JPWO2002096978A1 - エラスチン架橋体およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、エラスチン架橋体、架橋に使用する水溶性架橋剤、エラスチン成形体、エラスチン架橋体を用いた医療用器具および再生組織、該医療用器具を用いた外科治療方法および再生医療に関する。本発明は、細胞接着性タンパク質の脱離が起こらず、生体移植に適合し得る弾性を有する生体適合性機能性材料を提供するものである。
Description
技術分野
本発明は、生体適合性機能性材料、およびその製造方法、医療用器具、架橋剤、外科治療方法、さらに再生組織に関する。
背景技術
事故、災害その他の理由で神経組織が切断された患者に対する治療方法の一つとして、人工材料によるチューブを神経欠損部に連結して、該チューブ内に神経組織の再生を誘導する方法が行われている。該チューブとしては、シリコーン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、アルギン酸、ポリ乳酸等のチューブの内面を、コラーゲンやラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングしたものが用いられている。
また、血管が切断された患者に対する治療方法の一つとして、シリコーン、ポリウレタン、ポリエステルなどの合成高分子繊維を編んだ布を管状とし、その内面をコラーゲンやラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングした人工血管を、血管切断部位に移植し、該人工血管内部に内皮細胞を誘導させる方法が行われている。
発明の開示
前述のシリコーンチューブやポリウレタンチューブなどの内面は、細胞接着性がないためこれまでは、コラーゲンやラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングしたチューブや該人工血管を、前述のような治療方法に用いた場合には、長期の治療の間に該細胞接着性タンパク質が脱離し、神経や血管などの組織の再生が不十分であった。
さらに、動物内に移植するチューブや人工血管には、人体および各組織の動きに連動するだけの弾性が求められているが、シリコーンやポリエステルを主原料とするチューブや人工血管のヤング率（弾性率）は、適応された組織のヤング率（弾性率）が１ｘ１０４〜２ｘ１０６Ｐａであるのに対し、１ｘ１０７Ｐａ以上であるため、接合部に強いストレスが起こり、その結果、血栓が生じるなどの問題を抱えており、人体の組織と同じ弾性を有する材料が求められていた。
本発明者は前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、水溶性エラスチンを架橋剤により架橋することにより、コーティングしたコラーゲンやラミニン等の細胞接着性タンパク質の脱離が起こらず、生体の移植に適合し得るだけの弾性を有するエラスチン架橋体を得ることができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は下記の構成を有する。
（１）水溶性エラスチンから選ばれた１種以上を含有する架橋原料が、水溶性架橋剤で架橋されてなるエラスチン架橋体。
（２）架橋原料がさらにコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上を含有する（１）記載のエラスチン架橋体。
（３）水溶性エラスチンの含有率が０．５〜９９．５重量％の範囲である（１）記載のエラスチン架橋体。
（４）ヤング率が１×１０２〜１×１０７Ｐａの範囲である（１）記載のエラスチン架橋体。
（５）内部構造が空隙を有するスポンジ構造である（１）記載のエラスチン架橋体。
（６）空隙の平均直径が２０μｍ未満の範囲である（５）記載のエラスチン架橋体。
（７）空隙の平均直径が２０μｍ〜２ｍｍの範囲である（５）記載のエラスチン架橋体。
（８）コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチンガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上が化学的に結合されてなる（１）または（２）記載のエラスチン架橋体。
（９）化学的結合が架橋剤を用いた架橋である（８）記載のエラスチン架橋体。
（１０）コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上を含有する（１）、（２）または（８）記載のエラスチン架橋体。
（１１）水溶性架橋剤が分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にアミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物である（１）記載のエラスチン架橋体。
（１２）水溶性架橋剤が、下記一般式で表される水溶性化合物であることを特徴とする（１）記載のエラスチン架橋体。
＜一般式＞
（Ｒ１、Ｒ３は下記の構造式で表される＜Ａ＞または＜Ｂ＞の何れかであり、Ｒ１とＲ３とは同じであっても異なっていてもよく、）
＜Ａ＞
（Ｒ４、Ｒ５はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ４とＲ６とは同じであっても異なっていてもよい。）
＜Ｂ＞
（Ｒ２は下記の構造式で表される＜Ｃ＞または＜Ｄ＞の何れかで表される化合物であり、）
＜Ｃ＞
＜Ｄ＞
（ｍ、ｌは０〜１５までの整数であり、Ｘ、Ｙは、ＣＨ２またはＯの何れかであり、ＸとＹとは同じであっても異なっていてもよく、ＺはＣまたはＮの何れかであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５の何れかであり、それぞれ同じであっても異なっていても良い。）
（１３）（１）〜（１２）の何れか１項記載のエラスチン架橋体からなるエラスチン成形体。
（１４）形状が、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状である（１３）記載のエラスチン成形体。
（１５）（１）記載のエラスチン架橋体を用いた医療用器具。
（１６）（１５）記載の医療用器具を用いることを特徴とする外科治療方法。
（１７）（１）記載のエラスチン架橋体、（１５）記載の医療用器具を用いることを特徴とする再生医療。
（１８）（１）記載のエラスチン架橋体を用いて得られた再生組織。
（１９）分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にアミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物を含有する架橋剤。
（２０）化合物が、下記一般式で表される化合物である（１９）記載の架橋剤。
＜一般式＞
（Ｒ１、Ｒ３は下記の構造式で表される＜Ａ＞または＜Ｂ＞の何れかであり、Ｒ１とＲ３とは同じであっても異なっていてもよく、）
＜Ａ＞
（Ｒ４、Ｒ５はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ４とＲ５とは同じであっても異なっていてもよい。）
＜Ｂ＞
（Ｒ２は下記の構造式で表される＜Ｃ＞または＜Ｄ＞の何れかで表される化合物であり、）
＜Ｃ＞
＜Ｄ＞
（ｍ、ｌは０〜１５までの整数であり、Ｘ、Ｙは、ＣＨ２またはＯの何れかであり、ＸとＹとは同じであっても異なっていてもよく、ＺはＣまたはＮの何れかであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５の何れかであり、それぞれ同じであっても異なっていても良い。）
（２１）（１９）記載の水溶性架橋剤を用いた架橋反応により、水溶性エラスチンを架橋することを特徴とするエラスチン架橋体の製造方法。
（２２）架橋反応時の反応温度が４〜１５０℃の範囲であることを特徴とする（２１）記載のエラスチン架橋体の製造方法。
発明の実施の形態
本発明に使用する水溶性エラスチンとは特に限定されるものではないが、エラスチンを加水分解して得られるものであり、具体的には、動物の頚靭帯などを熱シュウ酸処理して得られるα−エラスチン若しくはβ−エラスチン、エラスチンをアルカリエタノール処理して得られるκ−エラスチン、エラスターゼにより酵素処理した水溶性エラスチンおよびエラスチン生合成経路における前駆体であるトロポエラスチンなどの少なくとも１種以上のエラスチンを使用することができる。トロポエラスチンは特に限定されるものではなく動物細胞からの抽出物でも、遺伝子組換え法により得られるトロポエラスチン遺伝子産物の少なくとも１種類以上を使用することができる。
弾性タンパク質であるエラスチンは、通常、生体内において、大動脈や声帯など弾性が要求される体内組織に多く存在する。生体内に存在するエラスチンは、疎水性アミノ酸の含有量が多いことと、デスモシン、イソデスモシンなどの強固な架橋構造を有することから水不溶性の性質を持つ。該エラスチンは、こうした架橋構造により油状コイルと呼ばれる特有の構造を形成するために弾性を有している。
本発明のエラスチン架橋体は、生体内エラスチンの架橋構造を分解し水溶性にした水溶性エラスチンから選ばれた１種以上を水溶性架橋剤で架橋して得ることができる。また本発明のエラスチン成形体は、前述の水溶性エラスチンと水溶性架橋剤を混ぜ合わせ水溶性エラスチン水溶液とした後、成形用のテンプレートなどに流し込み、加熱などで架橋させて得ることができる。
本発明のエラスチン架橋体は、水溶性エラスチンおよび架橋剤以外の第３成分を含有するものであってもよい。該成分は特に限定されるものではない。該成分には、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質やポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナン等の糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）などの細胞増殖因子、その他ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、ポリリンゴ酸などの化合物を挙げることができる。さらにはそれらの１種以上を含有しても何ら問題はない。特にコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸など細胞外マトリクス成分やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）などの細胞増殖因子は細胞の接着および増殖を高めるために好ましい。
本発明のエラスチン架橋体に含有する水溶性エラスチンの割合は、エラスチン架橋体に対して０．５〜９９．５重量％の範囲であることが好ましい。更に好ましくは１〜９５％であり、この範囲であれば生体に適した弾性を有する成形性良好な成形体を得ることができる。
水溶性エラスチンは、全重量の約９４％が疎水性アミノ酸、約１％が側鎖にアミノ基を含むアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）で形成された疎水性タンパク質である。本発明に使用する水溶性架橋剤は、水溶性エラスチンの側鎖のアミノ基と反応し、架橋反応するものであれば何れの水溶性架橋剤であっても使用することができる。該水溶性架橋剤としては例えば、グルタルアルデヒド、エチレングリシジルエーテルなどや下記一般式で表される分子中心領域に疎水性部を有し、両末端に活性エステル基を有する化合物などを挙げることができる。中でも下記一般式で表される化合物を架橋剤として用いると、生体に適した弾性を有する成形性良好な成形体を得ることができ好ましい。
＜一般式＞
（Ｒ１、Ｒ３は下記の構造式で表される＜Ａ＞または＜Ｂ＞の何れかであり、Ｒ１とＲ３とは同じであっても異なっていてもよく、）
＜Ａ＞
（Ｒ４、Ｒ５はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ４とＲ５とは同じであっても異なっていてもよい。）
＜Ｂ＞
（Ｒ２は下記の構造式で表される＜Ｃ＞または＜Ｄ＞の何れかで表される化合物であり、）
＜Ｃ＞
＜Ｄ＞
（ｍ、ｌは０〜１５までの整数であり、Ｘ、Ｙは、ＣＨ２またはＯの何れかであり、ＸとＹとは同じであっても異なっていてもよく、ＺはＣまたはＮの何れかであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５の何れかであり、それぞれ同じであっても異なっていても良い。）
分子中心領域に疎水性部を有する化合物は、疎水性アミノ酸を多く含むエラスチンと、疎水相互作用により強固で安定した構造体を形成する。しかし、疎水性部を多く含む化合物は、有機溶媒には可溶ではあるが、水に難溶または不溶となり水系で取り扱いにくい。本発明の水溶性架橋剤は上記一般式で表されるジカルボン酸化合物の両末端を４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｉｕｍｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（４ヒドロキシフェニルジメチル−スルホニウムメチルサルフェイト：以下ＤＳＰ）で活性エステル化させたもので、疎水性アミノ酸を多く含むエラスチンと強固な安定した構造体を取る疎水性部を有しながら、かつ水に溶解し水系で取り扱える特徴を有するものである。
また本発明の水溶性架橋剤は、その化学式の両末端の活性エステル基が、水溶性エラスチンのアミノ酸とペプチド結合し、架橋する。従って、本発明の水溶性架橋剤により架橋して得られたエラスチン架橋体は、生体内で生分解を受け易い特徴を有する。その生分解速度は、エラスチン架橋体の架橋度と関係するため、架橋条件を変え架橋度を変えることにより制御することができる。
本発明のエラスチン架橋体の構造は、特に限定するものではないが、体液や培養液などが浸透できるように空隙を有するスポンジ構造であることが好ましい。該空隙の大きさは特に限定されるものではないが、その平均直径が２０μｍ未満の場合、ヤング率（弾性率）が高く硬い架橋体を得やすい。また、２０μｍ〜２ｍｍの範囲の場合、ヤング率（弾性率）が低く膨潤度の高い成形可能な架橋体を得やすい。
本発明のエラスチン架橋体は、弾性に優れる架橋体であるが、生体に適合し易くするためにヤング率（弾性率）１×１０２〜１×１０７Ｐａの範囲が好ましく、特に１×１０３〜２×１０６Ｐａの範囲が好ましい。
本発明のエラスチン成形体の形状は特に限定されるものではないが、医療用途への適用では、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状などであることが好ましい。
さらに、本発明のエラスチン架橋体は、それのみで特定の構造体を形成してもよく、あるいはエラスチン架橋体以外の成分と複合体を形成させても良い。また、エラスチン架橋体以外の構造体の表面コーティングに用いても良い。複合体を形成させる成分としては、特に限定されるものではないが、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質やポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナン等の糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）などの細胞増殖因子、その他ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、ポリリンゴ酸などの化合物を挙げることができる。さらにはこれらを１種以上を用いてもよい。これによりエラスチンにない細胞接着性や坑血栓性等の生体機能を付与でき、また目的とする組織の増殖速度を速めることもできる。
水溶性エラスチンと水溶性架橋剤との架橋反応の条件は特に限定されるものではないが、反応温度は常圧またはオートクレーブなどの加圧下で４〜１５０℃の範囲であることが好ましい。特に架橋の操作性の点から１０〜１２０℃の範囲が好ましい。また本発明のエラスチン架橋体が空隙を有するスポンジ状である場合には、反応温度を制御することにより、空隙の直径を制御することができる。例えば、反応温度が４〜５０℃の範囲では、空隙の平均直径が２０μｍ以上の架橋体を得ることができ、５０〜１５０℃の範囲では空隙の平均直径が２０μｍ未満の架橋体を得ることができる。
本発明のエラスチン架橋体の成形方法は特に限定されるものではないが、一般的な合成樹脂の成形に用いられる成形用の型を用いて得ることができる。例えば水溶性エラスチンと本発明の水溶性架橋剤を混ぜ合わせ、水溶性エラスチン水溶液とした後、成形器に流し込み、オートクレーブなどで加熱し架橋させると、その鋳型を反映した糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状などのエラスチン架橋体を得ることができる。
本発明のエラスチン架橋体は、生体と同じ領域の弾性を有するため伸縮性に優れ、化粧品、医療用具として有効に用いることができる。特に限定されるわけではないが、例えば化粧品としては、スキンケア商品としてのフェイスマスク用基材として利用できる。医療用具としても特に限定されるわけではないがカテーテル、シャンテ、創傷被覆剤等の部品に成形し適用したものは、従来にない柔軟な機能を提供することとなる。
またこれらを再生医療用材料として本発明の医療器具を体内に埋め込んだ場合には、目的とする組織が体内で順調に増殖し易くなる。特に前述した神経細胞や血管に対して有効である。
さらに細胞増殖速度を速め、生体適合性を改善するために、エラスチン架橋体と第３成分を含有させて本来のエラスチンにはない機能を付与することもできる。例えば、坑血栓性があり細胞増殖因子と相互作用するヘパリンや細胞増殖因子を含有させることができる。
これらの第３成分は、エラスチン架橋体を作製するときに、予め原料として加えておき架橋体を形成させてもよく、またエラスチン架橋体を形成させた後、その構造体に含浸させたり、その後乾燥させて物理的に吸着させたりしても良い。また更には、第３成分の脱理を抑えるために該エラスチン架橋体に化学的に固定化しても良い。
本発明のエラスチン架橋体はＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）の一つである徐放担体としても使用できる。特に本発明のエラスチン架橋体は高いヤング率（弾性率）と空隙を有するスポンジ構造体を得ることができ、神経、血管などの治療に効果を発揮することができる。
本発明の医療用具は、前述のような機能、効果を有することから、外科治療法に用いた場合には特に有効である。例えば現在シートの片面にフィブリン、トロンビン等の血液凝固成分を固着させたコラーゲンシートが、手術後の止血用接着剤として用いられている。これは、手術によって生じた内臓の出血個所をシートで多い、血液凝固成分による止血とコラーゲン膜による物理的圧迫による止血の相乗効果と、取扱い易さを狙ったものであるが、コラーゲンシートは伸縮性が乏しく、心臓のような激しく動く臓器に適用した場合、圧着性が良くなかった。これに本発明のエラスチン架橋膜を使用することで、伸縮性が高く臓器の動きに対応できる膜を得ることができる。また更には、本発明のエラスチン架橋膜とコラーゲンの複合体を形成させれば、エラスチンの持つ伸縮性とコラーゲンの持つ細胞接着性の両者の特徴を有する、極めて生体適合性の高い膜が得られる。
本発明のエラスチン架橋体は、前述の様に体内に埋め込み、血管や神経の再生の場としても利用できるが、この機能を体外でも利用することができる。すなわち、再生医療用培養基材として、本発明の膜表面、チューブ内に、方向付けされた胚性幹（ＥＳ）細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞などを移植、培養することで、希望する形態の臓器を形成させることが可能となる。本発明のエラスチン架橋体は、成形性が良いだけでなく生分解性でもあるため、ある程度培養し、形を形成させた臓器を培養基材ごと移植するカートリッジ型の再生医療方法と再生組織を提供できる。
実施例
以下実施例をもって本発明を詳細に説明する。本実施例においては特に断りがない限り「％」は「重量％」を意味する。
実験例１（水溶性エラスチンの調製）
粉末状水不溶性エラスチン（エラスチン・プロダクト（Ｅｌａｓｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）社製）２０ｇに対し０．２５Ｍシュウ酸１５０ｍｌを加え、１００℃にて１時間処理する。冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）し、上澄みを集めセルロース性透析チューブ（分画分子量６千〜１万）に入れ、脱イオン水に対して４８時間透析しシュウ酸を除去する。その後凍結乾燥して水溶性エラスチンを得た。原料エラスチンと水溶性エラスチンのアミノ酸分析結果を表１に示した。
【表１】
実験例２（架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１６１μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン９０ｍｇを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に２５０ｍＭグルタルアルデヒド水溶液（東京化成社製）４８．７μｌを加え、直後にゲル状のエラスチン架橋体を得た。該ゲル状のエラスチン架橋体は成形用の直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込もうとしたが、流動性が小さく流し込むことはできなかった。２５０ｍＭグルタルアルデヒド水溶液の添加量を前述の１／１０の量に下げても、テンプレートに流し込むことが困難であった。
実験例３（架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテルを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水４１．６μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン３６ｍｇを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に２８７ｍＭエチレングリコールジグリシジルエーテル水溶液４２．４μｌを加えよくかき混ぜ、その溶液を直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込み、５０℃、１時間加熱してゲル状のエラスチン架橋体を得た。得られたゲル状のエラスチン架橋体を脱イオン水で充分洗浄し両端を指で引っ張り簡易伸張試験を行った結果、伸長の変形に対して壊れやすかった。
実験例４（架橋剤として水溶性カルボジイミドを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１０．４μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン５０ｍｇを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に２７４ｍＭ水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ、ペプチド研究所社製）水溶液１０．４μｌを加え、更に６４５ｍＭアジピン酸水溶液２４．４μｌ加えよくかき混ぜ、３０％エラスチン水溶液を作成した。結果、長鎖ジカルボン酸は脱イオン水には溶解せず（アルカリ性の場合は溶解するが、その場合はカルボジイミドとの反応性が速く、やはり溶解不完全のまま一部固化し、各種テンプレート（型：ガラス管、膜作成用型など）に流し込むのは不可能であった。
実験例５（架橋剤として光反応性スクシンイミドエステルを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１ｍｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン１３ｍｇおよび光反応性スクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ＡＳＡ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドアルチル酸（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ），ピアス社製（ＰＩＥＲＣＥ））４ｍｇを加え溶解させ、室温で１日反応させた。反応終了後、未反応物を除去し精製し、光反応性エラスチン７ｍｇを得た。これに脱イオン水２０μｌを加えて光反応性エラスチン水溶液とし、３６５ｎｍの紫外線（ＵＶ）照射を９０分間行いゲル状化させた。ゲル化後は脱イオン水で充分洗浄した。結果、架橋剤は水不溶性であるため反応性は低く、有機溶媒中ではエラスチンが不溶化するためやはり反応性が悪かった。光照射に関しても、エラスチン水溶液の濃度が薄い（数％）場合はＵＶ光が透過するが、１０％以上の濃度では、光の照射面のみの反応で集結するためゲル化率が悪く、テンプレート内での反応はほぼ不可能であった。
実験例６（架橋剤としてアジピン酸スクシンイミドエステルを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１１９μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン６０ｍｇを加え溶解させた後、３８５ｍＭアジピン酸スクシンイミドエステル水溶液を２１μｌ加え、該水溶液を直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込み、８０℃で１時間加熱しゲル化させた。結果、架橋剤が一部不溶化しているためか、生成したゲルは弱い（テンプレートの形はなしていない）。ドデカンジカルボン酸スクシンイミドエステルは水に不溶のため反応しなかった。
実験例７（水溶性架橋剤［Ａ］の作製）
ジカルボン酸のカルボキシル基を４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｉｕｍｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（４−ヒドロキシフェニルジメチル−スルホニウムメチルサルフェイト：以下ＤＳＰ）により活性エステル化させた。ＤＳＰによる活性エステル化には、ペプチド化学等で報告されている方法（Ｋ．Ｋｏｕｇｅ，Ｔ．Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｈ．Ｏｋａｉ，ａｎｄ Ｔ．Ｋａｔｏ．（１９８７）Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６０，２４０９．（日本化学会報誌）を用いて、以下の実験を行った。
ドデカンジカルボン酸（２．５ｍｍｏｌ）とＤＳＰ（５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３５ｍｌ）に６０℃で溶解し、放冷後ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ジシクロヘキシルカルボジイミド：以下ＤＣＣ）（５ｍｍｏｌ）を加え２５℃で５時間撹拌した。その後反応中に生じたジシクロヘキシル尿素（以下ＤＣ−Ｕｒｅａ）をガラスフィルターでろ過し除去した。更に、反応溶液（ろ液）をエーテル（７０ｍｌ）に滴下して固化させた。該固形物を減圧乾燥して、本発明の水溶性架橋剤［Ａ］１．４ｇを得た。得られた架橋剤の純度は１Ｈ−ＮＭＲ（ＪＮＭ−ＥＸ−５００，ＪＥＯＬ）による測定で９８％であった。
実験例８（架橋剤として実験例７で得た水溶性架橋剤［Ａ］を使用しエラスチン成形体を作製）
脱イオン水１ｍｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン２００ｍｇを加えてよく撹拌し、２０％水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液の温度を２５℃とし、これに実験例７で得た水溶性架橋剤［Ａ］７２μｍｏｌ（該水溶液中のエラスチンのアミノ基量（２４μｍｏｌ）の３倍量）を加え５分間撹拌した。次にトリエチルアミンを２４μｍｏｌ加え更に５分間撹拌した後、直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込み２日間静置しゲル化させ、脱イオン水で充分洗浄し乳白色で弾性に富む棒状のエラスチン成形体を得た。また、得られたエラスチン成形体を１１０℃で１０分間オートクレーブ処理を行い、形状に変化が見られない滅菌されたエラスチン成形体を得た。得られたエラスチン成形体のヤング率を引っ張り強度試験機を用いて測定した結果を表２に示す。但し測定は得られたエラスチン成形体をそのまま使用し水中にて行った。また、得られたエラスチン成形体の切断面を９０倍の倍率で走査型顕微鏡撮影した物を図１に示す。電子顕微鏡写真から、エラスチン架橋体の内部構造は、空隙を有するスポンジ構造であり、その平均直径は６２μｍであった。空隙の異なるエラスチン架橋体の弾性率を表２に示した。
【表２】
実験例９（架橋剤として実験例７で得た水溶性架橋剤［Ａ］を使用し架橋条件を変えエラスチン成形体を作製）
該水溶液の温度を５０℃とし静置時間を６時間とした以外は、実験例８の製造に準じて架橋反応並びに成形を行い、乳白色で弾性に富む棒状のエラスチン成形体を得た。得られたエラスチン成形体のヤング率を引っ張り強度試験機を用いて測定した結果を表２に示す。但し測定は得られたエラスチン成形体をそのまま使用し水中にて行った。また、得られたエラスチン成形体の切断面を９０倍の倍率で走査型顕微鏡撮影した物を図２に示す。電子顕微鏡写真から、エラスチン架橋体の内部構造は、空隙を有するスポンジ構造であり、その平均直径は９μｍであった。
実験例１０（エラスチン含有量を全体の１％としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン０．８ｍｇおよびゼラチン７２ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図３）を得た。
実験例１１（エラスチン含有量を全体の１０％としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン８ｍｇおよびゼラチン７２ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図４）を得た。
実験例１２（エラスチン含有量を全体の９０％としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン７２ｍｇおよびゼラチン８ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図５）を得た。
実験例１３（エラスチン含有量を全体の０％としたゼラチン架橋体およびその成形体を作製）
ゼラチン８０ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体およびその成形体（図６）を得た。
実験例１０〜１３の結果をまとめると、エラスチン含有が０％の場合は膨潤が大きいが（水中で、６時間後、テンプレートの直径の２．３倍程度にまで膨潤した）、１％含有のゲルからは形状がしっかりしたゲルが形成された（図７：エラスチン含有０，１，１０，９０％）。他のゲルの膨潤性は１％ゲルでテンプレートの１．５倍程度、１０％ゲルでテンプレートの１．４倍程度、９０％ゲルでテンプレートの１．１倍程度であった。
エラスチンの含有率が高くなるにつれ、その形状安定性は高い。伸長させた場合は、弾性率は不明だが含有率の低いゲルの方がちぎれやすく、強度が低い。
ゲルの色は水溶性エラスチン溶液が黄色なため含有率が高くなるにつれ、その影響が出て黄色味を帯びた。
実験例１４（架橋原料がさらに糖質を含有したエラスチン架橋体およびそのエラスチン成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン７５ｍｇおよびヘパリン５ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図８）を得た。
実験例１５（ヘパリン含有の確認）
作成したゲルを脱イオン水で充分洗浄した後、１％トルイジンブルー”０”水溶液中で染色した。トルイジンブルー”０”はヘパリンに結合すると青→紫に染色される。図９よりヘパリンがゲルに取り込まれていることが確認できた。
実験例１６（エラスチン膜の作製）
リペルシラン処理（シリコンコート）したスライドガラスを２枚用い、スペーサーとしてシリコンゴムシートを用いた成形用の型を用意し、実験例１で得た３０％水溶性エラスチン水溶液と実験例７で作製した水溶性架橋剤（エラスチンのアミノ基に対して３倍モル）を混合した溶液を流し込み、外部より空気・水が入らないようにした。この状態を保ちながら水中で８０℃、３０分間加熱処理し、エラスチン膜（図１０）を得た。
実験例１７（エラスチン各種成形体の調製）
各種成形用の型を用意し、３０％水溶性エラスチン水溶液と実験例７で作製した水溶性架橋剤（エラスチンのアミノ基に対して３倍モル）を混合した溶液を流し込み、外部より空気・水が入らないようにした。この状態を保ちながら水中で８０℃、３０分間加熱処理し、チューブ状（図１１）、糸状（図１２）、ペレット状（図１３）の成形物を得た。
実験例１８（細胞培養方法と増殖速度）
組織培養用プラスチックシャーレ（６穴）にエラスチン膜（厚さ０．５ｍｍ，１ｃｍ×１ｃｍ）をおき、培養液を２ｍｌ加え３７℃で３０分間静置した。培養液はＭＥＭハンクス 粉末２．５７ｇに脱イオン水２１５ｍｌを加え溶解した後、重曹溶液（７．５％）を１．１７ｍｌ、グルタミン溶液（２００ｍＭ）を２．５ｍｌ、非必須アミノ酸溶液を２．５ｍｌ添加、ゲンタマイシン５ｍｌそして牛胎児血清を２５ｍｌ添加して作製した。
これに神経細胞芽腫細胞（ニューロブラストーマ、ＩＨＲ−３２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１２７）を１．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ濃度で１００μｌ播種して２４時間３７℃でインキュベーションした後、経時的に細胞数を細胞計測板あるいは直接観察にて計測した。
対象として、アルブミンコートを用いた場合の、細胞増殖性を評価した。また培地は毎日交換した。実験回数は３回行った。
（結果）エラスチン（シート）の細胞播種から３日後の細胞増殖率は約４倍程度。アルブミンコートの場合は細胞播種から３日後の細胞増殖率は約１．５倍程度であった。増殖曲線を図１４に示した。
実験例１９（繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）とヘパリンを含有したエラスチンゲル）
水溶性エラスチン７５ｍｇおよびヘパリン５ｍｇに脱イオン水１４８１μｌを加え溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤（２７８ｍＭ）３９μｌを加え、３０％エラスチン水溶液を作成する。溶液を成形型に流し込み、１２０℃（オートクレーブ）で３０分加熱して反応させた。作成したゲルを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２μｇ／ｍｌ塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２４時間浸し、ゲルに含有したヘパリンに吸着させた。得られた成形物を図１５に示した。
産業上の利用可能性
本発明のエラスチン架橋体は、細胞接着性タンパク質の脱理が起こらず、生体移植に適合し得る弾性を有した材料であるため、従来の材料に生じていた長期の治療の間に該細胞接着性タンパク質が脱離する問題や、神経や血管などの組織の再生が不十分である問題などを解決する効果を有する。
また、本発明の水溶性架橋剤は、水溶性エラスチンを架橋し、鋳型があればどんな成形も可能な弾性を有するエラスチン架橋体が得られるため、その成形体を糸状や膜状、棒状、ペレット状、チューブ状、更には再生医療用材料や医療用器具材料などに加工し、幅広い用途での利用を可能とする効果を有する。
更に、本発明のエラスチン架橋体は、空隙を有するスポンジ構造を形成することから、薬剤などの浸透や、他の材料との複合を容易に行うことができ、新しい医療用材料の提供を可能とする効果を有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例８の本発明のエラスチン架橋体の電子顕微鏡写真図である（２５℃で反応）。
図２は、実施例９の本発明のエラスチン架橋体の電子顕微鏡写真図である（５０℃で反応）。
図３は、実施例１０のエラスチン１％ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図４は、実施例１１のエラスチン１０％ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図５は、実施例１２のエラスチン９０％ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図６は、実施例１３のエラスチン０％／ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図７は、エラスチン０〜９０％／ゼラチン架橋成形体比較写真図である。
図８は、実施例１４のヘパリン含有エラスチン架橋成形体を示す図である。
図９は、実施例１５のヘパリン含有確認試験を示す図である。
図１０は、実施例１６のシート状エラスチン架橋体を示す図である。
図１１は、実施例１７のシート状エラスチン架橋体を示す図である。
図１２は、実施例１７の糸状エラスチン架橋体を示す図である。
図１３は、実施例１７のペレット状エラスチン架橋体を示す図である。
図１４は、細胞接着性タンパク質上での神経細胞芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）の増殖カーブを示す図である。記号はゼラチン（△），エラスチン（●），アルブミン（□）、Ｎｏはタンパク質をコートした培養プレート上の初期細胞数、Ｎｔは測定時の細胞数を意味する。
図１５は、実施例１９の線維芽細胞増殖因子含有エラスチン／ヘパリン架橋体を示す図である。
本発明は、生体適合性機能性材料、およびその製造方法、医療用器具、架橋剤、外科治療方法、さらに再生組織に関する。
背景技術
事故、災害その他の理由で神経組織が切断された患者に対する治療方法の一つとして、人工材料によるチューブを神経欠損部に連結して、該チューブ内に神経組織の再生を誘導する方法が行われている。該チューブとしては、シリコーン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、アルギン酸、ポリ乳酸等のチューブの内面を、コラーゲンやラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングしたものが用いられている。
また、血管が切断された患者に対する治療方法の一つとして、シリコーン、ポリウレタン、ポリエステルなどの合成高分子繊維を編んだ布を管状とし、その内面をコラーゲンやラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングした人工血管を、血管切断部位に移植し、該人工血管内部に内皮細胞を誘導させる方法が行われている。
発明の開示
前述のシリコーンチューブやポリウレタンチューブなどの内面は、細胞接着性がないためこれまでは、コラーゲンやラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングしたチューブや該人工血管を、前述のような治療方法に用いた場合には、長期の治療の間に該細胞接着性タンパク質が脱離し、神経や血管などの組織の再生が不十分であった。
さらに、動物内に移植するチューブや人工血管には、人体および各組織の動きに連動するだけの弾性が求められているが、シリコーンやポリエステルを主原料とするチューブや人工血管のヤング率（弾性率）は、適応された組織のヤング率（弾性率）が１ｘ１０４〜２ｘ１０６Ｐａであるのに対し、１ｘ１０７Ｐａ以上であるため、接合部に強いストレスが起こり、その結果、血栓が生じるなどの問題を抱えており、人体の組織と同じ弾性を有する材料が求められていた。
本発明者は前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、水溶性エラスチンを架橋剤により架橋することにより、コーティングしたコラーゲンやラミニン等の細胞接着性タンパク質の脱離が起こらず、生体の移植に適合し得るだけの弾性を有するエラスチン架橋体を得ることができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は下記の構成を有する。
（１）水溶性エラスチンから選ばれた１種以上を含有する架橋原料が、水溶性架橋剤で架橋されてなるエラスチン架橋体。
（２）架橋原料がさらにコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上を含有する（１）記載のエラスチン架橋体。
（３）水溶性エラスチンの含有率が０．５〜９９．５重量％の範囲である（１）記載のエラスチン架橋体。
（４）ヤング率が１×１０２〜１×１０７Ｐａの範囲である（１）記載のエラスチン架橋体。
（５）内部構造が空隙を有するスポンジ構造である（１）記載のエラスチン架橋体。
（６）空隙の平均直径が２０μｍ未満の範囲である（５）記載のエラスチン架橋体。
（７）空隙の平均直径が２０μｍ〜２ｍｍの範囲である（５）記載のエラスチン架橋体。
（８）コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチンガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上が化学的に結合されてなる（１）または（２）記載のエラスチン架橋体。
（９）化学的結合が架橋剤を用いた架橋である（８）記載のエラスチン架橋体。
（１０）コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上を含有する（１）、（２）または（８）記載のエラスチン架橋体。
（１１）水溶性架橋剤が分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にアミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物である（１）記載のエラスチン架橋体。
（１２）水溶性架橋剤が、下記一般式で表される水溶性化合物であることを特徴とする（１）記載のエラスチン架橋体。
＜一般式＞
＜Ａ＞
＜Ｂ＞
＜Ｃ＞
（１３）（１）〜（１２）の何れか１項記載のエラスチン架橋体からなるエラスチン成形体。
（１４）形状が、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状である（１３）記載のエラスチン成形体。
（１５）（１）記載のエラスチン架橋体を用いた医療用器具。
（１６）（１５）記載の医療用器具を用いることを特徴とする外科治療方法。
（１７）（１）記載のエラスチン架橋体、（１５）記載の医療用器具を用いることを特徴とする再生医療。
（１８）（１）記載のエラスチン架橋体を用いて得られた再生組織。
（１９）分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にアミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物を含有する架橋剤。
（２０）化合物が、下記一般式で表される化合物である（１９）記載の架橋剤。
＜一般式＞
＜Ａ＞
＜Ｂ＞
＜Ｃ＞
（２１）（１９）記載の水溶性架橋剤を用いた架橋反応により、水溶性エラスチンを架橋することを特徴とするエラスチン架橋体の製造方法。
（２２）架橋反応時の反応温度が４〜１５０℃の範囲であることを特徴とする（２１）記載のエラスチン架橋体の製造方法。
発明の実施の形態
本発明に使用する水溶性エラスチンとは特に限定されるものではないが、エラスチンを加水分解して得られるものであり、具体的には、動物の頚靭帯などを熱シュウ酸処理して得られるα−エラスチン若しくはβ−エラスチン、エラスチンをアルカリエタノール処理して得られるκ−エラスチン、エラスターゼにより酵素処理した水溶性エラスチンおよびエラスチン生合成経路における前駆体であるトロポエラスチンなどの少なくとも１種以上のエラスチンを使用することができる。トロポエラスチンは特に限定されるものではなく動物細胞からの抽出物でも、遺伝子組換え法により得られるトロポエラスチン遺伝子産物の少なくとも１種類以上を使用することができる。
弾性タンパク質であるエラスチンは、通常、生体内において、大動脈や声帯など弾性が要求される体内組織に多く存在する。生体内に存在するエラスチンは、疎水性アミノ酸の含有量が多いことと、デスモシン、イソデスモシンなどの強固な架橋構造を有することから水不溶性の性質を持つ。該エラスチンは、こうした架橋構造により油状コイルと呼ばれる特有の構造を形成するために弾性を有している。
本発明のエラスチン架橋体は、生体内エラスチンの架橋構造を分解し水溶性にした水溶性エラスチンから選ばれた１種以上を水溶性架橋剤で架橋して得ることができる。また本発明のエラスチン成形体は、前述の水溶性エラスチンと水溶性架橋剤を混ぜ合わせ水溶性エラスチン水溶液とした後、成形用のテンプレートなどに流し込み、加熱などで架橋させて得ることができる。
本発明のエラスチン架橋体は、水溶性エラスチンおよび架橋剤以外の第３成分を含有するものであってもよい。該成分は特に限定されるものではない。該成分には、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質やポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナン等の糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）などの細胞増殖因子、その他ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、ポリリンゴ酸などの化合物を挙げることができる。さらにはそれらの１種以上を含有しても何ら問題はない。特にコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸など細胞外マトリクス成分やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）などの細胞増殖因子は細胞の接着および増殖を高めるために好ましい。
本発明のエラスチン架橋体に含有する水溶性エラスチンの割合は、エラスチン架橋体に対して０．５〜９９．５重量％の範囲であることが好ましい。更に好ましくは１〜９５％であり、この範囲であれば生体に適した弾性を有する成形性良好な成形体を得ることができる。
水溶性エラスチンは、全重量の約９４％が疎水性アミノ酸、約１％が側鎖にアミノ基を含むアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）で形成された疎水性タンパク質である。本発明に使用する水溶性架橋剤は、水溶性エラスチンの側鎖のアミノ基と反応し、架橋反応するものであれば何れの水溶性架橋剤であっても使用することができる。該水溶性架橋剤としては例えば、グルタルアルデヒド、エチレングリシジルエーテルなどや下記一般式で表される分子中心領域に疎水性部を有し、両末端に活性エステル基を有する化合物などを挙げることができる。中でも下記一般式で表される化合物を架橋剤として用いると、生体に適した弾性を有する成形性良好な成形体を得ることができ好ましい。
＜一般式＞
＜Ａ＞
＜Ｂ＞
＜Ｃ＞
分子中心領域に疎水性部を有する化合物は、疎水性アミノ酸を多く含むエラスチンと、疎水相互作用により強固で安定した構造体を形成する。しかし、疎水性部を多く含む化合物は、有機溶媒には可溶ではあるが、水に難溶または不溶となり水系で取り扱いにくい。本発明の水溶性架橋剤は上記一般式で表されるジカルボン酸化合物の両末端を４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｉｕｍｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（４ヒドロキシフェニルジメチル−スルホニウムメチルサルフェイト：以下ＤＳＰ）で活性エステル化させたもので、疎水性アミノ酸を多く含むエラスチンと強固な安定した構造体を取る疎水性部を有しながら、かつ水に溶解し水系で取り扱える特徴を有するものである。
また本発明の水溶性架橋剤は、その化学式の両末端の活性エステル基が、水溶性エラスチンのアミノ酸とペプチド結合し、架橋する。従って、本発明の水溶性架橋剤により架橋して得られたエラスチン架橋体は、生体内で生分解を受け易い特徴を有する。その生分解速度は、エラスチン架橋体の架橋度と関係するため、架橋条件を変え架橋度を変えることにより制御することができる。
本発明のエラスチン架橋体の構造は、特に限定するものではないが、体液や培養液などが浸透できるように空隙を有するスポンジ構造であることが好ましい。該空隙の大きさは特に限定されるものではないが、その平均直径が２０μｍ未満の場合、ヤング率（弾性率）が高く硬い架橋体を得やすい。また、２０μｍ〜２ｍｍの範囲の場合、ヤング率（弾性率）が低く膨潤度の高い成形可能な架橋体を得やすい。
本発明のエラスチン架橋体は、弾性に優れる架橋体であるが、生体に適合し易くするためにヤング率（弾性率）１×１０２〜１×１０７Ｐａの範囲が好ましく、特に１×１０３〜２×１０６Ｐａの範囲が好ましい。
本発明のエラスチン成形体の形状は特に限定されるものではないが、医療用途への適用では、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状などであることが好ましい。
さらに、本発明のエラスチン架橋体は、それのみで特定の構造体を形成してもよく、あるいはエラスチン架橋体以外の成分と複合体を形成させても良い。また、エラスチン架橋体以外の構造体の表面コーティングに用いても良い。複合体を形成させる成分としては、特に限定されるものではないが、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質やポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナン等の糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）などの細胞増殖因子、その他ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、ポリリンゴ酸などの化合物を挙げることができる。さらにはこれらを１種以上を用いてもよい。これによりエラスチンにない細胞接着性や坑血栓性等の生体機能を付与でき、また目的とする組織の増殖速度を速めることもできる。
水溶性エラスチンと水溶性架橋剤との架橋反応の条件は特に限定されるものではないが、反応温度は常圧またはオートクレーブなどの加圧下で４〜１５０℃の範囲であることが好ましい。特に架橋の操作性の点から１０〜１２０℃の範囲が好ましい。また本発明のエラスチン架橋体が空隙を有するスポンジ状である場合には、反応温度を制御することにより、空隙の直径を制御することができる。例えば、反応温度が４〜５０℃の範囲では、空隙の平均直径が２０μｍ以上の架橋体を得ることができ、５０〜１５０℃の範囲では空隙の平均直径が２０μｍ未満の架橋体を得ることができる。
本発明のエラスチン架橋体の成形方法は特に限定されるものではないが、一般的な合成樹脂の成形に用いられる成形用の型を用いて得ることができる。例えば水溶性エラスチンと本発明の水溶性架橋剤を混ぜ合わせ、水溶性エラスチン水溶液とした後、成形器に流し込み、オートクレーブなどで加熱し架橋させると、その鋳型を反映した糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状などのエラスチン架橋体を得ることができる。
本発明のエラスチン架橋体は、生体と同じ領域の弾性を有するため伸縮性に優れ、化粧品、医療用具として有効に用いることができる。特に限定されるわけではないが、例えば化粧品としては、スキンケア商品としてのフェイスマスク用基材として利用できる。医療用具としても特に限定されるわけではないがカテーテル、シャンテ、創傷被覆剤等の部品に成形し適用したものは、従来にない柔軟な機能を提供することとなる。
またこれらを再生医療用材料として本発明の医療器具を体内に埋め込んだ場合には、目的とする組織が体内で順調に増殖し易くなる。特に前述した神経細胞や血管に対して有効である。
さらに細胞増殖速度を速め、生体適合性を改善するために、エラスチン架橋体と第３成分を含有させて本来のエラスチンにはない機能を付与することもできる。例えば、坑血栓性があり細胞増殖因子と相互作用するヘパリンや細胞増殖因子を含有させることができる。
これらの第３成分は、エラスチン架橋体を作製するときに、予め原料として加えておき架橋体を形成させてもよく、またエラスチン架橋体を形成させた後、その構造体に含浸させたり、その後乾燥させて物理的に吸着させたりしても良い。また更には、第３成分の脱理を抑えるために該エラスチン架橋体に化学的に固定化しても良い。
本発明のエラスチン架橋体はＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）の一つである徐放担体としても使用できる。特に本発明のエラスチン架橋体は高いヤング率（弾性率）と空隙を有するスポンジ構造体を得ることができ、神経、血管などの治療に効果を発揮することができる。
本発明の医療用具は、前述のような機能、効果を有することから、外科治療法に用いた場合には特に有効である。例えば現在シートの片面にフィブリン、トロンビン等の血液凝固成分を固着させたコラーゲンシートが、手術後の止血用接着剤として用いられている。これは、手術によって生じた内臓の出血個所をシートで多い、血液凝固成分による止血とコラーゲン膜による物理的圧迫による止血の相乗効果と、取扱い易さを狙ったものであるが、コラーゲンシートは伸縮性が乏しく、心臓のような激しく動く臓器に適用した場合、圧着性が良くなかった。これに本発明のエラスチン架橋膜を使用することで、伸縮性が高く臓器の動きに対応できる膜を得ることができる。また更には、本発明のエラスチン架橋膜とコラーゲンの複合体を形成させれば、エラスチンの持つ伸縮性とコラーゲンの持つ細胞接着性の両者の特徴を有する、極めて生体適合性の高い膜が得られる。
本発明のエラスチン架橋体は、前述の様に体内に埋め込み、血管や神経の再生の場としても利用できるが、この機能を体外でも利用することができる。すなわち、再生医療用培養基材として、本発明の膜表面、チューブ内に、方向付けされた胚性幹（ＥＳ）細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞などを移植、培養することで、希望する形態の臓器を形成させることが可能となる。本発明のエラスチン架橋体は、成形性が良いだけでなく生分解性でもあるため、ある程度培養し、形を形成させた臓器を培養基材ごと移植するカートリッジ型の再生医療方法と再生組織を提供できる。
実施例
以下実施例をもって本発明を詳細に説明する。本実施例においては特に断りがない限り「％」は「重量％」を意味する。
実験例１（水溶性エラスチンの調製）
粉末状水不溶性エラスチン（エラスチン・プロダクト（Ｅｌａｓｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）社製）２０ｇに対し０．２５Ｍシュウ酸１５０ｍｌを加え、１００℃にて１時間処理する。冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）し、上澄みを集めセルロース性透析チューブ（分画分子量６千〜１万）に入れ、脱イオン水に対して４８時間透析しシュウ酸を除去する。その後凍結乾燥して水溶性エラスチンを得た。原料エラスチンと水溶性エラスチンのアミノ酸分析結果を表１に示した。
【表１】
脱イオン水１６１μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン９０ｍｇを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に２５０ｍＭグルタルアルデヒド水溶液（東京化成社製）４８．７μｌを加え、直後にゲル状のエラスチン架橋体を得た。該ゲル状のエラスチン架橋体は成形用の直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込もうとしたが、流動性が小さく流し込むことはできなかった。２５０ｍＭグルタルアルデヒド水溶液の添加量を前述の１／１０の量に下げても、テンプレートに流し込むことが困難であった。
実験例３（架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテルを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水４１．６μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン３６ｍｇを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に２８７ｍＭエチレングリコールジグリシジルエーテル水溶液４２．４μｌを加えよくかき混ぜ、その溶液を直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込み、５０℃、１時間加熱してゲル状のエラスチン架橋体を得た。得られたゲル状のエラスチン架橋体を脱イオン水で充分洗浄し両端を指で引っ張り簡易伸張試験を行った結果、伸長の変形に対して壊れやすかった。
実験例４（架橋剤として水溶性カルボジイミドを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１０．４μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン５０ｍｇを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に２７４ｍＭ水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ、ペプチド研究所社製）水溶液１０．４μｌを加え、更に６４５ｍＭアジピン酸水溶液２４．４μｌ加えよくかき混ぜ、３０％エラスチン水溶液を作成した。結果、長鎖ジカルボン酸は脱イオン水には溶解せず（アルカリ性の場合は溶解するが、その場合はカルボジイミドとの反応性が速く、やはり溶解不完全のまま一部固化し、各種テンプレート（型：ガラス管、膜作成用型など）に流し込むのは不可能であった。
実験例５（架橋剤として光反応性スクシンイミドエステルを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１ｍｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン１３ｍｇおよび光反応性スクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ＡＳＡ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドアルチル酸（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ），ピアス社製（ＰＩＥＲＣＥ））４ｍｇを加え溶解させ、室温で１日反応させた。反応終了後、未反応物を除去し精製し、光反応性エラスチン７ｍｇを得た。これに脱イオン水２０μｌを加えて光反応性エラスチン水溶液とし、３６５ｎｍの紫外線（ＵＶ）照射を９０分間行いゲル状化させた。ゲル化後は脱イオン水で充分洗浄した。結果、架橋剤は水不溶性であるため反応性は低く、有機溶媒中ではエラスチンが不溶化するためやはり反応性が悪かった。光照射に関しても、エラスチン水溶液の濃度が薄い（数％）場合はＵＶ光が透過するが、１０％以上の濃度では、光の照射面のみの反応で集結するためゲル化率が悪く、テンプレート内での反応はほぼ不可能であった。
実験例６（架橋剤としてアジピン酸スクシンイミドエステルを使用しエラスチン架橋体を作製）
脱イオン水１１９μｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン６０ｍｇを加え溶解させた後、３８５ｍＭアジピン酸スクシンイミドエステル水溶液を２１μｌ加え、該水溶液を直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込み、８０℃で１時間加熱しゲル化させた。結果、架橋剤が一部不溶化しているためか、生成したゲルは弱い（テンプレートの形はなしていない）。ドデカンジカルボン酸スクシンイミドエステルは水に不溶のため反応しなかった。
実験例７（水溶性架橋剤［Ａ］の作製）
ジカルボン酸のカルボキシル基を４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｉｕｍｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（４−ヒドロキシフェニルジメチル−スルホニウムメチルサルフェイト：以下ＤＳＰ）により活性エステル化させた。ＤＳＰによる活性エステル化には、ペプチド化学等で報告されている方法（Ｋ．Ｋｏｕｇｅ，Ｔ．Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｈ．Ｏｋａｉ，ａｎｄ Ｔ．Ｋａｔｏ．（１９８７）Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６０，２４０９．（日本化学会報誌）を用いて、以下の実験を行った。
ドデカンジカルボン酸（２．５ｍｍｏｌ）とＤＳＰ（５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３５ｍｌ）に６０℃で溶解し、放冷後ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ジシクロヘキシルカルボジイミド：以下ＤＣＣ）（５ｍｍｏｌ）を加え２５℃で５時間撹拌した。その後反応中に生じたジシクロヘキシル尿素（以下ＤＣ−Ｕｒｅａ）をガラスフィルターでろ過し除去した。更に、反応溶液（ろ液）をエーテル（７０ｍｌ）に滴下して固化させた。該固形物を減圧乾燥して、本発明の水溶性架橋剤［Ａ］１．４ｇを得た。得られた架橋剤の純度は１Ｈ−ＮＭＲ（ＪＮＭ−ＥＸ−５００，ＪＥＯＬ）による測定で９８％であった。
実験例８（架橋剤として実験例７で得た水溶性架橋剤［Ａ］を使用しエラスチン成形体を作製）
脱イオン水１ｍｌに、実験例１で得た水溶性エラスチン２００ｍｇを加えてよく撹拌し、２０％水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液の温度を２５℃とし、これに実験例７で得た水溶性架橋剤［Ａ］７２μｍｏｌ（該水溶液中のエラスチンのアミノ基量（２４μｍｏｌ）の３倍量）を加え５分間撹拌した。次にトリエチルアミンを２４μｍｏｌ加え更に５分間撹拌した後、直径２ｍｍ、長さ２ｃｍ円柱状のテンプレートに流し込み２日間静置しゲル化させ、脱イオン水で充分洗浄し乳白色で弾性に富む棒状のエラスチン成形体を得た。また、得られたエラスチン成形体を１１０℃で１０分間オートクレーブ処理を行い、形状に変化が見られない滅菌されたエラスチン成形体を得た。得られたエラスチン成形体のヤング率を引っ張り強度試験機を用いて測定した結果を表２に示す。但し測定は得られたエラスチン成形体をそのまま使用し水中にて行った。また、得られたエラスチン成形体の切断面を９０倍の倍率で走査型顕微鏡撮影した物を図１に示す。電子顕微鏡写真から、エラスチン架橋体の内部構造は、空隙を有するスポンジ構造であり、その平均直径は６２μｍであった。空隙の異なるエラスチン架橋体の弾性率を表２に示した。
【表２】
該水溶液の温度を５０℃とし静置時間を６時間とした以外は、実験例８の製造に準じて架橋反応並びに成形を行い、乳白色で弾性に富む棒状のエラスチン成形体を得た。得られたエラスチン成形体のヤング率を引っ張り強度試験機を用いて測定した結果を表２に示す。但し測定は得られたエラスチン成形体をそのまま使用し水中にて行った。また、得られたエラスチン成形体の切断面を９０倍の倍率で走査型顕微鏡撮影した物を図２に示す。電子顕微鏡写真から、エラスチン架橋体の内部構造は、空隙を有するスポンジ構造であり、その平均直径は９μｍであった。
実験例１０（エラスチン含有量を全体の１％としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン０．８ｍｇおよびゼラチン７２ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図３）を得た。
実験例１１（エラスチン含有量を全体の１０％としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン８ｍｇおよびゼラチン７２ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図４）を得た。
実験例１２（エラスチン含有量を全体の９０％としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン７２ｍｇおよびゼラチン８ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図５）を得た。
実験例１３（エラスチン含有量を全体の０％としたゼラチン架橋体およびその成形体を作製）
ゼラチン８０ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体およびその成形体（図６）を得た。
実験例１０〜１３の結果をまとめると、エラスチン含有が０％の場合は膨潤が大きいが（水中で、６時間後、テンプレートの直径の２．３倍程度にまで膨潤した）、１％含有のゲルからは形状がしっかりしたゲルが形成された（図７：エラスチン含有０，１，１０，９０％）。他のゲルの膨潤性は１％ゲルでテンプレートの１．５倍程度、１０％ゲルでテンプレートの１．４倍程度、９０％ゲルでテンプレートの１．１倍程度であった。
エラスチンの含有率が高くなるにつれ、その形状安定性は高い。伸長させた場合は、弾性率は不明だが含有率の低いゲルの方がちぎれやすく、強度が低い。
ゲルの色は水溶性エラスチン溶液が黄色なため含有率が高くなるにつれ、その影響が出て黄色味を帯びた。
実験例１４（架橋原料がさらに糖質を含有したエラスチン架橋体およびそのエラスチン成形体を作製）
実験例１で得た水溶性エラスチン７５ｍｇおよびヘパリン５ｍｇに脱イオン水１４８μｌを加えて溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤２７８ｍＭ、３９μｌ（架橋剤はエラスチンのアミノ基量の２倍に相当）加え、３０％水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、１２０℃、３０分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図８）を得た。
実験例１５（ヘパリン含有の確認）
作成したゲルを脱イオン水で充分洗浄した後、１％トルイジンブルー”０”水溶液中で染色した。トルイジンブルー”０”はヘパリンに結合すると青→紫に染色される。図９よりヘパリンがゲルに取り込まれていることが確認できた。
実験例１６（エラスチン膜の作製）
リペルシラン処理（シリコンコート）したスライドガラスを２枚用い、スペーサーとしてシリコンゴムシートを用いた成形用の型を用意し、実験例１で得た３０％水溶性エラスチン水溶液と実験例７で作製した水溶性架橋剤（エラスチンのアミノ基に対して３倍モル）を混合した溶液を流し込み、外部より空気・水が入らないようにした。この状態を保ちながら水中で８０℃、３０分間加熱処理し、エラスチン膜（図１０）を得た。
実験例１７（エラスチン各種成形体の調製）
各種成形用の型を用意し、３０％水溶性エラスチン水溶液と実験例７で作製した水溶性架橋剤（エラスチンのアミノ基に対して３倍モル）を混合した溶液を流し込み、外部より空気・水が入らないようにした。この状態を保ちながら水中で８０℃、３０分間加熱処理し、チューブ状（図１１）、糸状（図１２）、ペレット状（図１３）の成形物を得た。
実験例１８（細胞培養方法と増殖速度）
組織培養用プラスチックシャーレ（６穴）にエラスチン膜（厚さ０．５ｍｍ，１ｃｍ×１ｃｍ）をおき、培養液を２ｍｌ加え３７℃で３０分間静置した。培養液はＭＥＭハンクス 粉末２．５７ｇに脱イオン水２１５ｍｌを加え溶解した後、重曹溶液（７．５％）を１．１７ｍｌ、グルタミン溶液（２００ｍＭ）を２．５ｍｌ、非必須アミノ酸溶液を２．５ｍｌ添加、ゲンタマイシン５ｍｌそして牛胎児血清を２５ｍｌ添加して作製した。
これに神経細胞芽腫細胞（ニューロブラストーマ、ＩＨＲ−３２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１２７）を１．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ濃度で１００μｌ播種して２４時間３７℃でインキュベーションした後、経時的に細胞数を細胞計測板あるいは直接観察にて計測した。
対象として、アルブミンコートを用いた場合の、細胞増殖性を評価した。また培地は毎日交換した。実験回数は３回行った。
（結果）エラスチン（シート）の細胞播種から３日後の細胞増殖率は約４倍程度。アルブミンコートの場合は細胞播種から３日後の細胞増殖率は約１．５倍程度であった。増殖曲線を図１４に示した。
実験例１９（繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）とヘパリンを含有したエラスチンゲル）
水溶性エラスチン７５ｍｇおよびヘパリン５ｍｇに脱イオン水１４８１μｌを加え溶解させた後、実験例７で作製した水溶性架橋剤（２７８ｍＭ）３９μｌを加え、３０％エラスチン水溶液を作成する。溶液を成形型に流し込み、１２０℃（オートクレーブ）で３０分加熱して反応させた。作成したゲルを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２μｇ／ｍｌ塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２４時間浸し、ゲルに含有したヘパリンに吸着させた。得られた成形物を図１５に示した。
産業上の利用可能性
本発明のエラスチン架橋体は、細胞接着性タンパク質の脱理が起こらず、生体移植に適合し得る弾性を有した材料であるため、従来の材料に生じていた長期の治療の間に該細胞接着性タンパク質が脱離する問題や、神経や血管などの組織の再生が不十分である問題などを解決する効果を有する。
また、本発明の水溶性架橋剤は、水溶性エラスチンを架橋し、鋳型があればどんな成形も可能な弾性を有するエラスチン架橋体が得られるため、その成形体を糸状や膜状、棒状、ペレット状、チューブ状、更には再生医療用材料や医療用器具材料などに加工し、幅広い用途での利用を可能とする効果を有する。
更に、本発明のエラスチン架橋体は、空隙を有するスポンジ構造を形成することから、薬剤などの浸透や、他の材料との複合を容易に行うことができ、新しい医療用材料の提供を可能とする効果を有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例８の本発明のエラスチン架橋体の電子顕微鏡写真図である（２５℃で反応）。
図２は、実施例９の本発明のエラスチン架橋体の電子顕微鏡写真図である（５０℃で反応）。
図３は、実施例１０のエラスチン１％ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図４は、実施例１１のエラスチン１０％ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図５は、実施例１２のエラスチン９０％ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図６は、実施例１３のエラスチン０％／ゼラチン架橋成形体を示す図である。
図７は、エラスチン０〜９０％／ゼラチン架橋成形体比較写真図である。
図８は、実施例１４のヘパリン含有エラスチン架橋成形体を示す図である。
図９は、実施例１５のヘパリン含有確認試験を示す図である。
図１０は、実施例１６のシート状エラスチン架橋体を示す図である。
図１１は、実施例１７のシート状エラスチン架橋体を示す図である。
図１２は、実施例１７の糸状エラスチン架橋体を示す図である。
図１３は、実施例１７のペレット状エラスチン架橋体を示す図である。
図１４は、細胞接着性タンパク質上での神経細胞芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）の増殖カーブを示す図である。記号はゼラチン（△），エラスチン（●），アルブミン（□）、Ｎｏはタンパク質をコートした培養プレート上の初期細胞数、Ｎｔは測定時の細胞数を意味する。
図１５は、実施例１９の線維芽細胞増殖因子含有エラスチン／ヘパリン架橋体を示す図である。
Claims (22)
- 水溶性エラスチンから選ばれた１種以上を含有する架橋原料が、水溶性架橋剤で架橋されてなるエラスチン架橋体。
- 架橋原料がさらに、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上を含有する請求項１記載のエラスチン架橋体。
- 水溶性エラスチンの含有率が０．５〜９９．５重量％の範囲である請求項１記載のエラスチン架橋体。
- ヤング率が１×１０２〜１×１０７Ｐａの範囲のである請求項１記載のエラスチン架橋体。
- 内部構造が空隙を有するスポンジ構造である請求項１記載のエラスチン架橋体。
- 空隙の平均直径が２０μｍ未満の範囲である請求項５記載のエラスチン架橋体。
- 空隙の平均直径が２０μｍ〜２ｍｍの範囲である請求項５記載のエラスチン架橋体。
- コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上が化学的に結合された請求項１または２記載のエラスチン架橋体。
- 化学的結合が架橋剤を用いた架橋である請求項８記載のエラスチン架橋体。
- コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−α（形質転換増殖因子α）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＣＴＮＦ（毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた１種以上を含有する請求項１、２または８記載のエラスチン架橋体。
- 水溶性架橋剤が分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にアミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物である請求項１記載のエラスチン架橋体。
- 水溶性架橋剤が、下記一般式で表される水溶性化合物であることを特徴とする請求項１記載のエラスチン架橋体。
＜一般式＞
［Ｒ１、Ｒ３は下記の構造式で表される＜Ａ＞または＜Ｂ＞の何れかであり、Ｒ１とＲ３とは同じであっても異なっていてもよく、
＜Ａ＞
（Ｒ４、Ｒ５はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ４とＲ５とは同じであっても異なっていてもよい。）
＜Ｂ＞
（Ｒ２は下記の構造式で表される＜Ｃ＞または＜Ｄ＞の何れかで表される化合物であり、）
＜Ｃ＞
＜Ｄ＞
（ｍ、ｌは０〜１５までの整数であり、Ｘ、Ｙは、ＣＨ２またはＯの何れかであり、ＸとＹとは同じであっても異なっていてもよく、ＺはＣまたはＮの何れかであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５の何れかであり、それぞれ同じであっても異なっていても良い。） - 請求項１〜１２の何れか１項記載のエラスチン架橋体からなるエラスチン成形体。
- 形状が、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状である請求項１３記載のエラスチン成形体。
- 請求項１記載のエラスチン架橋体を用いた医療用器具。
- 請求項１５記載の医療用器具を用いることを特徴とする外科治療方法。
- 請求項１記載のエラスチン架橋体、請求項１５記載の医療用器具を用いることを特徴とする再生医療。
- 請求項１記載のエラスチン架橋体を用いて得られた再生組織。
- 分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にアミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物を含有する架橋剤。
- 化合物が、下記一般式で表される化合物である請求項１９記載の架橋剤。
＜一般式＞
（Ｒ１、Ｒ３は下記の構造式で表される＜Ａ＞または＜Ｂ＞の何れかであり、Ｒ１とＲ３とは同じであっても異なっていてもよく、）
＜Ａ＞
（Ｒ４、Ｒ５はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ４とＲ５とは同じであっても異なっていてもよい。）
＜Ｂ＞
（Ｒ２は下記の構造式で表される＜Ｃ＞または＜Ｄ＞の何れかで表される化合物であり、）
＜Ｃ＞
＜Ｄ＞
（ｍ、ｌは０〜１５までの整数であり、Ｘ、Ｙは、ＣＨ２またはＯの何れかであり、ＸとＹとは同じであっても異なっていてもよく、ＺはＣまたはＮの何れかであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５の何れかであり、それぞれ同じであっても異なっていても良い。） - 請求項１９記載の水溶性架橋剤を用いた架橋反応により、水溶性エラスチンを架橋することを特徴とするエラスチン架橋体の製造方法。
- 架橋反応時の反応温度が４〜１５０℃の範囲であることを特徴とする請求項２１記載のエラスチン架橋体の製造方法。
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| dos Santos Silva | Processing and surface modification of novel natural-origin architectures aimed for biomedical applications |
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