JP6328861B2

JP6328861B2 - コラーゲンスポンジ

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Publication number: JP6328861B2
Application number: JP2017549842A
Authority: JP
Inventors: コルネル・イムホーフ; ローター・シュレッサー; ニクラウス・シュティーフェル; マルティン・ヴュエスト
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Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2018-05-23
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Description

本発明は、口腔領域における軟組織欠損充填（soft tissue volume augmentation）を促進するための新たな弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ、その弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジを調製する方法、および軟組織欠陥充填のための口腔における移植組織としてのその使用、に関する。

軟組織欠損充填は、歯科およびクラニオマキシロフェイシャル（cranio−maxillofacial）外科における大きな挑戦のうちの1つになっている。軟組織欠陥充填による機能的および審美的な両方の成果を改善するために、遊離歯肉移植術（FGG）または上皮下結合組織移植術（SCTG）のような自原性組織移植組織片がそれらの欠陥にもかかわらずに種々の指標にいまだ広く使用されており、優秀な模範（gold standard）と考えられている（F. Cairoら，2008，J. Clin. Periodontol. 35 （補遺8），314〜319; R. Jungら，2004，Int. J. Periodontics Restorative Dent. 24（6），545〜553およびD. Thoma，2009，Clin. Oral Implants Res. 20 （補遺4），146〜165）。しかしながら、通常は口蓋における第2の手術部位での自己の組織の収集手順は、患者に対して欠点を有しており、回収することができる組織の質および量に制限がある。

したがって、口腔領域における軟組織欠陥充填を促進する再生デバイスが望ましい。

口腔結合組織の歯肉細胞は、咀嚼、飲み込み、舌の運動、スピーチ、歯の運動および矯正処置の間に複雑な機械力に曝される。特に、外科手術後の創傷治癒の間に、内部および外部的な力が生じる場合があり、再生デバイスおよび新たに形成した組織に対して圧力を発生する。

再生デバイスは、軟組織欠陥充填のために口腔内で使用する前に特定の基準を満たしていなければならない：それは生体適合性で、イン・ビボ（in vivo）で吸収性であって、歯肉を内殖させ、平穏無事な治癒（過剰な炎症または離開なし）を許容するような良好なレベルの組織融合を示し、移植後の創傷治癒過程の間の十分な時間、一般的に少なくとも約3ヶ月の間、に組織体積を維持するスキャホールドとして作用することによって機械力に耐えることができる。

かかる再生デバイスは先行技術においていままで開示されていない。

H. Mathesらは、“A Bioreactor Test System to mimic the Biological and Mechanical Environment of Oral Soft Tissues and to Evaluate Substitutes for Connective Tissue Gafts”，2010，Biotechnology and Bioengineering，Vol. 107，No. 6，pages 1029-39の中で、コラーゲンスポンジからなる再生デバイスの係る特性は、機械的安定性（高度の架橋）と平穏無事な軟組織の治癒（低度の架橋）との正しいバランスを許容する程度にコラーゲン繊維を架橋することによりマトリクスボディーを硬化することによって達成してもよいと開示しているが、かかるコラーゲンスポンジをどの様にして調製するかについては全体的に開示していない。彼らは、92μmの平均細孔径および93%の気孔率を有し、架橋度が異なるI型およびIII型ブタコラーゲンからなる3の異なるコラーゲンスポンジ原型（Geistlich Pharma，ヴォルフーゼン，スイス国によって提供された原型）が、14日間の培養（culture）後に良好な線維芽細胞の活力とともに満足ゆく体積保持を示したことを開示している。

DS Thomaらは、“Soft tissue volume augmentation by the use of collagen−based matrixes：a volumetric analysis”，2010，J. of Clin. Periodontology 37，659〜666および“Soft tissue volume augmentation by the use of collagen−based matrixes in a dog mandible−a histological analysis”，2011，J. Clin. Periodontol.：38：1063〜1070の中で、H. Mathesらの上記刊行物に言及されているコラーゲンスポンジ原型のうちの1を開示し、これがイヌ下顎骨の慢性堤欠陥への実施後28日または84日に優秀な模範SCTG（内皮下（subendopithelial）結合組織移植）と同じ体積保持を示したことを開示している。
B．Hafemannらは、"Journal of Materials Science: Materials in Medecine, 12 (2001)437-446"の中で、ブタ期限の加工した天然コラーゲンおよびエラスチンからなる異種メンブレンの酵素分解に対する耐性を増大するためにN−ヒドロキシスクシンイミドと一緒にカルボジイミド 1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（EDC）を使用することは、neo−dermisを形成するためのテンプレートとして供することを意味すると開示している。

先行技術は、かかる化学架橋コラーゲンスポンジ原型、または軟組織欠陥充填のために口腔において使用するための前記した基準を満たすいずれか他の再生コラーゲンデバイスの特徴が何であるか、またはかかるデバイスをどのようにして調製することができるかを開示または示唆していない。

EP−1561480は、髄膜組織を増殖する硬膜代替物として使用するための吸収性コラーゲンデバイスを開示し、それには大部分が10μm未満の細孔を有する化学架橋コラーゲンシートが含まれ、およびコラーゲンと水とを混合物が実質的に可溶化したコラーゲンを含むような条件下で水と混合し、その混合物をコラーゲンデバイスに凍結乾燥し、架橋剤としてホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いて、そのコラーゲンデバイスを化学架橋する工程を含むそのコラーゲンデバイスを調製する方法を開示している。硬膜代替物は、口腔領域における軟組織欠陥充填を促進する再生デバイスのように、上記した複合機械力によって生じる圧力に創傷治癒の間に曝されない。

US−2004−0265785は、少なくとも20%（w/w）のエラスチンを含むコラーゲン−エラスチンメンブレンを製造する方法を記載し、その方法には、天然起源のコラーゲン材料を含有するエラスチンからの疎水性随伴物質を最初に化学的に除去し、ついで、非−疎水性物質を化学的に除去することが含まれる。そのコラーゲン−エラスチン生成物は、化学架橋されていない。

Boekema B.K.L.H.ら，2014，Journal of Material Sciences：Materials in Medicine，February 2014 25：423−433は、皮膚代替物として用いるコラーゲン−エラスチン・スキャフォールドのポアサイズおよび架橋の創傷治癒に対する効果を記載している。開示されているEDC−NHS化学架橋スキャフォールドは、10〜15%のエラスチンを含み、80〜120μmのポアサイズおよび64〜69℃の変性温度を有する（Table 1，425頁ご参照）。それらはエチレンオキシドガス処理によって滅菌されている。著者は、架橋は幾つかの重要なパラメータで、特に増殖して皮膚代替物が新しい組織で置き換わる繊維芽細胞の能力を低下することによって、創傷治癒に対してマイナスに影響すると結論付けている。皮膚代替物は、口腔領域における軟組織欠陥充填を促進する再生デバイスのように、創傷治癒の間、上記した複合的な機械力によって生じる圧力に曝されない。

本発明の課題または目的は、生体適合性で、イン・ビボ（in vivo）で吸収性で、歯肉を内殖させ、平穏無事な治癒（過剰な炎症または離開なし）を許容し、移植後の創傷治癒過程の間の十分な時間、一般的に少なくとも約3ヶ月間、組織体積を維持するスキャホールドとして作用することによって機械力に耐えることができるような良好なレベルの組織融合を示す、口腔領域における軟組織欠陥充填を促進するための再生コラーゲンデバイスを見出すことにある。

上記の課題を、添付する特許請求の範囲に規定する発明によって解決する。

本発明は、口腔領域における軟組織欠陥充填を促進する弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジに関し、それは60〜96%（w/w）のコラーゲンおよび4〜40%（w/w）のエラスチンを含み、水銀圧入ポロシメトリーによって、10μmを超える細孔径で50〜90μmのメジアン細孔径および少なくとも80%の気孔率、45〜57℃の開始温度および50〜65mg/cm³の乾燥状態における密度を有する相互連結孔を示す。

化学架橋コラーゲンスポンジには、60〜96%（w/w）のコラーゲンおよび4〜40%（w/w）のエラスチンが含まれる。エラスチン含量は、加水分解およびRP−HPLCを含む公知の方法の変形による（例えば、Guida E.ら，1990，Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosins in tissue in Journal of ChromatographyまたはRodriguqe P，2008，Quantification of Mouse Lung elastin During Prenatal Development in The Open Respiratory Medicine Journalを参照されたい）デスモシン/イソデスモシン判定によって測定する。乾燥エラスチンのデスモシン/イソデスモシン含量を決定するためには、スポンジのエラスチンを、StarcherおよびGalione，1976，Purification and Comparison of Elastin from Different Animal Species in Analytical Biochemistryによって記載されているエラスチン単離手順に付す。

そのスポンジは好適にはかかる比率のコラーゲンおよびエラスチンを含む天然起源の組織由来である。かかる組織の例には、哺乳動物（例えば、ブタまたはウシ）の腹膜または心膜、胎盤膜、小腸粘膜下組織（SIS）および真皮が含まれる。通常、コラーゲンは優勢にはI型コラーゲン、III型コラーゲンまたはそれらの混合物である。コラーゲンは、特にII型、IV型、VI型またはVIII型コラーゲンまたはこれらもしくはいずれかの型のコラーゲンのいずれかの組合せの比率を含んでいてもよい。

本願において用いる“コラーゲン”なる用語は、通常、60〜96%（w/w）のコラーゲンおよび4〜40%（w/w）のエラスチンの組合せをいう。

好ましくは、化学架橋コラーゲンスポンジには、70〜90%（w/w）のコラーゲンおよび10〜30%（w/w）のエラスチンが含まれる。

かかる化学架橋コラーゲンスポンジを調製するための好適な出発物質の例は、EP−B1−1676592の“Example”に記載のものに類似した方法によってブタまたはウシの腹膜から調製したメンブレンからのまたは非常に類似した方法によってブタ腹膜から調製したメンブレンGeistlich Bio−Gide（登録商標）（Geistlich Pharma A.G.，スイス国から入手可能）からのコラーゲン繊維のスラリーおよび/またはWO 2012/084214のExample 7に記載の方法と同様の方法によってブタ真皮から調製したコラーゲン繊維のスラリーである。

上記の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジは、機械的応力を負荷および非負荷の後で体積を維持しつつ歯肉細胞の内殖を育成することによって口腔領域における軟組織充填を促進する。

歯肉細胞の内殖を育成するためには、化学架橋コラーゲンスポンジは、歯肉線維芽細胞が増殖するために適当な直径の範囲の高い気孔率（細孔体積画分）を有しなければならない。スポンジが、水銀圧入ポロシメトリーによって、10μmを超える細孔径で50〜90μmのメジアン細孔径および少なくとも80%の気孔率、好ましくは少なくとも90%の気孔率を有する相互連結孔を示す場合にこの内殖が好適に増殖することを見出した。かかる細孔の分布を有する化学架橋スポンジは、先の段落に記載したようにブタまたはウシの腹膜から調製したメンブレンからのコラーゲン繊維のスラリーを適当な比率で架橋前に混合することを含む方法によって好適に調製する。

本明細書中の“弾力のある”なる用語は、化学架橋コラーゲンスポンジが圧力に対して耐性であること、すなわちイン・ビトロ（in vitro）またはイン・ビボ（in vivo）で圧力に付した後にその元の体積の大部分を回復することができることを意味する。

口腔領域における体積を維持するために、弾力のある吸収性の化学架橋スポンジは、移植後の治癒過程の間の十分な時間、一般的に約3ヶ月、組織体積を維持するスキャフォールドとして作用することによって、咀嚼、舌の運動、スピーチおよび歯の運動によって誘導される複合機械力に耐えることができなければならない。移植組織のこのイン・ビボ（in vivo）での弾力のある挙動が、体液を模倣して設計したリン酸緩衝液塩類（PBS）溶液に湿らせたコラーゲンスポンジの37℃の温度での圧縮繰り返しのイン・ビトロ（in vitro）機械試験において、12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後に、初期厚さに対する厚さ保持が少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、または最初の負荷に対するヒステリシス保持が55%未満、好ましくは45%未満である場合に達成されることを見い出した。

過剰な炎症または離開なしのイン・ビボ（in vivo）の治癒と結合した、少なくとも70%の上記のイン・ビトロ（in vitro）での厚さ保持および55%未満のヒステリシス保持が、スポンジが45〜57℃の開始温度および50〜65mg/cm³の乾燥状態における密度を示す場合に達成されることを見出した。

開始温度は、US Pharmacopia standard： Ph. Eur. 2.2.34，USP <891>に従って緩衝液で湿らせたコラーゲンスポンジに対してDSCによって測定する（緩衝液組成水1リットルに対して：8gの塩化ナトリウム、0.2gのリン酸カリウム、1.15gのリン酸ナトリウムおよび0.2gの塩化カリウム；出発温度15℃、終了温度90℃、加温速度5℃/min）。このパラメータは、スポンジの架橋度を反映する。開始温度は、圧縮繰り返しに対するスポンジのイン・ビトロ（in vitro）耐性（圧縮繰り返しの機械試験における厚さ保持またはヒステリシス保持）、イン・ビボ(in vivo)弾力性（移植後の治癒過程の間の十分な時間の組織体積の維持）および周囲の組織への良好な融合（過剰な炎症または離開なし）に極めて相関している。

過剰な炎症または離開なしのイン・ビボ（in vivo）治癒と組み合わさった必要な圧縮繰り返しに対するイン・ビトロ（in vitro）耐性およびイン・ビボ（in vivo）弾力性は、開始温度が45〜57℃、好ましくは46〜53℃である場合に達成することができる。開始温度が46℃未満である場合、圧縮繰り返しに対するイン・ビトロ（in vitro）耐性およびイン・ビボ（in vivo）弾力性が十分とならない場合がある。開始温度が57℃を超える場合、移植後に顕れる過剰な炎症および/または離開のような有害な事象の実質的リスクが存在する。

過度の凍結乾燥後のコラーゲンスポンジの重量測定および体積測定によって測定した乾燥状態における密度（以下に詳細に記載する）は、過剰な炎症または離開なしのイン・ビボ（in vivo）治癒と組合せて、必要な圧縮繰り返しに対するイン・ビトロ（in vitro）耐性およびイン・ビボ（in vivo）弾力性を達成するためのもう1つの必須または極めて重要なパラメータである。乾燥状態における密度が50〜65mg/cm³、好ましくは50〜60mg/cm³である場合にこれらの特徴を達成することができる。乾燥状態における密度が50mg/cm³未満である場合、圧縮繰り返しに対するイン・ビトロ（in vitro）耐性およびイン・ビボ（in vivo）弾力性が十分にならない場合がある。乾燥状態における密度が65mg/cm³を超える場合、移植後に顕れる過剰な炎症および/または離開のような有害な事象のリスクが存在する。

本明細書中の“吸収性”なる用語は、化学架橋コラーゲンスポンジが、特にコラゲナーゼおよびエラスターゼの作用によりイン・ビボ（in vivo）で吸収されることができることを意味する。化学架橋コラーゲンスポンジの制御されたイン・ビボ（in vivo）吸収性は、過剰な炎症または離開なしの治癒に必須である。以下に詳細に記載するClostridium histolicumからのコラゲナーゼを用いた酵素分解試験は、イン・ビボ（in vivo）吸収性の最良の予想を提供する。

その試験においては、本発明に係る無菌の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジのすべての試料について、過剰な炎症または離開のような有害が出現することなく興味深い体積の保持および治癒がイン・ビボ（in vivo）で示され、コラーゲンは3〜5時間で完全に分解した。

上記の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジは、凍結乾燥および化学架橋を含む方法によって、天然起源の組織から好適に調製する。天然起源の適当な組織には、ブタまたはウシの腹膜または心膜、ブタまたはウシの胎盤膜、およびブタまたはウシのSISまたは真皮が含まれる。好ましくは、天然起源の組織には、ブタまたはウシの腹膜およびブタの真皮が含まれる。凍結乾燥および化学架橋を含む上記の方法は、一般的に、好適にはγ照射またはX−線の滅菌である滅菌工程に続く。

化学架橋は、弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジに、圧縮繰り返し試験における最初の負荷に対して初期厚さに関する必要な厚さ保持またはヒステリシス保持を提供することができるいずれの医薬上許容し得る架橋剤を用いて行ってもよい。好適なかかる架橋剤には、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、1,4−ブタンジグリシジルエーテル（BDDGE）、N−スルホスクシンイミジル−6−（4’−アジド−2’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、ヘキサメチレンジイソシアネート（HMDC）、シアナミド、ジフェニルホスホリルアジド、ゲニピン、EDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）ならびにEDCおよびNHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物が含まれる。少量または微量の未反応の架橋剤またはその典型的な直接の反応生成物は、通常、弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ中に検出することができる。

好ましくは、化学架橋は、グルタルアルデヒド、EDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）ならびにEDCおよびNHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物から選択される架橋剤を用いて行う。本発明に係る弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの興味深い原型は、実際にこれらの架橋剤の各々を用いて調製されている。

架橋剤としてEDCまたはEDCおよびNHSの混合物を用いて1000を超える異なるコラーゲンスポンジの原型が調製され、種々のイン・ビトロ（in vitro）試験および/またはイン・ビボ（in vivo）動物試験、特にマウス、ラット、ウサギおよびイヌで試験した。好ましくは、化学架橋はこれらの2の架橋剤のうちの1を用いて行う。

本発明の弾力のある吸収性のコラーゲンスポンジは、特に：
−優秀な模範SCTG（上皮下結合組織移植）と比較した、イヌの下顎骨の慢性欠陥への移植による粘膜体積獲得の測定を含む動物実験、および
−軟組織欠損充填SCTG（上皮下結合組織移植）の優秀な模範と比較した、口腔における歯科移植組織周囲の粘膜の厚さを獲得するための組織充填手順におけるその性能および安全性を調べるための臨床実験
において試験した。

これらの実験の両方において、本発明の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジは、3−ヶ月−移植の後に、過剰な炎症または離開なしに周囲組織への最良の融合、SCTGと同じ安全性および同じ（すなわち、統計学上異ならない）軟組織体積保持を示した。

上記の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジは、以下の工程を含む方法によって調製してもよい：
（ａ）ブタまたはウシの腹膜または心膜を、12を超えるpHの水酸化ナトリウム溶液の塩基処理、pH 1〜3の塩化水素溶液の酸処理、水溶性有機溶媒での脱水処理および有機溶媒での脱脂処理に付し、
得た乾燥メンブレンを切削ミルで粉砕し、0.5〜2mmシーブを通して篩いにかけ、得られた粉体をpH 2.5〜3.5の酸性化水溶液に懸濁してコラーゲン繊維のスラリーを得、
（ｂ）砕いたウシまたはブタの真皮を、水溶性有機溶媒を用いた脱水処理に付し、有機溶媒を用いて脱脂処理し、12を超えるpHの強無機塩基中で塩基処理し、pH 0〜1の強無機酸中で酸処理し、水で濯いでコラーゲン繊維を懸濁し、凍結乾燥し、乾燥したコラーゲン繊維を有機溶媒で清浄化し、清浄化した乾燥繊維をpH 3〜4の酸性化した溶液中で砕いてコラーゲン繊維のスラリーを得、
（ｃ）（ａ）で得たコラーゲン繊維のスラリー3.5〜4.5部を（ｂ）で得たコラーゲン繊維のスラリー0.5〜1.5部と混合して生じるスラリーを得、
（ｄ）（ｃ）で得たスラリーを凍結乾燥し、架橋剤を含む溶液中で凍結乾燥生成物を架橋し、水で洗浄して凍結乾燥し、ついで
（ｅ）所望により、（ｄ）で得た凍結乾燥生成物をγ照射またはX−線照射によって滅菌する。

工程（ａ）は、EP−B1−1676592の“Example”に記載された方法と同様に行ってもよい。若年の子ウシまたは若年のブタからの腹膜を水で洗浄し、2%の水酸化ナトリウム溶液で塩基処理し、水で洗浄し、0.5%の塩化水素溶液中で酸処理し、pH 3.5が得られるまで水で洗浄し、7%塩類溶液で材料を収縮し、水で洗浄し、アセトンで脱水し、n−ヘキサンで脱脂し、得られた乾燥メンブレンを切削ミルで粉砕し、0.5〜2mmシーブを通して篩いにかけ、ついで得られた粉体をpH 2.5〜3.5の酸性化水溶液に懸濁して、ブタまたはウシの腹膜コラーゲン繊維のスラリーを得る。

工程（ａ）は、都合よくは、滅菌メンブレンGeistlich Bio−Gide（登録商標）（Geistlich Pharma A.G.社，スイス国から入手可能）を切削ミルで粉砕し、0.5〜2mmシーブを通して篩いにかけ、ついで得られた粉体をpH 2.5〜3.5の酸性化水溶液に懸濁して、ブタ腹膜コラーゲン繊維のスラリー得ることによって行う。

好ましくは、切削ミルを用いて粉砕した後に得られる粉体は、0.5〜1mmシーブを通して篩いにかける。

工程（ｂ）は、WO 2012/084214のExample 7に開示された方法と同様に行ってもよい。すなわち、砕いたブタ皮を、アルコールまたはケトンのような水溶性有機溶媒での脱水処理、ジクロロエタンまたは塩化メチレンのような有機溶媒での脱脂処理、6〜24時間のpH 12を超える強無機塩基中の塩基処理、1〜12時間のpH 0〜1の強無機酸中の酸処理、水で濯いで膨潤調整剤（swelling regulator）存在下でのコラーゲン繊維の懸濁、凍結乾燥、アルコール、エーテル、ケトンおよび塩化炭化水素のような異なる溶媒での乾燥したコラーゲン繊維の清浄化、およびpH 3〜4の酸性化した溶液中での清浄化した乾燥繊維のコロイドミル中での粉砕に付して、ブタ皮膚コラーゲン繊維を得る。

工程（ａ）で調製したコラーゲン繊維のスラリー中の（w/w）%コラーゲンおよび工程（ｂ）で調整したコラーゲン繊維のスラリー中の（w/w）%コラーゲンは、弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの乾燥状態の密度の設定に役割を果たしている。実際、後者は、一面において（ａ）で得られたコラーゲン繊維の得られたスラリー1.5〜4.5部と（ｂ）で得られたコラーゲン繊維の得られたスラリー0.5〜1.5部とを混合することによって工程（ｃ）で得たコラーゲン繊維の得られるスラリーの（w/w）%コラーゲンに主に依存し、他方の面において工程（ｄ）における架橋反応の条件に主に依存する。

弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジを達成するために、乾燥状態における必要な密度は50〜65mg/cm³であり、工程（ａ）で調製したコラーゲン繊維のスラリーには一般的に2.0〜4.5（w/w）%、好ましくは2.5〜3.75（w/w）%のコラーゲンが含まれ、および工程（ｂ）で調製したコラーゲン繊維のスラリーには一般的に3.0〜7.0（w/w）%、好ましくは4.0〜6.0（w/w）%のコラーゲンが含まれる。

程（ｃ）には、（ａ）で得たコラーゲン繊維のスラリー3.5〜4.5重量部と工程（ｂ）で得たコラーゲン繊維のスラリー0.5〜1.5重量部とを混合して得られたスラリーを得ることが含まれる。

異なるブタまたはウシの組織から生じ、異なるサイズのコラーゲン繊維粒子を与える異なる粉砕工程（工程（ａ）に切削ミルを用い、工程（ｂ）にコロイドミルを用いる）を含む異なる処理に付したコラーゲン繊維の2の異なるスラリーの適当な比率の混合工程は、弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの望ましい多孔率分布およびスペクトル、すなわち水銀圧入ポロシメトリーによって測定して10μmを超える細孔径で50〜90μmのメジアン細孔径および少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の気孔率を有する相互連結孔、を達成するのに都合良い方法である。

得られたスラリーには、一般的に、3.0〜6.5（w/w）%、好ましくは3.5〜6.0（w/w）%のコラーゲンが含まれる。

工程（ｄ）には、（ｃ）で得た得られたスラリーを凍結乾燥し、架橋剤を含む溶液中で凍結乾燥生成物を架橋し、水で洗浄し、凍結乾燥することが含まれる。

架橋工程の前後の凍結乾燥は、一般的に−10℃未満の温度で行う。

架橋剤は、好適には、グルタルアルデヒド、EDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）ならびにEDCおよびNHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物よりなる群から好適に選択される。ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、1,4−ブタンジグリシジルエーテル（BDDGE）、N−スルホスクシンイミジル−6−（4’−アジド−2’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、ヘキサメチレンジイソシアネート（HMDC）、シアナミド、ジフェニルホスホリルアジドまたはゲニピンのようなコラーゲンを架橋することが知られている他の架橋剤を用いてもよい。

架橋剤がグルタルアルデヒドである場合、凍結乾燥後に得られたスポンジは、0.01〜0.10%、好ましくは0.04〜0.06%のグルタルアルデヒドを含むpH 7.0〜7.5のリン酸緩衝液中で化学架橋する。化学架橋スポンジは、凍結乾燥する前に、水、1〜3MのNaCl溶液、0.05〜0.15MのNa₂HPO₄溶液および水で順次洗浄してもよい。

架橋剤がEDCである場合、凍結乾燥後に得られたスポンジは、110℃を超える温度で脱水素熱性処理に最初に付し、ついで0.05〜0.15MのMES（2−（N−モルホリノ）−エタンスルホン酸）または0.05〜0.15Mの酢酸および2〜20%（w/w）のメタノール、エタノール、n−プロパノール，イソプロパノールおよびブタノールよりなる群から選択されるアルコールを含む緩衝液中、コラーゲン1g当たり0.03〜0.80g、好ましくは0.2〜0.4gのEDCで1〜8時間化学架橋する。反応媒体（上記緩衝液）に対するコラーゲンの（w/w）比は、一般的に、1/10〜1/100、好ましくは1/20〜1/50である。アルコールがエタノールである場合、緩衝液中に3〜7%（w/w）で好ましくは存在する。化学架橋コラーゲンスポンジは、0.05〜0.15MのNa₂HPO₄溶液、0.5〜3MのNaCl溶液で最初に洗浄し、ついで凍結乾燥する前に水で洗浄してもよい。

架橋剤がEDCおよびNHSの混合物である場合、凍結乾燥後に得られたスポンジは、好適には、0.1〜0.3MのMES（2−（N−モルホリノ）−エタンスルホン酸）または0.1〜0.3Mの酢酸およびメタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールよりなる群から選択される10〜70%（w/w）のアルコールを含む緩衝液中、コラーゲン1g当たり0.01〜0.60、好ましくは0.05〜0.2gのEDCおよび0.01〜0.6、好ましくは0.05〜0.2gのNHSで1〜8時間化学架橋する。NHSに対するEDCのモル比は、一般的に4〜0.5、好ましくは2〜1である。反応媒体（上記の緩衝液）に対するコラーゲンの（w/w）比は、一般的に、1/10〜1/100、好ましくは1/20〜1/50である。アルコールがエタノールである場合、それは緩衝液中に40〜60%（w/w）で好適に存在する。化学架橋コラーゲンスポンジは、0.05〜0.15MのNa₂HPO₄溶液で最初に洗浄し、ついで凍結乾燥前に水で洗浄してもよい。

（c）で得たコラーゲン繊維のスラリーの各混合物については、当業者であれば本願の教示に基づき、当該技術分野の共通の一般的知識およびルーチンの実験のみを用いて架橋剤および架橋条件を見出し、特定の開始温度および乾燥状態における密度を有する本発明の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジを得る立場にある。

したがって、例えば以下のことが3.0〜6.5（w/w）%のコラーゲンを含むコラーゲンスラリーのルーチンな実験によって見出されている：
−架橋剤がEDCである場合：
−開始温度は、緩衝液中のEDCの濃度、コラーゲンに対するEDCの比、コラーゲンに対する反応媒体の（w/w）比または緩衝液中のアルコールの%の上昇につれて、増大する。
−乾燥状態における密度は、緩衝液中のアルコールの%の上昇につれて、低下する（コラーゲンがより収縮する）。

−架橋剤がEDCおよびNHSの混合物である場合：
−開始温度は、緩衝液中の架橋剤の濃度、コラーゲンに対する架橋剤（EDC+NHS）の（w/w）比、NHSに対するEDCの比、コラーゲンに対する反応媒体の（w/w）比または緩衝液中のアルコールの%の上昇につれて、増大する。
−乾燥状態における密度は、緩衝液中のアルコールの%の上昇につれて、低下する（コラーゲンがより収縮する）。

工程（d）の終了時に得た凍結乾燥した弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジは、一般的にγ照射またはX−線照射による滅菌の工程（ｅ）に付す。この工程は、工程（ｃ）で得たコラーゲンスラリーの混合物がすでに無菌であって工程（ｄ）を無菌条件で行う場合は、必ずしも必要でない。

以下に詳細に記載するClostridium histolyticumからのコラゲナーゼを用いたイン・ビトロ(in vitro)圧縮繰り返し試験および酵素分解試験は、口腔への移植後の化学架橋スポンジのイン・ビボ(in vivo)挙動、特に体積を維持しおよび過剰な炎症または離開のような有害な事象なしに治癒するその能力、を予想するのに非常に有用である。

本発明は、弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジを調製する上記の方法にも関する。

本発明は、口腔用の移植組織として使用する上記の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ、口腔用の移植組織を調製するためのその弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの使用および上記の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジを口腔に移植することを含む、特に機械応力下で体積を維持しながら歯肉組織の内殖を育成することによって、口腔領域における軟組織欠損を補填する方法にも関する。

以下の実験方法、試験および実施例は、本発明をその範囲を制限することなく説明する。

乾燥状態の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの密度を測定する試験

20℃の温度および0.5 mbar未満の圧力にて少なくとも2時間フリーズドライヤー中で乾燥した弾力のある吸収性化学架橋コラーゲンスポンジ試料を秤量したプラスチック管に導入した。乾燥した試料を含むその管を秤量し、乾燥条第の試料の正味重量を計算した。弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ試料の長さ、幅および高さは、試料が緩く固定される（すなわち、その重量によって生じる力に抵抗するが、力が約10−倍に増大した場合は動くように固定する）ように十分な接触圧力を適用することによって、電気ノギスを用いることによって測定した。乾燥状態における試料の体積を計算した。

ついで、乾燥状態における弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの密度（重量/体積）を各試料について計算した。

圧縮繰り返し試験
12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後の最初の負荷に対する初期厚さの%およびヒステリシスの%は、プログラムTest Expert IIを用いて、機械式圧縮機械、すなわちZwick Roell製のZ2.5材料圧縮機械を用いて測定した。

測定は、pH 7.4のPBS溶液（1000mlの水に80.0gのNaCl、2.0gのKCl、17.7gのNa₂HPO₄および2.4gのKH₂PO₄を溶解し、その溶液を水で10倍に希釈し、HClでpHを7.4に調整することによって調製する）中、37℃にて2時間インキュベートした弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ試料を、無菌状態の37℃のPBS中に沈めて行った。

試料は、1分当たり初期高さの33%のひずみ速度で0.5〜12.1kPaの負荷の合計49サイクルに付し、0.25kPaの前−圧力で分析を開始した。

0.5kPa圧力の初期高さを用いて、49サイクルの負荷および非負荷後の初期高さの保持を計算した。“最初の負荷に対するヒステリシス”とは、式XY：

により最初の負荷の0.5および12.1kPaの間の仕事（NmのW₁，負荷）および49回目の非負荷サイクルからの仕事（NmのW₄₉，非負荷）を用いて非負荷の間に散らした%仕事である。

プログラムTest ExpertまたはExcelが、12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後の初期厚さの保持の%および初期ヒステリシスの保持の%を計算する。

図1は圧縮繰り返し試験の典型的な結果を示す。

興味深い体積保持および過剰な炎症または離開なしの治癒をイン・ビボ(in vivo)で示した本発明に係る弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの試料について：
−初期の高さに対する高さまたは厚さの保持は、12.1kPaへの49サイクルの圧縮後に少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%であり、および
−12.1kPaへの49サイクルの圧縮の後の最初の負荷に対するヒステリシス保持は、55%未満、好ましくは45%未満である。

Clostridium histolyticumからのコラゲナーゼを用いた酵素分解試験
ヒトの身体においては、コラーゲンは、ヒト組織マトリックス−メタロプロテイナーゼ（MMP）、カテプシンおよび推定的に幾つかのセリン・プロテイナーゼによって分解される。最良の実験は、コラゲナーゼ（特にMMP−1、MMP−8、MMP−13およびMMP−18）が直接的なコラーゲン分解の最も重要な酵素であるMMPである（Lauer−Fieldsら，2002 Matrix metalloproteinases and collagen catabolism in Biopolymers−Peptide Science Section and Songら，2006 Matrix metalloproteinase dependent and independent collagen degradation in Frontiers in Bioscience）。

コラーゲン組織およびメンブレンを分解するコラゲナーゼの能力は、基質のフレキシビリティーおよびコラーゲンの型、MMP活性部位およびMMP非活性部位に依存する。コラゲナーゼは三重螺旋コラーゲンと一直線になり、それを解き、つづいてそれを切断する（Songら，2006，上記ご参照）。

異なるコラーゲンの型間の分解の差を克服する観点から、高い触媒速度を有するClostridium histolyticumからのコラゲナーゼを用いてコラーゲンのコラゲナーゼ分解を評価する場合がある（Kadlerら，2007，J Cell SciのCollagen at a glace）。一般的に、天然コラーゲン生成物は、化学架橋コラーゲン生成物よりも迅速に分解する。

本試験においては、コラーゲン生成物（本発明に係る弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの試料）をClostridium histolyticumからの50単位/ml（1単位とは、カルシウムイオン存在下、pH 7.4、37℃にて5時間に、ニンヒドリン色において1.0ミリモルのロイシンに相当するウシアキレス腱からのコラーゲンからペプチドを遊離するとして定義される。）と、カルシウム含有Tris−緩衝液中、37℃にてインキュベートし、コラーゲンマトリクスの分解をI型コラーゲンを参照物質として用いるBio−Rad Laboratories社（Hercules，米国）からの"DC Protein Assay"（注文番号500−0116）を用いて視覚的に測定した。コラーゲン濃度は、マイクロウェルプレート・スペクトロメーター（Infinite M200，Tecanから入手可能）を用いて測定した。

過剰な炎症または離開なしの治癒をイン・ビボ（in vivo）で示した本発明に係る弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジの試料について、コラーゲンは3〜5時間以内で完全に分解した（目視検査によってはコラーゲン繊維は全く認められなかった）。

実施例1 ブタ腹膜由来のコラーゲン繊維のスラリーの調製
若年のブタからの腹膜を、機械手段によって完全に肉および脂を除去し、流水で洗浄し、ついで2%のNaOH溶液で12時間処理した。ついで、メンブレンを流水で洗浄し、0.5%のHClで酸性化した。材料をその厚さ全体を通して酸性化した（約15分）後に、pH 3.5が得られるまで材料を洗浄した。ついで、その材料を7%の塩類溶液で収縮させ、1%のNaHCO₃溶液で中和し、流水で洗浄した。ついで、その材料をアセトンで脱水し、n−ヘキサンで脱脂した。

材料は、エタノールエーテルを用いて乾燥し、0.5〜1.0 mmの台形シーブを含む切削ミルで粉砕した（例えば、FritschからのPulverisette 25：www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette−25またはRetschからのSM300： www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm）。

コラーゲン繊維の4%（w/w）スラリーおよびコラーゲン繊維の6%（w/w）スラリーは、十分な量の乾燥粉体を水に懸濁し、10mMの塩酸でpHを2.6に調整することによって調製した。

実施例2 無菌Geistlich Bio−Gide（登録商標）メンブレン由来のコラーゲン繊維のスラリーの調製
Geistlich Bio−Gide（登録商標）メンブレン（Geistlich Pharma AG，CH−6110，スイス国から入手可能）を乾燥し、0.5〜1.0 mmの台形シーブを含む切削ミルで粉砕する。コラーゲン繊維の4%（w/w）コラーゲンスラリーおよびコラーゲン繊維の6%（w/w）コラーゲンスラリーは、水に十分な量の乾燥粉末を懸濁し、10mMの塩酸でpHを2.6に調整することによって調製した。

実施例3 ブタ真皮由来のコラーゲン繊維のスラリーの調製
ブタ皮をミートグラインダーで1〜20mmのピースに粉砕した。アルコールまたはケトンのような水溶性溶媒を用いて水を除去した。コラーゲン繊維は、ジクロロエタンもしくは塩化メチレンのような塩化炭化水素またはヘキサンもしくはトルエンのような非−塩化炭化水素を用いて脱脂した。溶媒を除去した後に、コラーゲンをpH 12を超える強無機塩基で6〜24時間処理し、pH 0〜1強無機酸で1〜12時間処理した。水で濯ぐことによって過剰量の酸を除去し、懸濁液を無機塩のような膨潤調整剤の存在下でコラーゲン繊維の0.5〜2%の均一な懸濁液までコロイドミルによってホモジナイズした。その懸濁液を凍結乾燥によって乾燥させ、乾燥コラーゲン繊維をアルコール、エーテル、ケトンのような異なる有機溶媒および塩化炭化水素で順次清浄化し、ついで溶媒を減圧下で1%（w/w）未満の溶媒残渣まで蒸発させた。

コラーゲン繊維の2.5%（w/w）コラーゲンスラリーおよびコラーゲン繊維の3.75%（w/w）コラーゲンスラリーは、上記で得た十分な量の清浄化した乾燥繊維をpH 3.4の水とコロイドミルで微粉砕化することによって調製した。

実施例4 EDCを用いた弾力のある吸収性のコラーゲンスポンジ化学架橋の調製
実施例1または実施例2で得たコラーゲン繊維の4%（w/w）コラーゲンスラリー4部を実施例3で得たコラーゲン繊維の2.5%（w/w）コラーゲンスラリー1部と混合し、8 X 25 X 25mmの型に注いだ。得られたコラーゲン繊維の3.7%スラリーを−45℃の凍結乾燥によって乾燥した。ついで、乾燥したコラーゲンスポンジを減圧下（200 mbar未満）、120℃にて24時間、脱水熱処理した。

ついで、コラーゲンスポンジを、0.1MのMES（2−（N−モルホリノ）−エタンスルホン酸）および5%のエタノールを含有する緩衝液、pH 5.5中、室温にて攪拌しつつ、コラーゲン1g当たり0.3gのEDC（1−エチル−3−（3―ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を用いて120分間、化学架橋した。

化学架橋コラーゲンスポンジは、最初に0.10MのNa₂HPO₄溶液、1MのNaCl溶液、2MのNaCl溶液で、ついで水で洗浄し、−45℃にて凍結乾燥した。

乾燥した化学架橋コラーゲンスポンジを、30kGyでγ線滅菌した。

滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジの測定した開始温度および乾燥状態における密度は、各々、47℃および64mg/cm³であった。

PBS中、37℃にて12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後に、滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジは、その初期厚さの87%の保持および初期ヒステリシスの41%の保持を示した。

水銀圧入ポロシメトリーは、10μmを超える細孔径で88μmのメジアン細孔径および95%の気孔率を有する滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジを示した。

Clostridium histolyticumからのコラゲナーゼを用いた酵素分解試験は、3.25時間以内のコラーゲンの完全分解を示した。

実施例5 EDCおよびNHSの混合物を用いて化学架橋した弾力性のある吸収性のコラーゲンスポンジの調製
実施例1または実施例2で得たコラーゲン繊維の6%（w/w）スラリー4部を実施例3で得たコラーゲン繊維の3.75%（w/w）スラリー1部と混合し、高さ6mmの型に注いだ。得られたコラーゲン繊維の5.55%のコラーゲンスラリーを−10℃の凍結乾燥によって乾燥した。

これらのスポンジを、0.2MのMES（2−（N−モルホリノ）−エタンスルホン酸）および50%w/wのエタノールを含む溶液、pH 5.5中、室温にて攪拌しながら、コラーゲン1g当たり0.1gのEDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびコラーゲン1g当たり0.1gのNHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）で120分間、化学架橋した。化学架橋スポンジは、最初に0.1MのNa₂HPO₄ 溶液、1MのNaCl溶液、2MのNaCl溶液、ついで水で洗浄し、−10℃で凍結乾燥した。

乾燥した化学架橋コラーゲンスポンジは、26kGyのγ線−照射によって滅菌した。

滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジの測定した開始温度および乾燥状態における密度は、各々、52℃および59mg/cm³であった。

37℃のPBS中の12.1kPaへの49サイクルの圧縮後に、滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジは初期厚さの90%の保持および最初の負荷に対する38%のヒステリシスを示した。

水銀圧入ポロシメトリーは、滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジについて、10μmを超える細孔径で69.1μmのメジアン細孔径および93.1%の気孔率を示した。

Clostridium histolyticumからのコラゲナーゼを用いた酵素分解試験は、3.5時間以内のコラーゲンの完全分解を示した。

実施例6 EDCおよびNHSの混合物を用いて化学架橋した弾力のある吸収性のコラーゲンスポンジの調製（滅菌工程を含まない）
実施例2で得たコラーゲン繊維の6%（w/w）スラリー4部を実施例3で得たコラーゲン繊維の3.75%（w/w）スラリー1部と混合し、高さ6mmの型に注いだ。得られたコラーゲン繊維の5.55%（w/w）コラーゲンスラリーは、−10℃にて凍結乾燥した。

これらのスポンジを、0.2MのMES（2−（N−モルホリノ）−エタンスルホン酸）および50%w/wのエタノールを含む溶液、pH 5.5中、室温にて攪拌しながら、コラーゲン1g当たり0.01gのEDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびコラーゲン1g当たり0.01gのNHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）で120分間、化学架橋した。化学架橋したスポンジは、最初に0.1MのNa₂HPO₄溶液、1MのNaCl溶液、2MのNaCl溶液で洗浄し、ついで水で洗浄して−10℃で凍結乾燥した。

化学架橋コラーゲンスポンジの測定した開始温度および乾燥状態における密度は、各々、57℃および57mg/cm³であった。

PBS中、37℃にて12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後、化学架橋コラーゲンスポンジはその初期厚さの80%の保持を示した。

水銀圧入ポロシメトリーは、化学架橋コラーゲンスポンジについて、10μmを超える細孔径で71.0μmのメジアン細孔径および94.0%の気孔率を示した。

実施例7 グルタルアルデヒドを用いて化学架橋した弾力のある吸収性のコラーゲンスポンジの調製
実施例1で得たコラーゲン繊維のスラリー4部を実施例3で得たコラーゲン繊維のスラリー1部と混合し、高さ6mmの型に注いだ。そのコラーゲンスラリーを−45℃にて凍結乾燥した。これらのスポンジは、0.05%（w/w）のグルタルアルデヒドを含むリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0〜7.5）中、10℃にて60分間、化学架橋した。その化学架橋コラーゲンスポンジを、水、2MのNaCl溶液および0.1MのNa₂HPO₄溶液で順次洗浄した。最終的に水で濯いだ後に、そのスポンジを−45℃にて凍結乾燥した。

化学架橋したコラーゲンスポンジは、25kGyのγ−照射によって滅菌した。

滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジの測定した開始温度および乾燥状態における密度は、各々、51℃および52mg/cm³であった。

37℃にて12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後、PBS中の滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジはそれらの初期厚さの74%の保持および最初に負荷に対する48%のヒステリシスを示した。

水銀圧入ポロシメトリーは、滅菌した化学架橋コラーゲンスポンジについて、10μmを超える細孔径で63.7μmのメジアン細孔径および92.7%の気孔率を示した。

Clostridium histolyticumからのコラゲナーゼを用いた酵素分解試験は、4.5時間以内のコラーゲンの完全分解を示した。

Claims

60〜96%（w/w）のコラーゲンおよび4〜40%（w/w）のエラスチンを含む口腔領域における軟組織欠陥充填を促進するための弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジであって、水銀圧入ポロシメトリーによって、10μmを超える細孔径で50〜90μmのメジアン細孔径および少なくとも80%の気孔率、45〜57℃の開始温度および乾燥状態における50〜65mg/cm³の密度を有する相互連結孔を示す化学架橋コラーゲンスポンジ。
46〜53℃の開始温度を示す、請求項1に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。
50〜60mg/cm³の乾燥状態における密度を示す、請求項1または2に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。
70〜90%（w/w）のコラーゲンおよび10〜30%（w/w）のエラスチンを含む、請求項1〜3のいずれか１項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋スポンジ。
10μmよりも大きな細孔径で少なくとも90%の気孔率を示す、請求項1〜4のいずれか１項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋スポンジ。
グルタルアルデヒド、EDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）ならびにEDCおよびNHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物よりなる群から選択される架橋剤を用いて得た、請求項1〜5のいずれか１項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋スポンジ。
凍結乾燥および化学架橋、所望により、それにつづくγ滅菌またはX−線滅菌を含む処理によって天然起源の組織から誘導される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の弾力のある吸収性のコラーゲン化学架橋スポンジ。
天然起源の組織が、ブタまたはウシの腹膜または心膜、ブタまたはウシの胎盤膜、またはブタまたはウシのSISまたは真皮を含む、請求項6または7に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。
12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後に初期厚さの少なくとも70%を保持する、PBS溶液によって濡らした、請求項1〜9のいずれか1項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。
12.1kPaの圧力に49サイクル圧縮した後に最初の負荷に対して55%未満のヒステリシスを保持する、PBS溶液によって濡らした、請求項1〜9のいずれか1項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。
口腔領域における移植後に、SCTG（上皮下結合組織移植）と同じ体積保持を示す、請求項1〜9のいずれか1項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。
請求項1〜11のいずれか1項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）ブタまたはウシの腹膜または心膜を、12を超えるpHの水酸化ナトリウム溶液の塩基処理、pH 1〜3の塩化水素溶液の酸処理、水溶性有機溶媒での脱水処理および有機溶媒での脱脂処理に付し、得た乾燥メンブレンを切削ミルで粉砕し、0.5〜2mmシーブを通して篩いにかけ、得られた粉体をpH 2.5〜3.5の酸性化水溶液に懸濁してコラーゲン繊維のスラリーを得、
（ｂ）砕いたウシまたはブタの真皮を、水溶性有機溶媒を用いた脱水処理に付し、有機溶媒を用いて脱脂処理し、12を超えるpHの強無機塩基中で塩基処理し、pH 0〜1の強無機酸中で酸処理し、水で濯いでコラーゲン繊維を懸濁し、凍結乾燥し、乾燥したコラーゲン繊維を有機溶媒で清浄化し、清浄化した乾燥繊維をpH 3〜4の酸性化した溶液中で砕いてコラーゲン繊維のスラリーを得、
（ｃ）（ａ）で得たコラーゲン繊維のスラリー3.5〜4.5部を（ｂ）で得たコラーゲン繊維のスラリー0.5〜1.5部と混合して生じるスラリーを得、
（ｄ）（ｃ）で得たスラリーを凍結乾燥し、架橋剤を含む溶液中で凍結乾燥生成物を架橋し、水で洗浄して凍結乾燥し、ついで
（ｅ）所望により、（ｄ）で得た凍結乾燥生成物をγ照射またはX−線照射によって滅菌する
を含む方法。
架橋剤がグルタルアルデヒド（グルタルアルデヒド）、EDC（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）ならびにEDCおよびNHSの混合物（N−ヒドロキシスクシンイミド）よりなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
工程（a）で調製したコラーゲン繊維のスラリーが2.5〜3.75（w/w）%のコラーゲンを含み、工程（b）で調製したコラーゲン繊維のスラリーが4.0〜6.0（w/w）%のコラーゲンを含む、請求項12または13に記載の方法。
口腔における移植組織として用いるための、請求項1〜11のいずれか１項に記載の弾力のある吸収性の化学架橋コラーゲンスポンジ。