CN104710635B - 京尼平交联弹性蛋白水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了京尼平交联弹性蛋白水凝胶的制备方法，首先通过酸降解弹性蛋白制得水溶性弹性蛋白α‑弹性蛋白，然后利用α‑弹性蛋白的温敏性通过京尼平对其进行交联制备出弹性蛋白水凝胶。通过此方法制得的弹性蛋白水凝胶具有温敏性：在室温下为液态，高于室温时凝聚形成凝胶。同时本发明制得的水凝胶具有多孔结构，在药物释放方面具有很好的应用前景。
Description
本发明申请是发明专利申请“京尼平交联弹性蛋白水凝胶及其制备方法”的分案申请，母案“京尼平交联弹性蛋白水凝胶及其制备方法”的申请号为2013103892326，申请日为2013年8月29日。
技术领域
本发明属于高分子生物材料领域，涉及交联改性弹性蛋白的方法，更具体的讲，涉及利用京尼平交联弹性蛋白水凝胶及其制备方法。
背景技术
弹性蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白，主要存在于韧带、肺、大动脉及皮肤等经常受力而变形的器官中，主要功能是为所在组织和器官提高抵抗反复压缩和变形的能力。弹性蛋白作为细胞外基质的主要成分，具有很好的生物相容性，但由于其高度不溶性导致难以加工成形，限制了在生物工程领域的应用。因此通过对弹性蛋白进行酸降解得到的水解产物被频繁应用于合成弹性蛋白基复合材料。虽然酸降解后的结构存在多样性，但是其保持了弹性蛋白的氨基酸组成，仍然保持了弹性蛋白的诸多优点。
同时，弹性蛋白酸降解产物具有自组装和相转变的特征。当温度高于某一温度时，其通过分子间氢键作用发生自组装，从而导致发生凝聚，进而发生相分离。凝聚过程不仅受温度影响，同时溶液的浓度、pH值、盐浓度及杂质的影响，这些因素主要通过影响分子间疏水基团作用影响凝聚过程。尽管如此，弹性蛋白基材料依然是一个有待于进一步深入研究的领域。
弹性蛋白酸降解产物虽然具有温度敏感性，但是降解后弹性蛋白力学性能较差，故一般需要对降解后弹性蛋白进行改性才能进一步应用。本实验室成功的采用交联方法制备弹性蛋白水凝胶。目前常利用的化学交联剂有戊二醛，己二异氰酸酯，碳化二亚胺等，但是都具有很高的细胞毒性或交联的组织在植入后产生钙化现象。而京尼平作为交联剂，不仅能形成稳定的交联制品，与戊二醛相比还具有细胞毒性小和应用领域广泛等优点，是一种非常有前途的交联剂。所以本发明在此基础上成功利用京尼平对弹性蛋白进行交联同时制备出易于加工成形的弹性蛋白基水凝胶材料。
发明内容
本发明的技术目的旨在克服现有技术的不足,采用京尼平交联弹性蛋白方法制备弹性蛋白水凝胶，成功的通过交联方法制备出易于加工成形的弹性蛋白基水凝胶材料,即在保持弹性蛋白生物相容性的基础上，首先通过酸降解弹性蛋白制得水溶性弹性蛋白，然后采用京尼平对其进行交联，探索弹性蛋白基水凝胶的制备方法及其性能研究。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现:
京尼平交联弹性蛋白水凝胶，按照下述步骤进行：
步骤1，将α-弹性蛋白粉末后加入蒸馏水磁力搅拌下使其完全悬浮于水中；其中α-弹性蛋白溶液浓度为50-200mg/mL，搅拌时间为30min。
步骤2，将质量分数为1％的京尼平水溶液加入步骤1制得的悬浮液中进行交联反应并定形，定形后用蒸馏水清洗表面未反应的京尼平小分子至清洗完全，制得弹性蛋白水凝胶；其中所述京尼平与弹性蛋白质量比为0.5-5％，优选0.5-1％；交联反应温度为10-20℃，时间为12-24h；定形温度为37℃，时间为2-5h。
在步骤1中，选用的α-弹性蛋白可购于sigma，分子量为70—72KD(数均)，也可根据文献(Partridge S M,DavisH F,Biochem.J.,61,21(1955))按照如下步骤进行制备：
(1)用草酸溶液煮沸降解弹性蛋白，脱除脂肪及其他类型蛋白质；
(2)用草酸溶液煮沸降解(1)制得的弹性蛋白至全部降解，得到水解弹性蛋白。
(3)使用氢氧化钠溶液调节(2)所得的溶液pH值，收集沉淀。
(4)清洗(3)收集的沉淀，冻干，得到α-纯净弹性蛋白，备用。
在上述α-弹性蛋白的制备过程中，所述步骤(1)基质材料为牛颈韧带经丙酮浸泡进行初步脱脂，浸泡时间为24h，并切成约5mm×5mm×5mm规则粒状得到；所述的草酸溶液浓度为0.3-0.7mol/L，降解时间为30-60min；用蒸馏水洗净表面油脂及其他类型蛋白质。
所述步骤(2)所用草酸溶液浓度为1-2mol/L，降解时间为4-6h。
所述步骤(3)所用氢氧化钠溶液浓度为1-6mol/L，调节pH值到4-5，弹性蛋白凝聚形成沉淀。
所述步骤(4)沉淀采用大量蒸馏水除去小分子物质；冻干时间为24h；冻干后弹性蛋白研磨成细粉状。
本发明的反应原理为：京尼平上的烯碳原子受到弹性蛋白中游离氨基的亲核进攻，开环形成杂环胺化合物，然后是京尼平上的酯基团与氨基反应生成酰胺，同时释放出甲醇，从而发生交联反应。
本发明将冻干弹性蛋白粉末与交联后水凝胶进行扫描电镜对比分析(如图1和图2所示)，发现交联后弹性蛋白水凝胶具有明显的网状结构，而未交联的弹性蛋白粉末呈现颗粒状，由此可以证明弹性蛋白与京尼平发生了交联反应形成了网状结构。
同时，本发明对冻干后的水凝胶进行了交联度测试，研究发现当京尼平/弹性蛋白质量比为1.5％时，交联度已经达到90％，并且随着质量比的增大，交联度逐步增大。对不同质量配比的水凝胶进行了溶胀动力学研究，研究发现：随着交联剂质量比的增大溶胀效果逐渐变弱，交联剂/弹性蛋白质量比为0.6-0.8％时溶胀效果最佳。
本发明技术方案采用的原料价格低廉；制备方法简单，易于掌握；基于此种方法制备的弹性蛋白水凝胶具有温敏性，在室温下为液态，当温度高于室温时形成凝胶，易于加工成形。同时由于水凝胶的多孔结构，为其在药物释放上的应用奠定了良好的基础。
附图说明
图1是冻干α-弹性蛋白SEM照片(130×)。
图2是冻干后交联弹性蛋白SEM照片(97×)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步说明本发明的技术方案：
实施例1
(1)取新鲜牛颈韧带，用丙酮浸泡24小时，进行初步脱脂，挥干，并切成约5mm×5mm×5mm规则粒状；用0.3mol/L草酸溶液沸腾降解弹性蛋白40分钟，进一步脱除脂肪及其他类型蛋白质；用蒸馏水洗净表面油脂及其他类型蛋白质。
(2)用0.6mol/L草酸溶液沸腾降解步骤(1)得到的弹性蛋白6小时至全部降解，得到水解弹性蛋白。
(3)使用NaOH浓溶液调节(2)制得的溶液pH值至中性。
(4)将(3)所得的溶液进行透析，冻干，得到弹性蛋白酸降解产物，备用。
(5)称取(4)制备的α-弹性蛋白粉末后加入蒸馏水磁力搅拌30min使其完全悬浮于水中，浓度为50mg/mL。
(6)将质量比为1％京尼平溶液加入(5)制得的悬浮液中于10℃下交联24h，于37℃下定形12h，后用蒸馏水清洗表面未反应的京尼平小分子至清洗完全。制得弹性蛋白水凝胶。
实施例2
(1)取新鲜牛颈韧带，用丙酮浸泡24小时，进行初步脱脂，挥干，并切成约5mm×5mm×5mm规则粒状；用0.4mol/L草酸溶液沸腾降解弹性蛋白40分钟，进一步脱除脂肪及其他类型蛋白质；用蒸馏水洗净表面油脂及其他类型蛋白质。
(2)用0.8mol/L草酸溶液沸腾降解步骤(1)得到的弹性蛋白5.5小时至全部降解，得到水解弹性蛋白。
(3)使用NaOH浓溶液调节(2)制得的溶液pH值至中性。
(4)将(3)所得的溶液进行透析，冻干，得到弹性蛋白酸降解产物，备用。
(5)称取(4)制备的α-弹性蛋白粉末后加入蒸馏水磁力搅拌30min使其完全悬浮于水中，浓度为75mg/mL。
(6)将质量比为2％京尼平溶液加入(5)制得的悬浮液中于15℃下交联20h，于37℃下定形10h，后用蒸馏水清洗表面未反应的京尼平小分子至清洗完全。制得弹性蛋白水凝胶。
实施例3
(1)取新鲜牛颈韧带，用丙酮浸泡24小时，进行初步脱脂，挥干，并切成约5mm×5mm×5mm规则粒状；用0.5mol/L草酸溶液沸腾降解弹性蛋白30分钟，进一步脱除脂肪及其他类型蛋白质；用蒸馏水洗净表面油脂及其他类型蛋白质。
(2)用1.0mol/L草酸溶液沸腾降解步骤(1)得到的弹性蛋白3.5小时至全部降解，得到水解弹性蛋白。
(3)使用NaOH浓溶液调节(2)制得的溶液pH值至中性。
(4)将(3)所得的溶液进行透析，冻干，得到弹性蛋白酸降解产物，备用。
(5)称取(4)制备的α-弹性蛋白粉末后加入蒸馏水磁力搅拌30min使其完全悬浮于水中，浓度为100mg/mL。
(6)将质量比为0.5％京尼平溶液加入(5)制得的悬浮液中于20℃下交联12h，于37℃下定形10h，后用蒸馏水清洗表面未反应的京尼平小分子至清洗完全。制得弹性蛋白水凝胶。
实施例4
(1)取新鲜牛颈韧带，用丙酮浸泡24小时，进行初步脱脂，挥干，并切成约5mm×5mm×5mm规则粒状；用0.6mol/L草酸溶液沸腾降解弹性蛋白30分钟，进一步脱除脂肪及其他类型蛋白质；用蒸馏水洗净表面油脂及其他类型蛋白质。
(2)用1.2mol/L草酸溶液沸腾降解步骤(1)得到的弹性蛋白3小时至全部降解，得到水解弹性蛋白。
(3)使用NaOH浓溶液调节(2)制得的溶液pH值至中性。
(4)将(3)所得的溶液进行透析，冻干，得到弹性蛋白酸降解产物，备用。
(5)称取(4)制备的α-弹性蛋白粉末后加入蒸馏水磁力搅拌30min使其完全悬浮于水中，浓度为150mg/mL。
(6)将质量比为5％京尼平溶液加入(5)制得的悬浮液中于10℃下交联20h，于37℃下定形15h，后用蒸馏水清洗表面未反应的京尼平小分子至清洗完全。制得弹性蛋白水凝胶。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (1)
1.京尼平交联弹性蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，将α-弹性蛋白粉末加入蒸馏水磁力搅拌下使其完全悬浮于水中；其中α-弹性蛋白溶液浓度为50-200mg/mL，搅拌时间为30min，所述α-弹性蛋白购于sigma，数均分子量为70—72KD；
步骤2，将质量分数为1％的京尼平水溶液加入步骤1制得的悬浮液中进行交联反应并定形，定形后用蒸馏水清洗表面未反应的京尼平小分子至清洗完全，制得弹性蛋白水凝胶；其中京尼平与弹性蛋白质量比为0.5-1％；交联反应温度为10-20℃，时间为12-24h；定形温度为37℃，时间为2-5h；所述α-弹性蛋白按照如下步骤进行制备：
(1)用草酸溶液煮沸降解弹性蛋白，脱除脂肪及其他类型蛋白质；
(2)用草酸溶液煮沸降解(1)制得的弹性蛋白至全部降解，得到水解弹性蛋白；
(3)使用氢氧化钠溶液调节(2)所得的溶液pH值，收集沉淀；
(4)清洗(3)收集的沉淀，冻干，得到纯净α-弹性蛋白，备用；
在上述弹性蛋白的制备过程中，步骤(1)中，牛颈韧带经丙酮浸泡进行初步脱脂，浸泡时间为24h，并切成5mm×5mm×5mm规则粒状得到；所述的草酸溶液浓度为0.3-0.7mol/L，降解时间为30-60min；用蒸馏水洗净表面油脂及其他类型蛋白质；
所述步骤(2)所用草酸溶液浓度为1-2mol/L，降解时间为4-6h；
所述步骤(3)所用氢氧化钠溶液浓度为1-6mol/L，调节pH值到4-5，弹性蛋白凝聚形成沉淀；
所述步骤(4)沉淀采用大量蒸馏水除去小分子物质；冻干时间为24h；冻干后弹性蛋白研磨成细粉状。
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