道，多巴胺可牢固粘附于羟基磷灰石表面，而牙齿根管壁牙本质约60％的成分为羟基磷灰石。据此推测，含有多巴胺的复合材料能够粘附根管壁。
牙髓基质的主要成分为透明质酸(hyaluronic acid，HyA)，赋予牙髓一定粘性。HyA是一种天然高分子聚阴离子黏多糖，具有独特的线性大分子结构、流体动力学性能和良好的生物相容性，被广泛应用于组织工程支架等研究领域。此外，牙髓基质中的HyA可影响细胞迁移、粘附和分化等生物学行为，在形态发生、损伤修复和炎症反应中起着重要作用，这些作用主要通过HyA与细胞表面受体(CD44、RHAMM和ICAM-1等)特异性结合来介导，CD44是DPSC的表面糖蛋白，说明DPSC能够与HyA特异性结合，进而启动粘附效应促进细胞附着根管壁。
HyA具有生物相容性良好、可生物降解吸收、半衰期短和降解速度快等特点。该材料可经结构修饰和化学改性而改善其性能，逐渐成为一种理想的组织工程支架材料。HyA分子中的羧基基团活性较高，常作为化学修饰位点，可通过与多巴胺的氨基发生酰胺化反应，得到接枝产物多巴胺-HyA，该产物兼具HyA和多巴胺的双重优势，DPSC通过根管壁预制的多巴胺-HyA涂层的辅助而特异性粘附根管壁，促进牙髓-牙本质再生。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进DPSC特异性粘附牙本质的涂层材料及其制备方法，所构建的牙本质涂层具有良好的生物相容性、细胞粘附性和生物可降解性。本发明所述方法是通过酰胺化反应合成多巴胺-透明质酸，将该材料构建于根管壁表面成为功能化涂层，通过改变原材料投料摩尔比例、产物浓度以调控涂层厚度，该涂层能够有效促进牙髓干细胞特异性粘附根管壁。
本发明所述的多巴胺-透明质酸涂层材料的制备方法，其步骤如下：
1)以透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、盐酸多巴胺为原材料，按摩尔比1～10：2：2：1依次加入到去离子水中，混合均匀；
2)将步骤1)得到的反应溶液在氮气保护下，20～30℃搅拌，用盐酸或氢氧化钠调节使其pH＝4～5，维持pH值不变反应2～5小时，再于室温下反应过夜；
3)将步骤2)得到的反应溶液在酸性去离子水环境(pH＝4～5)中透析(截留分子量＝9000～15000Da)纯化3～5天；
4)收集步骤3)产物，真空冷冻(-60～-80℃)干燥48～96h，所得白色絮状接枝产物，即为多巴胺-透明质酸复合材料，-20～-15℃储存备用；
5)牙本质组织块的准备：将为正畸治疗而新鲜拔除的前磨牙用质量分数2～5％次氯酸钠水溶液充分除菌，并用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗；随后，去净牙周组织，应用PBS冷却降温，获取牙根，彻底去除牙髓和前期牙本质，喷水降温下切割形成3.0mm*3.0mm*1.0mm的牙本质组织块；所有的牙本质组织块依次用去离子水浸泡3～8h，超声清洗15～30min，质量分数15～20％的EDTA水溶液浸泡10～20min，质量分数15～25％的柠檬酸水溶液浸泡0.5～2min，然后用质量分数5～6％次氯酸钠水溶液消毒20～40min，再用PBS冲洗、浸泡1.5～3d，得到牙本质组织块；
6)牙本质组织块表面构建多巴胺-透明质酸涂层：将步骤4)得到的多巴胺-透明质酸材料溶于去离子水得到质量浓度10～60％的水凝胶，将步骤5)得到的牙本质组织块浸入到该水凝胶中20～30h，然后取出牙本质组织块真空干燥48～72h，从而在牙本质组织块表面形成多巴胺-透明质酸涂层，涂层厚度为5.7～24.8μm；
7)牙本质+涂层与DPSC共培养检测：将常规培养的DPSC接种于构建有涂层的牙本质组织块表面，共培养12～48h，SEM观察DPSC在牙本质组织块表面的形态特征。
本发明所用的生物可降解材料包括盐酸多巴胺、透明质酸；所用的催化剂和活化剂为EDC、NHS，反应后可通过透析清除残余试剂；采用的溶剂为去离子水。
本发明提供的方法具有以下优点及突出性效果：制备多巴胺-透明质酸涂层的方法工艺简单、操作方便；多巴胺的强黏附性使涂层牢固粘附于牙本质表面，多巴胺的接枝率可控，涂层厚度可调节；透明质酸作为牙髓基质组成部分，具有良好的生物相容性，可吸收降解，避免毒副作用；透明质酸与DPSC表面受体CD44特异性结合，这可促进DPSC稳定粘附牙本质表面，进而形成牙本质细胞层和牙本质，实现牙髓-牙本质复合体再生。
附图说明
图1：多巴胺-透明质酸产物(盐酸多巴胺、透明质酸投料摩尔比是1：1)的紫外(图1A)、红外(图1B)及核磁共振图谱(图1C)；
图2：预处理的根管壁表面SEM观察(真空干燥、喷金)；
图3：牙本质表面构建多巴胺-透明质酸涂层结构的SEM谱图；
图4：DPSC与牙本质+涂层共培养12～48h后的SEM谱图；
图1通过紫外(1A)、红外(1B)及氢谱核磁共振(1C)技术和方法，证实多巴胺成功接枝在透明质酸上。
图2SEM下观察到牙本质块经预处理后其管周牙本质脱矿，牙本质小管开口明显敞开。
图3(3A/D、3B/E、3C/F)分别为盐酸多巴胺、透明质酸投料摩尔比为1：1所获得多巴胺-透明质酸产物制成浓度为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的多巴胺-透明质酸溶液，以上3种溶液制备的牙本质表面涂层经SEM观察，均可见形成附着牙本质表面并封闭牙本质小管开口的涂层结构，且随着多巴胺-透明质酸溶液浓度增大，形成的涂层形态发生相应改变。图A与D、B与E、C与F是相同标本，但观察角度不同。
图4为牙本质表面多巴胺-透明质酸涂层与DPSC共培养12h(图4A)、24h(图4B)和48h(图4C)后，SEM观察证实细胞粘附生长良好，而且牙本质表面粘附细胞数目与共培养时间呈正相关关系(实施例5)。
具体实施方式：
1、多巴胺-透明质酸材料的制备
实施例1
以盐酸多巴胺、透明质酸投料摩尔比为1：1为例，将201.6mg透明质酸溶解在50mL去离子水中，将191.7mg EDC、115.09mg NHS缓慢加入到溶液中，均匀搅拌20min，再向混合溶液中加入94.82mg盐酸多巴胺。将反应溶液氮气保护并室温搅拌，用盐酸调节使其pH值4，保持3小时，然后于室温下继续反应过夜。反应后，将溶液在pH＝5的去离子水的酸性环境中透析(截留分子量＝12000Da)纯化4天，真空冷冻(-70℃)干燥72h，获得白色絮状接枝产物为多巴胺-透明质酸涂层材料，产物质量为234.16mg。改变盐酸多巴胺与透明质酸投料比，其他条件不变的情况下，制备涂层材料，以探讨多巴胺接枝率(应用核磁共振谱仪检测多巴胺-透明质酸、计算接枝产物中多巴胺的取代度即接枝率)和含水率(材料干燥前后的质量差与干燥前质量的比值为材料的含水率，测定5个样本，计算平均值)对DPSC粘附根管壁效果的影响，实验数据如表1所述。
表1：多巴胺-透明质酸涂层材料的性能数据
2、牙本质表面多巴胺-透明质酸涂层的构建
实施例2
牙本质组织块的准备：将为正畸治疗而新鲜拔除的前磨牙用质量分数2～5％次氯酸钠水溶液充分除菌，并用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗；随后，去净牙周组织，应用PBS冷却降温，获取牙根，彻底去除牙髓和前期牙本质，喷水降温下切割形成3.0mm*3.0mm*1.0mm的牙本质组织块；所有的牙本质组织块依次用去离子水浸泡5h，超声清洗20min，质量分数17％的EDTA水溶液浸泡101min，质量分数19％的柠檬酸水溶液浸泡1min，然后用质量分数5.25％次氯酸钠水溶液消毒30min，再用PBS冲洗、浸泡2d，得到牙本质组织块。
将摩尔比为1：1的多巴胺-透明质酸涂层材料，以25mg、50mg、100mg分别溶于10mL去离子水中，配制成浓度为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的多巴胺-透明质酸溶液。将前期处理的牙本质组织块分别浸入上述多巴胺-透明质酸溶液中，24h后取出采用匀胶机旋涂(400r/s；20s)，然后转移至真空干燥器中冷冻干燥48h，SEM观察附着涂层的微观形态结构特征。实验数据如表2所述。
表2：不同浓度的摩尔比为1：1多巴胺-透明质酸溶液制备牙本质涂层数据
实施例3
选取摩尔比为5：1，浓度为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的多巴胺-透明质酸溶液，将实施例2制备的牙本质组织块分别浸入上述溶液中，24h后取出采用匀胶机旋涂(400r/s；20s)，然后转移至真空干燥器中冷冻干燥48h。SEM观察牙本质表面涂层的微观形态结构特征。实验数据如表3所述。
表3：不同浓度的摩尔比为5：1多巴胺-透明质酸溶液制备牙本质涂层数据
实施例4
选取摩尔比为1：1，浓度为5mg/mL的多巴胺-透明质酸溶液，将实施例2制备的牙本质组织块浸入改溶液中，分别24h、48h、72h后取出采用匀胶机旋涂(400r/s；20s)，然后转移至真空干燥器中冷冻干燥48h。SEM观察牙本质表面涂层的微观形态结构特征。实验数据如表4所述。
表4：摩尔比为1：1多巴胺-透明质酸溶液改变构建时间制备牙本质涂层数据
3、牙本质+涂层与DPSC共培养观察
实施例5
将摩尔比为1：1的多巴胺-透明质酸产物50mg溶于10mL去离子水中，配制成浓度为5mg/mL的多巴胺-透明质酸溶液。将实施例2制备的牙本质组织块浸入该多巴胺-透明质酸溶液中，48h后取出采用匀胶机旋涂(400r/s；20s)，然后转移至真空干燥器中冷冻干燥48h，将牙本质+涂层应用酒精浸泡5min，无菌生理盐水轻柔冲洗2遍，转移至每孔装有150μL常规培养液的96孔板内浸泡，24h后接种DPSC，调节细胞密度至1*104个/mL，200μl/孔，牙本质涂层与DPSC共培养12h、24h和48h后，常规固定和脱水，SEM观察细胞粘附和生长情况，数据如表5所述。
表5：DPSC在牙本质+涂层表面常规培养的生长情况
上面结合具体实施例，对本发明做了进一步阐述，而不是要以此对本发明进行限制。本发明的发明点在于将生物相容性好、可生物降解的透明质酸和多巴胺通过化学反应进行改性构建复合材料，将改性产物用于优化牙本质表面微环境，促进DPSC粘附牙本质表面。至于应用透明质酸以外的其他高分子材料(硫酸软骨素、明胶或胶原等)与多巴胺反应形成改性材料，在以羟基磷灰石为主要成分的组织(骨、釉质和牙骨质等)表面构建涂层结构的方法均在本发明的构思范围内。

Claims (4)

1.一种多巴胺-透明质酸涂层材料在用于促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用，所述的多巴胺-透明质酸涂层材料是由如下步骤制备得到，
1)以透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、盐酸多巴胺为原材料，按摩尔比1～10：2：2：1依次加入到去离子水中，混合均匀；
2)将步骤1)得到的反应溶液在氮气保护下室温搅拌，用盐酸或氢氧化钠调节使其pH＝4～5，维持pH值不变反应2～5小时，再于室温下反应过夜；
3)将步骤2)得到的反应溶液在酸性去离子水环境中透析纯化3～5天；
4)收集步骤3)产物，真空冷冻干燥48～96h，所得白色絮状接枝产物，即为多巴胺-透明质酸涂层材料；
将多巴胺-透明质酸涂层材料溶于去离子水得到质量浓度10～60％的水凝胶，将牙本质组织块浸入到该水凝胶中20～30h，然后取出牙本质组织块真空干燥48～72h，从而在牙本质组织块表面形成多巴胺-透明质酸涂层，涂层厚度为5.7～24.8μm。
2.如权利要求1所述的一种多巴胺-透明质酸涂层材料在用于促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用，其特征在于：步骤3)中酸性去离子水环境的pH＝4～5。
3.如权利要求1所述的一种多巴胺-透明质酸涂层材料在用于促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用，其特征在于：步骤3)中透析的截留分子量＝9000～15000Da。
4.如权利要求1所述的一种多巴胺-透明质酸涂层材料在用于促进牙髓干细胞特异性粘附牙本质方面的应用，其特征在于：步骤4)中真空冷冻干燥温度为-60～-80℃。
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